Name: atac-seq assay with low mitochondrial dna contamination from primary human cd4+ t lymphocytes
Uploaded: 2019-03-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes at JoVE.com

Wir danken Atsede Siba für technischen Support. C.S.C wird unterstützt von NIH Grant 1R61DA047032.

Dieses verbesserte Protokoll enthält detaillierte Anweisungen für die Durchführung von ATAC-Seq der CD4 + Lymphozyten, aus dem Ausgangsmaterial von Vollblut durch Datenanalyse (Abbildung 1).
1. Isolierung der CD4 + T-Zellen aus dem Vollblut
Hinweis: Das Ausgangsmaterial für dieses Protokoll ist 15 mL frischem Vollblut mittels standard-Verfahren, so dass die Quelle des Ausgangsmaterials zu selektierenden basiert auf Fo...

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	<li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin,+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position.">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li><li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATAC-seq:+A+Method+for+Assaying+Chromatin+Accessibility+Genome-Wide.">ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 21, 1-29 (2015).</li><li>Song, L., Crawford, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNase-seq:+a+high-resolution+technique+for+mapping+active+gene+regulatory+elements+across+the+genome+from+mammalian+cells.">DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (2), (2010).</li><li>Pajoro, A., Mui&#241;o, J. M., Angenent, G. C., Kaufmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+Nucleosome+Occupancy+by+MNase-seq:+Experimental+Protocol+and+Computational+Analysis.">Profiling Nucleosome Occupancy by MNase-seq: Experimental Protocol and Computational Analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1675, 167-181 (2018).</li><li>Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAIRE+(Formaldehyde-Assisted+Isolation+of+Regulatory+Elements)+isolates+active+regulatory+elements+from+human+chromatin.">FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin.</a> Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).</li><li>Rosenberg, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+profiling+of+the+developing+mouse+brain+and+spinal+cord+with+split-pool+barcoding.">Single-cell profiling of the developing mouse brain and spinal cord with split-pool barcoding.</a> Science. 360 (6385), 176-182 (2018).</li><li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-specific+and+single-cell+chromatin+accessibility+charts+human+hematopoiesis+and+leukemia+evolution.">Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution.</a> Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).</li><li>Lu, Z., Hofmeister, B. T., Vollmers, C., DuBois, R. M., Schmitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+ATAC-seq+with+nuclei+sorting+for+discovery+of+cis-regulatory+regions+in+plant+genomes.">Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes.</a> Nucleic Acids Research. 45 (6), e41 (2017).</li><li>Lara-Astiaso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+state+dynamics+during+blood+formation.">Chromatin state dynamics during blood formation.</a> Science. 345 (6199), 943-949 (2014).</li><li>Gate, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+determinants+of+co-accessible+chromatin+regions+in+activated+T+cells+across+humans.">Genetic determinants of co-accessible chromatin regions in activated T cells across humans.</a> Nature Genetics. , (2018).</li><li>Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+interrogation+of+functional+elements+in+the+noncoding+genome.">High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome.</a> Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).</li><li>. FastQC A Quality Control tool for High Throughput Sequence Data. Babraham Bioinformatics Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc</a> (2018)</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+ATAC-seq+protocol+reduces+background+and+enables+interrogation+of+frozen+tissues.">An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues.</a> Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+accessible+chromatin+in+mammalian+preimplantation+embryos.">The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos.</a> Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).</li></ol>

Das modifizierte ATAC-Seq-Protokoll in diesem Artikel vorgestellten liefert reproduzierbare Ergebnisse mit minimalen mitochondriale DNA-Kontaminationen. Das Protokoll wurde erfolgreich zur Chromatin Architektur des menschlichen primäre PBMCs10, menschlichen Monozyten, dendritische Mauszellen (unveröffentlicht) zu charakterisieren, und kultivierten Melanom Zelle Linien11. Wir erwarten diese verbesserte Lyse Zustand hat das Potenzial, für andere Zelltypen sowie zu arbeiten...

