Name: atac-seq assay with low mitochondrial dna contamination from primary human cd4+ t lymphocytes
Uploaded: 2019-03-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes at JoVE.com

אנו מודים Atsede Siba לקבלת תמיכה טכנית. C.S.C. נתמך על ידי NIH גראנט 1R61DA047032.

פרוטוקול משופרת זה מספק הוראות מפורטות לביצוע האטא ק-seq של CD4 + לימפוציטים, מתוך החומר ההתחלתי של דם מלא באמצעות ניתוח נתונים (איור 1).
1. בידוד תאי CD4 + T של דם מלא
הערה: חומר המוצא עבור פרוטוקול זה הוא 15 מ"ל של דם מלא טריים נאסף באמצעות הליכי?...

<ol>
	<li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin,+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position.">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li><li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATAC-seq:+A+Method+for+Assaying+Chromatin+Accessibility+Genome-Wide.">ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 21, 1-29 (2015).</li><li>Song, L., Crawford, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNase-seq:+a+high-resolution+technique+for+mapping+active+gene+regulatory+elements+across+the+genome+from+mammalian+cells.">DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (2), (2010).</li><li>Pajoro, A., Mui&#241;o, J. M., Angenent, G. C., Kaufmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+Nucleosome+Occupancy+by+MNase-seq:+Experimental+Protocol+and+Computational+Analysis.">Profiling Nucleosome Occupancy by MNase-seq: Experimental Protocol and Computational Analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1675, 167-181 (2018).</li><li>Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAIRE+(Formaldehyde-Assisted+Isolation+of+Regulatory+Elements)+isolates+active+regulatory+elements+from+human+chromatin.">FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin.</a> Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).</li><li>Rosenberg, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+profiling+of+the+developing+mouse+brain+and+spinal+cord+with+split-pool+barcoding.">Single-cell profiling of the developing mouse brain and spinal cord with split-pool barcoding.</a> Science. 360 (6385), 176-182 (2018).</li><li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-specific+and+single-cell+chromatin+accessibility+charts+human+hematopoiesis+and+leukemia+evolution.">Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution.</a> Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).</li><li>Lu, Z., Hofmeister, B. T., Vollmers, C., DuBois, R. M., Schmitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+ATAC-seq+with+nuclei+sorting+for+discovery+of+cis-regulatory+regions+in+plant+genomes.">Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes.</a> Nucleic Acids Research. 45 (6), e41 (2017).</li><li>Lara-Astiaso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+state+dynamics+during+blood+formation.">Chromatin state dynamics during blood formation.</a> Science. 345 (6199), 943-949 (2014).</li><li>Gate, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+determinants+of+co-accessible+chromatin+regions+in+activated+T+cells+across+humans.">Genetic determinants of co-accessible chromatin regions in activated T cells across humans.</a> Nature Genetics. , (2018).</li><li>Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+interrogation+of+functional+elements+in+the+noncoding+genome.">High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome.</a> Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).</li><li>. FastQC A Quality Control tool for High Throughput Sequence Data. Babraham Bioinformatics Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc</a> (2018)</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+ATAC-seq+protocol+reduces+background+and+enables+interrogation+of+frozen+tissues.">An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues.</a> Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+accessible+chromatin+in+mammalian+preimplantation+embryos.">The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos.</a> Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).</li></ol>

פרוטוקול האטא ק-seq ששונה שהוצגו במאמר זה מספק תוצאות לשחזור עם זיהום דנ א מיטוכונדריאלי מינימלי. הפרוטוקול כבר להתרגל בהצלחה לאפיין כרומטין הארכיטקטורה של האדם העיקרי PBMCs10, ומונוציטים אנושי, העכבר תאים דנדריטים (לא פורסם), ו מלנומה בתרבית תאים קווים מספר11. אנו צופ?...

