Name: atac-seq assay with low mitochondrial dna contamination from primary human cd4+ t lymphocytes
Uploaded: 2019-03-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes at JoVE.com

तकनीकी सहायता के लिए हम एटसेड साइबा को धन्यवाद देते हैं । C.S.C. NIH अनुदान 1R61DA047032 द्वारा समर्थित है ।

यह बेहतर प्रोटोकॉल डेटा विश्लेषण (चित्रा 1) के माध्यम से पूरे रक्त की प्रारंभिक सामग्री से, सीडी 4 + lymphocytes के atac-seq प्रदर्शन के लिए कदम दर कदम निर्देश प्रदान करता है ।
1. पूरे रक्त से सीडी 4 + ?...

<ol>
	<li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin,+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position.">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li><li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATAC-seq:+A+Method+for+Assaying+Chromatin+Accessibility+Genome-Wide.">ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 21, 1-29 (2015).</li><li>Song, L., Crawford, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNase-seq:+a+high-resolution+technique+for+mapping+active+gene+regulatory+elements+across+the+genome+from+mammalian+cells.">DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (2), (2010).</li><li>Pajoro, A., Mui&#241;o, J. M., Angenent, G. C., Kaufmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+Nucleosome+Occupancy+by+MNase-seq:+Experimental+Protocol+and+Computational+Analysis.">Profiling Nucleosome Occupancy by MNase-seq: Experimental Protocol and Computational Analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1675, 167-181 (2018).</li><li>Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAIRE+(Formaldehyde-Assisted+Isolation+of+Regulatory+Elements)+isolates+active+regulatory+elements+from+human+chromatin.">FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin.</a> Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).</li><li>Rosenberg, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+profiling+of+the+developing+mouse+brain+and+spinal+cord+with+split-pool+barcoding.">Single-cell profiling of the developing mouse brain and spinal cord with split-pool barcoding.</a> Science. 360 (6385), 176-182 (2018).</li><li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-specific+and+single-cell+chromatin+accessibility+charts+human+hematopoiesis+and+leukemia+evolution.">Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution.</a> Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).</li><li>Lu, Z., Hofmeister, B. T., Vollmers, C., DuBois, R. M., Schmitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+ATAC-seq+with+nuclei+sorting+for+discovery+of+cis-regulatory+regions+in+plant+genomes.">Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes.</a> Nucleic Acids Research. 45 (6), e41 (2017).</li><li>Lara-Astiaso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+state+dynamics+during+blood+formation.">Chromatin state dynamics during blood formation.</a> Science. 345 (6199), 943-949 (2014).</li><li>Gate, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+determinants+of+co-accessible+chromatin+regions+in+activated+T+cells+across+humans.">Genetic determinants of co-accessible chromatin regions in activated T cells across humans.</a> Nature Genetics. , (2018).</li><li>Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+interrogation+of+functional+elements+in+the+noncoding+genome.">High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome.</a> Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).</li><li>. FastQC A Quality Control tool for High Throughput Sequence Data. Babraham Bioinformatics Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc</a> (2018)</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+ATAC-seq+protocol+reduces+background+and+enables+interrogation+of+frozen+tissues.">An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues.</a> Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+accessible+chromatin+in+mammalian+preimplantation+embryos.">The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos.</a> Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).</li></ol>

संशोधित ATAC-seq इस लेख में प्रस्तुत प्रोटोकॉल ंयूनतम mitochondrial डीएनए संदूषण के साथ reproducible परिणाम प्रदान करता है । प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक मानव प्राथमिक pbmcs10के क्रोमेटिन वास्तुकला, मानव monocytes, माउस डेन्ड?...