Der Test für Transposase zugänglichen Chromatin Sequenzierung (ATAC-Seq) ist schnell die führende Methode zur Abfrage von Chromatin Architektur geworden. ATAC-Seq erkennen Regionen zugänglich Chromatin durch den Prozess der Tagmentation, die Fragmentierung und tagging von DNA durch das gleiche Enzym, um Bibliotheken zu produzieren, mit denen Sequenzierung Chromatin Erreichbarkeit über eine gesamte Genom ermitteln kann. Dieser Tagmentation Prozess wird durch die hyperaktiven Tn5 Transposase vermittelt nur offene Regionen des Chromatins aufgrund nucleosomic sterische Behinderung schneidet. Wie schneidet, fügt die Tn5 Transposase auch Sequenzierung Adapter, die eine schnelle Bibliotheksbau von PCR und Sequenzierung der nächsten Generation von genomweiten zugänglich Chromatin1,2ermöglichen.
ATAC-Seq geworden ist die bevorzugte Methode zur Bestimmung der Regionen von Chromatin Zugänglichkeit aufgrund der relativ einfachen und schnellen Protokoll, Qualität und Auswahl an Informationen, die aus seiner Ergebnisse und geringe Menge an Ausgangsmaterial benötigt ermittelt werden kann. Im Vergleich zu DNase-Seq3 (die Maßnahmen auch genomweite Chromatin Zugänglichkeit), MNase-Seq-4 (Das Nukleosom Positionen in offenen Genom Regionen bestimmt), und die Formaldehyd-vermittelten Jahrmarkt-Seq5, ATAC-Seq ist schneller, billiger und mehr reproduzierbare1. Es ist auch empfindlicher, arbeiten mit Ausgangsmaterial mit nur 500 Kerne, im Vergleich zu den 50 Millionen Kerne für DNase-Seq3erforderlich. ATAC-Seq hat auch die Möglichkeit, weitere Informationen zur Chromatin Architektur als andere Methoden, einschließlich Regionen Transkription Faktor Bindung, Nukleosom Positionierung und offene Chromatin Regionen1enthalten. Effektive, einzellige ATAC-Seq-Protokolle wurden validiert, Bereitstellung von Informationen über Chromatin Architektur an die einzelligen Ebene6,-7.
ATAC-Seq wurde zur Chromatin Architektur in einem breiten Spektrum von Forschung und Zellen-Typen, einschließlich Pflanzen8, Menschen9und viele andere Organismen zu charakterisieren. Es hat auch bei der Ermittlung der epigenetischen Regulation von Krankheit Staaten7kritisiert. Das am weitesten verbreitete ATAC-Seq-Protokoll enthält jedoch die Hauptbeeinträchtigung von Kontamination Sequenzierung liest aus der mitochondrialen DNA. In einigen Datensätzen kann dieser Verschmutzungsgrad so hoch wie 60 % der Sequenzierung Ergebnisse1. Es gibt eine konzertierte Anstrengung im Bereich dieser kontaminierenden mitochondriale liest zu senken, um für den effizienteren Einsatz von ATAC-Seq7,10,11ermöglichen. Hier präsentieren wir eine verbesserte ATAC-Seq-Protokoll, die die mitochondriale DNA Kontamination auf nur 3 % reduziert, so dass rund 50 % Ermäßigung in Sequenzierung Kosten10. Dies wird ermöglicht durch einen optimierten Prozess der CD4 + Lymphozyten isoliert und Aktivierung und eine verbesserte Lyse Puffer, kritische mitochondriale DNA-Kontamination zu minimieren.
Dieses ModifiedATAC-Seq-Protokoll wurde mit einer breiten Palette von Primärzellen, einschließlich Menschenblut primäre peripheren mononukleären Zellen (PBMCs)10, menschliche primäre Monozyten und Maus dendritischen Zellen (unveröffentlicht) validiert. Es wird auch erfolgreich eingesetzt, Melanom-Zelllinien in einem gruppierten regelmäßig dazwischen kurze palindromische Wiederholungen (CRISPR) Bildschirm des nicht-kodierenden Elemente11zu befragen. Darüber hinaus bietet das Daten-Analyse-Paket in diesem Protokoll beschrieben und auf GitHub neue und erfahrene Forscher mit Werkzeugen zur Analyse ATAC-Seq-Daten. ATAC-Seq ist die effektivste Assay Chromatin Erreichbarkeit über eine gesamte Genom zuordnen, und Änderungen an bestehenden Protokolls, die hier vorgestellt werden erlauben Forschern, qualitativ hochwertige Daten mit niedrigen mitochondriale DNA-Kontaminationen zu produzieren, Sequenzierung Kostenreduzierung und Verbesserung der ATAC-Seq-Durchsatz.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X PBS, Sterile</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5810/5810&#160;R Swing Bucket Refrigerated Centrifuge with 50 mL, 15 mL, and 1.5 mL Tube Buckets</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22625501</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Round Bottom Plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>163320</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 4200 Tape Station System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>374081</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>11131D</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>11346D</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamagnet</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Gemini Bio Products</td>
			<td>100-500</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>50674626</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2393</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute PCR Purification Kit (Buffer PB, Buffer PE, Elution Buffer)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext High Fidelity 2X PCR Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0541</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera DNA Library Preparation Kit (2X TD Buffer, Tn5 Enzyme)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC1211030</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free Sterile dH20</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10977015</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20 (Tween20)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A25780</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Water Bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TSGP02</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit FlouroMeter</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosette Sep Human CD4+ Density Medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>15705</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>15022</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Resevoir</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>8096-11</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermocycler with Heated Lid</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5941</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atac-seq assay with low mitochondrial dna contamination from primary human cd4+ t lymphocytes