וזמינותו של כרומטין transposase נגיש רצף (האטא ק-seq) הפך במהירות השיטה המובילה עבור חקירת ארכיטקטורת כרומטין. האטא ק-seq ניתן לזהות אזורים של כרומטין נגיש באמצעות התהליך של tagmentation מזימות, תיוג של ה-DNA על ידי האנזים, כדי לייצר ספריות אשר הרצף ניתן לקבוע כרומטין נגישות מעבר הגנום כולו. תהליך זה tagmentation מתווך על ידי היפראקטיבי Tn5 transposase, אשר רק חותך אזורים פתוחים של כרומטין עקב מכשול הסטריים nucleosomic. בזמן שזה חותך, transposase Tn5 מוסיף גם מתאמים רצף המאפשרים בנייה מהירה ספריה על ידי ה-PCR ורצף הדור הבא של הגנום כולו נגיש כרומטין1,2.
האטא ק-seq הפכה השיטה המועדפת כדי לקבוע אזורים של כרומטין נגישות עקב פרוטוקול יחסית פשוטה ומהירה, איכות ומגוון של מידע יכול להיקבע מן התוצאות שלה, ואת כמות קטנה של החל החומר הנדרש. בהשוואה DNase-seq3 (אשר גם מודד את נגישות כרומטין הגנום כולו), MNase-seq4 (הקובע נוקלאוזום עמדות באזורים פתוחים גנום), בתיווך פורמלדהיד שלהם-seq5, האטא ק-seq הוא מהיר יותר, יותר זול, יותר לשחזור1. זה גם יותר רגיש, עבודה עם החל חומר של מעטים כמו גרעינים 500, לעומת 50 מיליון גרעינים הדרושות DNase-seq3. האטא ק-seq יש גם את היכולת לספק מידע נוסף אודות אדריכלות כרומטין מאשר בשיטות אחרות, כולל אזורים של איגוד פקטור שעתוק, מיצוב נוקלאוזום כרומטין פתוח אזורים1. פרוטוקולים האטא ק-seq יעיל, תא בודד יש מאומת, המספקים מידע על האדריכלות כרומטין החד-תאיים ברמה6,7.
האטא ק-seq שימש לאפיון אדריכלות כרומטין על פני קשת רחבה של סוגי תאים ומחקר, כולל צמחים8, בני9ו רבים אורגניזמים אחרים. הוא גם היה קריטי בזיהוי epigenetic רגולציה של המחלה הברית7. עם זאת, פרוטוקול האטא ק-seq הנפוצה ביותר כולל את החיסרון העיקרי של זיהום קריאות רצף של דנ א מיטוכונדריאלי. כמה ערכות נתונים, רמת זיהום יכול להיות גבוה ככל 60% של רצף תוצאות1. יש מאמץ בשדה כדי להפחית את קריאות מיטוכונדריאלי מזהמים אלה על מנת לאפשר ליישום יעיל יותר האטא ק-seq7,10,11. כאן אנו מציגים פרוטוקול seq האטא ק משופר אשר מפחית את שיעור הזיהום דנ א מיטוכונדריאלי רק 3%, המאפשר צמצום של-50% תוך רצף עולה10. זה התאפשר על ידי תהליך מיועל של לימפוציטים בידוד CD4 + ואת הפעלת מאגר פירוק משופרת שחיוני במטרה למזער את הזיהום דנ א מיטוכונדריאלי.
פרוטוקול modifiedATAC-seq זה אומתה עם מגוון רחב של ראשי תאים, כולל דם היקפיים ראשי אדם תאי תאים (PBMCs)10, ומונוציטים ראשי האדם העכבר תאים דנדריטים (לא פורסם). הוא גם שימש בהצלחה לחקור מלנומה שורות תאים במסך חזרה palindromic קצר באופן קבוע interspaced (CRISPR) באשכולות של רכיבים ללא קידוד11. בנוסף, חבילת ניתוח הנתונים המתוארים פרוטוקול זה וסיפק על GitHub מספק חוקרים חדשים ומנוסה עם כלים לניתוח נתונים האטא ק-seq. האטא ק-seq וזמינותו היעיל ביותר כדי למפות כרומטין נגישות מעבר הגנום כולו, שינויים בפרוטוקול הקיים אשר הציג כאן יאפשר החוקרים להפיק נתונים באיכות גבוהה עם זיהום נמוכה דנ א מיטוכונדריאלי, צמצום עלויות רצף ושיפור תפוקת האטא ק-seq.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X PBS, Sterile</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5810/5810&#160;R Swing Bucket Refrigerated Centrifuge with 50 mL, 15 mL, and 1.5 mL Tube Buckets</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22625501</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Round Bottom Plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>163320</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 4200 Tape Station System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>374081</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>11131D</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>11346D</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamagnet</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Gemini Bio Products</td>
			<td>100-500</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>50674626</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2393</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute PCR Purification Kit (Buffer PB, Buffer PE, Elution Buffer)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext High Fidelity 2X PCR Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0541</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera DNA Library Preparation Kit (2X TD Buffer, Tn5 Enzyme)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC1211030</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free Sterile dH20</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10977015</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20 (Tween20)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A25780</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Water Bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TSGP02</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit FlouroMeter</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosette Sep Human CD4+ Density Medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>15705</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>15022</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Resevoir</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>8096-11</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermocycler with Heated Lid</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5941</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atac-seq assay with low mitochondrial dna contamination from primary human cd4+ t lymphocytes