transposase के लिए परख-सुलभ क्रोमेटिन अनुक्रमण (atac-seq) तेजी से क्रोमेटिन वास्तुकला पूछताछ के लिए अग्रणी तरीका बन गया है । atac-seq टैगमेंटेशन की प्रक्रिया के माध्यम से सुलभ क्रोमेटिन के क्षेत्रों की पहचान कर सकते हैं, एक ही एंजाइम द्वारा खंडित और डीएनए के टैगिंग, पुस्तकालयों जिसके साथ अनुक्रमण एक पूरे जीनोम भर में क्रोमेटिन पहुँच निर्धारित कर सकते हैं उत्पादन करने के लिए. इस टैगमेंटेशन प्रक्रिया अतिसक्रिय Tn5 transposase है, जो केवल nucleosomic त्रिविमी बाधा के कारण क्रोमेटिन के खुले क्षेत्रों में कटौती द्वारा मध्यस्थता की है । यह कटौती के रूप में, Tn5 transposase भी अनुक्रमण एडाप्टर है कि पीसीआर और अगली पीढ़ी के जीनोम-वाइड सुलभ क्रोमेटिन1,2के अनुक्रमण द्वारा तेजी से पुस्तकालय निर्माण के लिए अनुमति सम्मिलित करता है ।
atac-seq अपेक्षाकृत सरल और तेजी से प्रोटोकॉल, गुणवत्ता और सूचना है कि इसके परिणामों से निर्धारित किया जा सकता है की सीमा के कारण क्रोमेटिन पहुंच के क्षेत्रों का निर्धारण करने के लिए पसंदीदा विधि बन गया है, और आवश्यक सामग्री शुरू करने की छोटी राशि । dnase-seq3 की तुलना में (जो भी जीनोम चौड़ा क्रोमेटिन पहुंच उपाय), mnase-seq4 (जो खुले जीनोम क्षेत्रों में nucleosome पदों को निर्धारित करता है), और formaldehyde-mediated faire-seq5, atac-seq तेज है, सस्ता, और अधिक reproducible1। यह भी अधिक संवेदनशील है, के रूप में ५०० नाभिक के रूप में कुछ की शुरुआत सामग्री के साथ काम कर रहे, DNase-seq3के लिए आवश्यक ५०,०००,००० नाभिक की तुलना में । atac-seq भी अन्य विधियों से क्रोमेटिन वास्तुकला के बारे में अधिक जानकारी प्रदान करने की क्षमता है, प्रतिलेखन कारक बंधन के क्षेत्रों सहित, nucleosome स्थिति, और ओपन क्रोमेटिन क्षेत्रों1. प्रभावी, एकल सेल atac-seq प्रोटोकॉल, एकल कोशिका स्तर6,7पर क्रोमेटिन वास्तुकला के बारे में जानकारी प्रदान मान्य किया गया है ।
atac-seq अनुसंधान और कोशिकाओं के प्रकार के एक व्यापक स्पेक्ट्रम भर में क्रोमेटिन वास्तुकला की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया गया है, पौधों सहित8, मनुष्य9, और कई अन्य जीवों. यह भी रोग राज्यों के पश् चजात विनियमन की पहचान करने में महत्वपूर्ण है7। हालांकि, सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल atac-seq प्रोटोकॉल में शामिल है संदूषण अनुक्रमण के प्रमुख दोष mitochondrial डीएनए से पढ़ता है । कुछ डेटा सेट में, यह संदूषण स्तर अनुक्रमण परिणाम1के ६०% के रूप में उच्च हो सकता है । इस क्षेत्र में एक ठोस प्रयास करने के लिए इन contaminating माइटोकोड्रियल को कम करने के लिए atac-seq7,10,11के अधिक कुशल आवेदन के लिए अनुमति देने के लिए पढ़ता है । यहां हम एक बेहतर ATAC-seq प्रोटोकॉल है कि सिर्फ 3% के लिए mitochondrial डीएनए संदूषण दर कम कर देता है वर्तमान, अनुक्रमण लागत10में लगभग ५०% की कमी की अनुमति । यह सीडी 4 + लिम्फोसाइट अलगाव और सक्रियण और एक बेहतर lysis बफर कि mitochondrial डीएनए संदूषण को ंयूनतम करने में महत्वपूर्ण है की एक सुव्यवस्थित प्रक्रिया से संभव बनाया है ।
इस modifiedATAC-seq प्रोटोकॉल प्राथमिक कोशिकाओं की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ मांय किया गया है, मानव प्राथमिक परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (PBMCs)10, मानव प्राथमिक monocytes सहित, और माउस डेन्रिटिक कोशिकाओं (अप्रकाशित). यह भी सफलतापूर्वक प्रयोग किया गया है एक संकुल में मेलेनोमा सेल लाइनों को नियमित रूप से interspaced लघु palindromic दोहराता (CRISPR) गैर की स्क्रीन-11तत्वों कोडिंग पूछताछ । इसके अतिरिक्त, इस प्रोटोकॉल में वर्णित डेटा विश्लेषण पैकेज और GitHub पर प्रदान की ATAC-seq डेटा का विश्लेषण करने के लिए उपकरणों के साथ नए और अनुभवी शोधकर्ताओं प्रदान करता है । atac-seq सबसे प्रभावी परख के लिए एक पूरे जीनोम भर में क्रोमेटिन पहुंच नक्शा है, और मौजूदा प्रोटोकॉल है कि यहां पेश कर रहे है संशोधनों के लिए उच्च गुणवत्ता वाले डेटा का उत्पादन करने की अनुमति होगी कम mitochondrial डीएनए संदूषण के साथ डाटा, अनुक्रमण लागत को कम करने और atac-seq थ्रैपुट में सुधार ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X PBS, Sterile</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5810/5810&#160;R Swing Bucket Refrigerated Centrifuge with 50 mL, 15 mL, and 1.5 mL Tube Buckets</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22625501</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Round Bottom Plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>163320</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 4200 Tape Station System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>374081</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>11131D</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>11346D</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamagnet</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Gemini Bio Products</td>
			<td>100-500</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>50674626</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2393</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute PCR Purification Kit (Buffer PB, Buffer PE, Elution Buffer)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext High Fidelity 2X PCR Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0541</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera DNA Library Preparation Kit (2X TD Buffer, Tn5 Enzyme)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC1211030</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free Sterile dH20</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10977015</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20 (Tween20)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A25780</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Water Bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TSGP02</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit FlouroMeter</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosette Sep Human CD4+ Density Medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>15705</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>15022</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Resevoir</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>8096-11</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermocycler with Heated Lid</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5941</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atac-seq assay with low mitochondrial dna contamination from primary human cd4+ t lymphocytes