ATAC-Seq ist eine weit verbreitete Methode in der Studie der Epigenetik aufgrund seiner schnellen und einfachen Ansatz zur Kartierung genomweite zugänglich Chromatin geworden. In diesem Beitrag präsentieren wir eine verbesserte ATAC-Seq-Protokoll, die reduziert die mitochondriale DNA liest verunreinigen. Während frühere ATAC-Seq-Protokolle mit gekämpft haben liest durchschnittlich 50 % Verunreinigung mitochondrialen DNA, der optimierte Lyse Puffer eingeführt, die in diesem Protokoll mitochondriale DNA-Kontaminationen auf durchschnittlich 3 % reduziert. Diese verbesserte ATAC-Seq-Protokoll ermöglicht eine in der Nähe von 50 % Senkung der Sequenzierung Kosten. Wir zeigen wie diese qualitativ hochwertigen ATAC-Seq-Bibliotheken aus aktivierten CD4 + Lymphozyten, zubereiten können Schritt für Schritt Anleitungen von CD4 +-Lymphozyten isoliert von Vollblut durch Datenanalyse. Dieses verbesserte ATAC-Seq-Protokoll wird in einer Vielzahl von Zelltypen validiert wurde und von unmittelbaren Nutzen für Forscher Chromatin Zugänglichkeit.

Von 15 mL frischem Vollblut erzeugt dieses Protokoll einen Durchschnitt von 1 Million CD4 + T-Zellen. Diese können für eine spätere Bearbeitung eingefroren oder sofort verwendet werden. Lebensfähigkeit der CD4 + T-Zellen, frisch oder aufgetaut, wurde konsequent > 95 %. Diese Methode der CD4 + T Zelle Isolierung sorgt für Flexibilität im Material und Sammlung Quellzeit. Dieses verbesserte ATAC-Seq-Protokoll produziert eine endgültige Bibliothek von mehr als 1 ng/µL für die Sequenz...

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ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine Probe für Transposase zugänglichen Chromatin Sequenzierung (ATAC-Seq) auf aktivierten CD4 + menschlichen Lymphozyten durchführen. Das Protokoll wurde modifiziert, um Kontamination mitochondriale DNA liest von 50 % auf 3 % durch die Einführung eines neuen Lyse-Puffers zu minimieren.

ATAC-Seq-Assay mit niedrigen mitochondriale DNA Kontamination von primären menschlichen CD4 + T-Lymphozyten