האטא ק-seq הפך מתודולוגיה בשימוש נרחב במחקר של אפיגנטיקה בשל גישתה מהירה ופשוטה מיפוי הגנום כולו נגיש כרומטין. במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול seq האטא ק משופר אשר מפחית את זיהום קריאות דנ א מיטוכונדריאלי. בעוד פרוטוקולים האטא ק-seq הקודם נאבקו עם קורא ממוצע של 50% מזהמות דנ א מיטוכונדריאלי, המאגר פירוק ממוטבת הציג פרוטוקול זה מפחית את זיהום דנ א מיטוכונדריאלי ממוצע של 3%. פרוטוקול זה seq האטא ק משופר מאפשר ירידה 50% ליד העלות רצף. נדגים כיצד ניתן להכין ספריות האטא ק-seq אלה באיכות גבוהה מופעל CD4 + לימפוציטים, מתן הוראות שלב אחר שלב של CD4 + בידוד לימפוציט של דם דרך ניתוח נתונים. פרוטוקול seq האטא ק משופר זה אומתה במגוון רחב של סוגי תאים ויהיה תועלת מיידית והטייפונים נגישות כרומטין.

מ- 15 מ"ל של דם טרי, פרוטוקול זה יוצר ממוצע של 1 מיליון תאי CD4 + T. אלה יכולים להיות קפוא לעיבוד מאוחר יותר או שימוש באופן מיידי. הכדאיות של תאי CD4 + T, טריים או המופשרים, היה עקבי > 95%. שיטה זו של בידוד תאי CD4 + T מאפשר גמישות בזמן חומר ואוסף מקור. פרוטוקול seq האטא ק משופר זה מייצר ספריי?...

Watch this Scientific Journal Video about ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes at JoVE.com

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבצע וזמינותו של כרומטין transposase נגיש רצף (האטא ק-seq)-מופעל CD4 + האדם לימפוציטים. הפרוטוקול שונתה כדי למזער מזהמים קריאות דנ א מיטוכונדריאלי מ 50% ל-3% דרך המבוא של מאגר פירוק חדש.

האטא ק-seq Assay עם זיהום נמוכה דנ א מיטוכונדריאלי של ראשי האדם CD4 + לימפוציטים מסוג T