ATAC-seq जीनोम-वाइड सुलभ chromatin मानचित्रण करने के लिए अपनी तेजी से और सरल दृष्टिकोण के कारण एपिजेनेटिक्स के अध्ययन में एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया पद्धति बन गया है । इस पत्र में हम एक बेहतर ATAC-seq प्रोटोकॉल मौजूद है कि contaminating mitochondrial डीएनए कम कर देता है पढ़ता है । जबकि पिछले ATAC-seq प्रोटोकॉल ५०% के एक औसत के साथ संघर्ष किया है mitochondrial डीएनए contaminating पढ़ता है, अनुकूलित lysis बफर इस प्रोटोकॉल में शुरू की 3% की एक औसत mitochondrial डीएनए संदूषण कम कर देता है । इस सुधार atac-seq प्रोटोकॉल अनुक्रमण लागत में एक के पास ५०% कमी के लिए अनुमति देता है । हम प्रदर्शन कैसे इन उच्च गुणवत्ता ATAC-seq पुस्तकालयों सक्रिय सीडी 4 + lymphocytes से तैयार किया जा सकता है, द्वारा कदम प्रदान कर सकते है सीडी 4 से कदम निर्देश + लिम्फोसाइट अलगाव डेटा विश्लेषण के माध्यम से पूरे रक्त से । इस सुधार atac-seq प्रोटोकॉल सेल प्रकार की एक विस्तृत श्रृंखला में मान्य किया गया है और क्रोमेटिन पहुँच का अध्ययन शोधकर्ताओं के लिए तत्काल उपयोग की जाएगी.

ताजा पूरे रक्त के 15 मिलीलीटर से, इस प्रोटोकॉल १,०००,००० सीडी 4 + टी कोशिकाओं के एक औसत उत्पंन करता है । ये बाद में प्रसंस्करण के लिए जमे हुए या तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है । सीडी 4 + टी कोशिकाओं,...

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ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

यहां, हम एक प्रोटोकॉल मौजूद transposase के लिए एक परख करने के लिए-सुलभ क्रोमेटिन अनुक्रमण (atac-seq) पर सक्रिय सीडी 4 + मानव lymphocytes । प्रोटोकॉल को संशोधित किया गया है ताकि एक नए lysis बफर की शुरूआत के माध्यम से ५०% से 3% तक दूषित mitochondrial डीएनए को कम करने के लिए पढ़ता है ।

ATAC-seq परख के साथ कम Mitochondrial डीएनए संदूषण प्राथमिक मानव सीडी 4 + टी लिम्फोसाइटों से