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

Dieses modifizierte ATAC-seq-Protokoll führt einen neuen Lysepuffer ein, der die kontaminierenden mitochondrialen Lesevorgänge von 50% auf weniger als 3% verringert. Die verringerte mitochondriale Kontamination wird es Forschern ermöglichen, effizientere ATAC-Seq mit einer 50%igen Senkung der Sequenzierungskosten durchzuführen. Wir haben dieses neue ATAC-seq-Protokoll in menschlichen primären PBMCs, menschlichen primären Monozyten, dendritischen Mauszellen und Melanomzelllinien validiert. Wir glauben, dass es in einer Vielzahl von Zelltypen wirksam sein wird.Die Minimierung des Probenverlusts während des Zellaktivierungs- und Auswahlprozesses ist entscheidend für die Erzielung hochwertiger Ergebnisse mit ATAC-seq. Wir zeigen, wie man mit einer kleinen Anzahl von Zellen aus wertvollen Proben mit grundlegenden Laborgeräten umgeht. Zunächst eine Durchstechflasche mit zuvor isolierten CD4+T-Zellen in einem 37-Grad-Celsius-Wasserbad auftauen, bis das Eis gerade geschmolzen ist.Dann übertragen Sie die Zellen vorsichtig in eine 15-Milliliter konische Röhre mit neun Millilitern vorgewärmter kompletter RPMI. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1, 500 mal G und vier Grad Celsius, für sechs Minuten. Dann entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet vorsichtig in zwei Millilitern kompletten RPMI aus.Nach der Wiederholung der Zentrifugation, entsorgen Sie den Überstand, und setzen Sie die Zellen vorsichtig in 0,5 Milliliter n. Chr. Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Zellen zu zählen. Passen Sie mit vollständigem RPMI die Zellsuspensionsdichte auf Platte 50 000 CD4+Zellen in 200 Mikroliter pro Bohrung einer 96-Well-Rundbodenplatte an.Um dann magnetische Perlen zuzubereiten, aliquot 12,5 Mikroliter Human T-Activator CD3/CD28 Perlen pro ATAC-seq Probe zu einem 1,5 Milliliter Tube. Fügen Sie einen Milliliter 1x PBS in das Rohr, und legen Sie es auf einen Magneten für eine Minute, um die Perlen zu waschen. Entfernen und entsorgen Sie den klaren Überstand vorsichtig, und entfernen Sie das Rohr vom Magneten.Setzen Sie die Perlen in 13 Mikrolitern vollständiger RPMI pro ATAC-seq Probe aus. Um die CD4+T-Zellen mit der eingestellten Konzentration zu aktivieren, sammeln Sie 500.000 Zellen in 2,1 Milliliter komplettem RPMI-Medium in einem 15-Milliliter-Konusrohr. Fügen Sie 12,5 Mikroliter menschliche T-Activator Perlen, vorbereitet und gewaschen in früheren Schritten, und sanft mischen, indem Sie das Rohr.Dann übertragen Sie die Zellen vorsichtig, mit Perlen, auf ein steriles Reservoir. Mit einer Mehrkanalpipette, Platte 200 Mikroliter Zellen mit Perlen pro Brunnen einer runden Boden 96-Well-Platte, und inkubieren in einem 37-Grad-Celsius, 5%CO2-Inkubator für 48 Stunden. Zentrifugieren Sie die Platte nach vollständiger Inkubation acht Minuten lang bei 423 mal G und Raumtemperatur.Entfernen Sie 100 Mikroliter Medium aus jedem Brunnen, und sammeln Sie es in einem konischen Rohr vor dem Entsorgen, um keinen Perlenverlust zu bestätigen. Dann das Zellpellet in den restlichen 100 Mikrolitern Medium wieder aufhängen und alles in einem 1,5-Milliliter-Rohr sammeln. Um CD4+Zellen zu isolieren, fügen Sie 50 Mikroliter vorgewaschener CD4-konjugierter Perlen zu 500. 000 Zellen in einem Milliliter kompletten RPMI hinzu und invertieren, um sie zu mischen.20 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren, während sie alle sechs Minuten zum Mischen von Hand flicken. Legen Sie das Rohr für zwei Minuten auf den Magneten, bis der Überstand klar ist, und entfernen und entsorgen Sie es. Entfernen Sie das Rohr vom Magneten.Waschen Sie die perlengebundenen Zellen, indem Sie sie in einem Milliliter PBS plus 2%FCS wieder aufsetzen, und legen Sie das Rohr für eine Minute wieder auf den Magneten. Verwerfen Sie den klaren Überstand, und wiederholen Sie diesen Vorgang für insgesamt drei Wähbe. Nach der letzten Wäsche das Rohr für eine Minute auf den Magneten legen.Entfernen Sie es, entsorgen Sie den Überstand, und legen Sie das Pellet auf Eis. Als nächstes, um Kernisolierung durchzuführen, die Perlen und Zellen in 50 Mikroliter kalter Lyse Puffer, und Zentrifuge sofort bei 500 G, vier Grad Celsius, für 10 Minuten. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand.Um die Transposase-Reaktion durchzuführen, setzen Sie das isolierte Kernpellet mit 50 Mikrolitertin Tn5-Transposase-Mix wieder auf. Inkubieren Sie in einem Thermocycler für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius, mit dem Deckel auf 40 Grad Celsius eingestellt, und halten Sie dann bei vier Grad Celsius, wenn sie abgeschlossen sind. Unmittelbar nach dem Thermocycling eine schnelle Sitzzentrifuge Spin-down durchführen.Legen Sie das Rohr für eine Minute auf den Magneten, um die Perlen aus dem Produkt zu entfernen. Ohne das Rohr vom Magneten zu entfernen, übertragen Sie den klaren Überstand in eine DNA-Reinigungskolonne. Waschen Sie die Säule einmal mit 250 Mikroliter PB-Puffer und zweimal mit 750 Mikroliter PE-Puffer.Fügen Sie dann 10 Mikroliter Elutionspuffer hinzu, um die Probe zu löschen. Richten Sie die anfängliche PCR-Verstärkungsreaktion in einem nukleasefreien PCR-Rohr ein. Legen Sie das PCR-Rohr in den Thermocycler und führen Sie das PCR-Verstärkungsprogramm aus.Dann vervollständigen Sie die endgültige PCR-Verstärkung der verbleibenden 45 Mikroliter PCR-Reaktion, wie im Manuskript beschrieben. Legen Sie das PCR-Rohr in den Thermocycler und führen Sie das Programm aus. Nach vollständiger Verstärkung, reinigen Sie die Bibliotheken mit einem PCR-Bereinigungskit, nach dem Herstellerprotokoll, Eluing in 25 Mikroliter des Elutionspuffers.Sequenzieren Sie die vorbereiteten Bibliotheken auf einem Sequenzer der nächsten Generation auf eine durchschnittliche Lesetiefe von 42 Millionen Lesevorgängen pro Beispiel. Dieses verbesserte ATAC-seq-Protokoll erzeugte eine endgültige Bibliothek von mehr als einem Nanogramm pro Mikroliter für die Sequenzierung. Die Qualitätskontrolle zeigte DNA-Fragmente zwischen 200 und 1.000 Basenpaaren, und mit diesen hochwertigen Bibliotheken wurde eine weitere Sequenzierung durchgeführt.Bibliotheken, die nach diesem Protokoll erstellt wurden, zeigten nur 3%mitochondriale Kontamination. Der hohe Prozentsatz der verwendbaren Lesevorgänge ist in allen biologischen Replikaten ausreichend konstant. Dieses Protokoll lieferte hochreproduzierbare Ergebnisse über technische Replikationen hinweg sowie biologische Replikationen.Darüber hinaus dauerte dieses Protokoll 48 Stunden statt einer Woche oder mehr wie zuvor beschrieben, was zu einer konsistenten und effizienten Aktivierung führte, wie reproduzierbare Sequenzierungsergebnisse zeigen. Darüber hinaus wurden vorhergesagte ATAC-seq-Peaks von der Analysepipeline genau aufgerufen. Die Sequenzierungsergebnisanalyse ergab deutliche Veränderungen des Chromatinzustands während der Aktivierung menschlicher T-Zellen.Zwischen sechs Proben vor und 48 Stunden nach der Aktivierung wurden unterschiedlich zugängliche Bereiche von offenem Chromatin identifiziert. Stellen Sie sicher, dass die Kernlysereaktion mit gekühlten Reagenzien und Materialien durchgeführt wird, um die Rückgewinnung intakter Kerne zu maximieren. Unser modifizierter Kernlysepuffer ist sanfter für die Zellen und minimiert die Kontaminierung der mitochondrialen DNA.Wir freuen uns darauf, dass dieser modifizierte Lysepuffer auch auf ATAC-seq mit einem Kern angewendet wird. Wir wissen, dass dieses Protokoll es Forschern ermöglichen wird, qualitativ hochwertigere ATAC-seq-Daten zu geringeren Kosten zu erstellen und so das epigenetische Feld voranzubringen. Das Protokoll ist einfach, schnell und erfordert keine gefährlichen Reagenzien oder Instrumente, so dass es leicht zugänglich für diejenigen, die neu atAC-seq.