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

פרוטוקול ATAC-seq שונה זה מציג מאגר תזהמה חדש המפחית קריאות מיטוכונדריות מזהמים מ 50% לפחות מ 3%הזיהום המיטוכונדריאלי ירד יאפשר לחוקרים לבצע יעיל יותר ATAC-seq עם ירידה של 50% בעלויות רצף. אמתנו פרוטוקול ATAC-seq חדש זה במחשבים אישיים ראשוניים אנושיים, מונוציטים ראשוניים אנושיים, תאים דנדריטיים של עכברים וקווי תאים מלנומה. אנו מאמינים שזה יהיה יעיל במגוון רחב של סוגי תאים.מזעור אובדן הדגימה במהלך תהליך ההפעלה והבחירה של התא הוא קריטי להשגת תוצאות באיכות גבוהה באמצעות ATAC-seq. אנו נדגים כיצד לטפל במספר קטן של תאים מדגימות יקרות באמצעות ציוד מעבדה בסיסי. כדי להתחיל, להפשיר בקבוקון אחד של תאי CD4 + T מבודדים בעבר באמבט מים צלזיוס 37 מעלות עד הקרח רק נמס.ואז בעדינות להעביר את התאים לצינור חרוט 15 מיליליטר המכיל תשעה מיליליטר של RPMI מלא מחומם מראש. צנטריפוגה התאים ב 1, 500 פעמים G, וארבע מעלות צלזיוס, במשך שש דקות. ואז להשליך את supernatant, בעדינות resuspend את גלולה בשני מיליליטר של RPMI מלא.לאחר חזרה על הצנטריפוגה, השלך את העל-טבעי, ולחץ בעדינות על התאים ב- 0.5 מיליליטר של RPMI מלא. השתמש בהמוציטומטר כדי לספור את התאים. באמצעות RPMI מלא, להתאים את צפיפות מתלי התא לצלחת 50, 000 CD4 + תאים ב 200 microliters ל הבאר של צלחת 96 גם עגול למטה.לאחר מכן, כדי להכין חרוזים מגנטיים, aliquot 12.5 microliters של גם T-Activator אנושי CD3/CD28 חרוזים לכל מדגם ATAC-seq לצינור 1.5 מיליליטר. מוסיפים מיליליטר אחד של 1x PBS לצינור, וממקמים אותו על מגנט למשך דקה אחת כדי לשטוף את חרוזים. בזהירות להסיר ולהשליך את העל טבעי ברור, ולהסיר את הצינור מן המגנט.יש למצות את חרוזים ב-13 מיקרוליטרים של דגימת RPMI מלאה לדגימה של ATAC-seq. כדי להפעיל את תאי CD4+T עם הריכוז המותאם, לאסוף 500, 000 תאים ב 2.1 מיליליטר של מדיום RPMI מלא בצינור חרוט 15 מיליליטר. הוסיפו 12.5 מיקרוליטרים של גם בחנוזי T-Activator אנושיים, שהוכנו ונשטפו בשלבים קודמים, ומערבבים בעדינות על ידי היפוך הצינור.לאחר מכן מעבירים בעדינות את התאים, עם חרוזים, למאגר סטרילי. בעזרת פיפטה רב-ערוצית, צלחת 200 מיקרוליטרים של תאים עם חרוזים ל הבאר של צלחת עגולה 96 באר, וחנקובות ב 37 מעלות צלזיוס, 5%CO2 אינקובטור במשך 48 שעות. לאחר הדגירה המלאה, צנטריפוגה הצלחת ב 423 פעמים G, וטמפרטורת החדר, במשך שמונה דקות.הסר 100 microliters של בינוני מכל באר, ולאסוף אותו בצינור חרוט לפני השלכת, על מנת לאשר שום אובדן חרוזים. ואז תן שימוש חוזר לכדור התא ב-100 המיקרוליטרים הנותרים של המדיום, ואאסוף הכל בצינור של 1.5 מיליליטר. כדי לבודד CD4+תאים, הוסף 50 מיקרוליטרים של חרוזים מצומדים CD4 שנשטפו מראש ל- 500, 000 תאים במיליליטר אחד של RPMI מלא, והתהפך כדי לערבב.דגירה במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס, תוך כדי תנועה ידנית כל שש דקות כדי לערבב. מניחים את הצינור על המגנט במשך שתי דקות, עד על טבעי ברור, ולאחר מכן להסיר ולהשליך. הסר את הצינור מהמגנט.לשטוף את התאים כבול חרוזים על ידי שימוש חוזר אותם במיליליטר אחד של PBS, בתוספת 2% FCS, ולמקם את הצינור בחזרה על המגנט במשך דקה אחת. השלך את העל-טבעי הברור, וחזור על תהליך זה במשך שלוש שטיפות בסך הכל. לאחר הכביסה הסופית, מניחים את הצינור על המגנט למשך דקה אחת.מוציאים אותו, משליכים את העל-טבעי, ומ מניחים את גלולת הקרח על הקרח. לאחר מכן, כדי לבצע בידוד גרעיני, תן שימוש חוזר חרוזי ותאים ב 50 microliters של חיץ תמוגה קרה, וצנטריפוגה מיד ב 500 G, ארבע מעלות צלזיוס, במשך 10 דקות. הסר והשליך את העל-טבעי.כדי לבצע את תגובת transposase, תן שימוש חוזר גלולת הגרעינים המבודדים עם 50 microliters של Tn5 טרנספוזאז לערבב. דגירה בתרמוציקלר במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, עם המכסה להגדיר 40 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להחזיק בארבע מעלות צלזיוס כאשר הושלמה. מיד לאחר התרמוצ'ילי, בצעו ספין-למטה מהיר של צנטריפוגה על הספסל.מניחים את הצינור על המגנט למשך דקה אחת כדי להסיר את חרוזים מהמוצר. מבלי להסיר את הצינור מהמגנט, העבר את העל-טבעי הברור לעמוד טיהור דנ"א. לשטוף את העמודה פעם אחת עם 250 microliters של מאגר PB, ופעמיים עם 750 microliters של מאגר PE.לאחר מכן הוסיפו 10 מיקרוליטרים של מאגר אלוטיון כדי לחמק מהדגימה. הגדר את תגובת ההגברה הראשונית של PCR בצינור PCR ללא גרעין. מקם את צינור PCR לתוך התרמוצ'יקלר והפעל את תוכנית ההגברה של PCR.לאחר מכן השלימו את הגברה הסופית של PCR של 45 המיקרוליטרים הנותרים של תגובת PCR, כמתואר בכתב היד. מקם את צינור PCR בתרמוציקלר והפעל את התוכנית. לאחר הגברה מלאה, לטהר את הספריות באמצעות ערכת ניקוי PCR, בעקבות פרוטוקול היצרן, eluting ב 25 microliters של מאגר elution.רצף הספריות המוכנות ברצף הדור הבא לעומק קריאה ממוצע של 42 מיליון קריאות לכל מדגם. פרוטוקול ATAC-seq משופר זה הפיק ספריה סופית של יותר מננוגרם אחד לכל מיקרוליטר לתהפה. בקרת איכות הראתה שברי דנ"א בין 200 ל-1,000 זוגות בסיסים, ותבוצע רצף נוסף עם ספריות איכותיות אלה.ספריות שהוכנו בעקבות פרוטוקול זה הראו זיהום מיטוכונדריאלי של 3% בלבד. האחוז הגבוה של קריאות שמיש הוא קבוע מספיק על פני שכפולים ביולוגיים. פרוטוקול זה סיפק תוצאות הניתנות לשחזור רב על-פני שכפולים טכניים, כמו גם שכפולים ביולוגיים.בנוסף, פרוטוקול זה לקח 48 שעות, במקום שבוע אחד או יותר כפי שתואר קודם לכן, וכתוצאה מכך הפעלה עקבית ויעילה, כפי שהוכח על ידי תוצאות רצף לשחזור. יתר על כן, פסגות ATAC-seq חזוי נקראו במדויק על ידי צינור הניתוח. ניתוח תוצאות רצף גילה שינויים ברורים במצב כרומטין במהלך הפעלת תא T אנושי.אזורים נגישים להבחנה של כרומטין פתוח זוהו בין שש דגימות לפני ו 48 שעות לאחר ההפעלה. ודא שתגובת תות הגרעין מבוצעת עם ריאגנטים וחומרים צוננים, על מנת למקסם את ההתאוששות של גרעינים שלמים. מאגר תות הגרעינים שלנו שונה עדין יותר על התאים, וממזער דנ"א מיטוכונדריאלי מזהם.אנו מצפים לכך שמאגר תזה שונה זה יוחל גם על ATAC-seq בגרעין יחיד. אנו יודעים שפרוטוקול זה יאפשר לחוקרים לייצר נתוני ATAC-seq באיכות גבוהה יותר בעלות מופחתת, ויעזור להעביר את השדה האפיגנטי. הפרוטוקול הוא פשוט, מהיר, ואינו דורש כל reagents מסוכן או מכשירים, מה שהופך אותו נגיש בקלות עבור אלה חדשים ATAC-seq.

Research

JoVE Journal

Genetics

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

עיצוב ושימוש בעלות נמוכה, אוטומטי Morbidostat עבור Adaptive אבולוציה מהירה של חיידקים תחת אנטיביוטי והתרופות בחירה

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

באתרו תיוג של דנ&quot;א מיטוכונדריאלי שכפול תסיסנית למבוגרים השחלות ידי edu מכתים

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

הערכה של ה-DNA זיהום בדגימות ה-RNA בהתבסס על Ribosomal DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

מיפוי הגנום כולו נגיש כרומטין של לימפוציטים מסוג T אנושי ראשוני על ידי האטא ק-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

מתודולוגיה עבור איתור מדויק של מתילציה DNA מיטוכונדריאלי

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

בידוד, קביעת רצף וניתוח מיקרו Rna חוץ-תאי של גזע Mesenchymal אנושי

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

לנטינגינה ג'ין מתווכת השתקה האדם פסאודו איון מוכן לוחות מצורף נמוך

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...

Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas

והטיפול מתאי הגידול הראשוניים מבודדים מעכבר תמס שריר

Rhabdomyosarcoma (RMS) is the most common soft tissue sarcoma in children. Although significant efforts have enabled the identification of common ...

Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues

דנ א של מיקרולוווין הגנוזות וזרימה Cy, בדיקות פלוטודיה של פורמאלין-קבוע פרפין-מוטבע רקמות טוחנת

Hydatidiform mole (HM) is an abnormal human pregnancy characterized by excessive trophoblastic proliferation and abnormal embryonic development. There are ...

3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells

3D מרובת צבעים דג DNA כלי ללמוד אדריכלות גרעינית בתאים ראשוניים אנושיים

A major question in cell biology is genomic organization within the nuclear space and how chromatin architecture can influence processes such as gene ...