Research

JoVE Journal

Genetics

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

Design und die Verwendung eines Low Cost, Automatisierte Morbidostat für Adaptive Evolution der Bakterien unter Antibiotikums Selection

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

Forschung

Genetik

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling der mitochondrialen DNA - Replikation in Drosophila Adult Ovarien von EdU Anfärben

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

Bewertung der Kontamination der DNA in RNA-Proben anhand der ribosomalen DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Mapping genomweite zugänglich Chromatin in primären menschlichen T-Lymphozyten durch ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Methodik für die präzise Erkennung der mitochondrialen DNA-Methylierung

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Isolieren, Sequenzierung und Analyse von extrazellulären MicroRNAs aus humanen mesenchymalen Stammzellen

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

Lentiviral vermittelte Gen-Silencing in humanem Pseudoislet in niedrigen Befestigungsplatten zubereitet

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...

Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas

Tumorsphäre Ableitung und Behandlung von primären Tumorzellen isoliert von Maus Rhabdomyosarkomen

Rhabdomyosarcoma (RMS) is the most common soft tissue sarcoma in children. Although significant efforts have enabled the identification of common ...

Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues

Mikrosatelliten-DNA-Genotypisierung und Durchflusszytometrie-Ploidy-Analysen von formalinfixierten Paraffin-eingebetteten Hydatidiform-Molargeweben

Hydatidiform mole (HM) is an abnormal human pregnancy characterized by excessive trophoblastic proliferation and abnormal embryonic development. There are ...

3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells

3D Multicolor DNA FISH Tool zur Erforschung der Kernarchitektur in menschlichen Primärzellen

A major question in cell biology is genomic organization within the nuclear space and how chromatin architecture can influence processes such as gene ...