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

यह संशोधित ATAC-seq प्रोटोकॉल एक नया लाइसिस बफर का परिचय देता है जो दूषित माइटोकॉन्ड्रियल को 50% से घटाकर 3% से कम कर देता है कम माइटोकॉन्ड्रियल संदूषण शोधकर्ताओं को अनुक्रमण लागत में 50% की कमी के साथ अधिक कुशल ATAC-seq प्रदर्शन करने की अनुमति देगा। हमने मानव प्राथमिक पीबीएमसी, मानव प्राथमिक मोनोसाइट्स, माउस डेंड्रिटिक कोशिकाओं और मेलानोमा सेल लाइनों में इस नए ATAC-seq प्रोटोकॉल को मान्य किया है। हमारा मानना है कि यह सेल प्रकार की एक विस्तृत श्रृंखला में प्रभावी होगा।कोशिका सक्रियण और चयन प्रक्रिया के दौरान नमूना हानि को कम करना ATAC-seq के साथ उच्च गुणवत्ता वाले परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। हम प्रदर्शित करेंगे कि बुनियादी प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग करके कीमती नमूनों से कोशिकाओं की छोटी संख्या को कैसे संभालना है। शुरू करने के लिए, एक ३७ डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में पहले से अलग सीडी 4 + टी कोशिकाओं की एक शीशी गल जब तक बर्फ अभी पिघल गया है ।फिर धीरे से कोशिकाओं को 15 मिलीलीटर शंकु नली में स्थानांतरित करें जिसमें नौ मिलीलीटर पूर्व-गरम पूर्ण आरपीएमआई होते हैं। 1, ५०० बार जी, और चार डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र, छह मिनट के लिए । फिर सुपरनेट को त्याग दें, और धीरे-धीरे पूर्ण आरपीएमआई के दो मिलीलीटर में गोली को फिर से रखें।अपकेंद्रित्र दोहराने के बाद, सुपरनेट को त्याग दें, और धीरे-धीरे कोशिकाओं को पूर्ण आरपीएमआई के 0.5 मिलीलीटर में फिर से खर्च करें। कोशिकाओं की गिनती करने के लिए एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करें। पूर्ण RPMI का उपयोग करना, एक ९६-अच्छी तरह से गोल नीचे प्लेट के अच्छी तरह से प्रति २०० माइक्रोलीटर में ५०, 000 सीडी 4 + कोशिकाओं की थाली के लिए सेल निलंबन घनत्व समायोजित करें ।फिर, चुंबकीय मोतियों को तैयार करने के लिए, मानव टी-एक्टिवेटर सीडी 3/सीडी28 मोतियों के 1.5 मिलीलीटर ट्यूब के लिए 1.5 मिलीलीटर ट्यूब के लिए एलिकोट 12.5 माइक्रोलीटर। ट्यूब में 1x पीबीएस का एक मिलीलीटर जोड़ें, और मोतियों को धोने के लिए इसे एक मिनट के लिए चुंबक पर रखें। ध्यान से हटा दें और स्पष्ट सुपरनैंट को त्यागें, और चुंबक से ट्यूब को हटा दें।प्रति ATAC-seq नमूने को पूर्ण आरपीएमआई के 13 माइक्रोलीटर में मोतियों को फिर से खर्च करें। समायोजित एकाग्रता के साथ सीडी 4 + टी कोशिकाओं को सक्रिय करने के लिए, 15 मिलीलीटर शंकुवा ट्यूब में पूर्ण आरपीएमआई माध्यम के 2.1 मिलीलीटर में 500, 000 कोशिकाओं को इकट्ठा करें। मानव टी-एक्टिवर मोतियों के 12.5 माइक्रोलीटर जोड़ें, तैयार किए गए और पिछले चरणों में धोए गए, और ट्यूब को उलटा करके धीरे-धीरे मिलाएं।फिर धीरे-धीरे कोशिकाओं को मोतियों के साथ, बाँझ जलाशय में स्थानांतरित करें। एक बहु चैनल पिपेट का उपयोग करना, प्लेट २०० कोशिकाओं के माइक्रोलीटर एक गोल नीचे ९६-अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से मोती के साथ, और एक ३७ डिग्री सेल्सियस में इनक्यूबेट, ४८ घंटे के लिए 5% CO2 इनक्यूबेटर । इनक्यूबेशन पूरी होने के बाद, आठ मिनट के लिए 423 गुना जी, और कमरे के तापमान पर प्लेट को अपकाइज करें।प्रत्येक कुएं से मध्यम के 100 माइक्रोलीटर निकालें, और इसे त्यागने से पहले एक शंकु नली में इकट्ठा करें, ताकि कोई मनका हानि की पुष्टि न हो सके। फिर मध्यम के शेष 100 माइक्रोलीटर में सेल पेलेट को फिर से खर्च करें, और 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में सब कुछ इकट्ठा करें। सीडी 4 + कोशिकाओं को अलग करने के लिए, पूर्ण RPMI के एक मिलीलीटर में 500, 000 कोशिकाओं के लिए पूर्व-धोया सीडी 4 संयुग्मित मोतियों के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें, और मिश्रण करने के लिए उलटा।चार डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट, जबकि हाथ से मिश्रण करने के लिए हर छह मिनट में flicking । ट्यूब को चुंबक पर दो मिनट के लिए रखें, जब तक कि सुपरनैंट स्पष्ट न हो जाए, और फिर हटा दें और त्यागें। चुंबक से ट्यूब निकालें।उन्हें पीबीएस के एक मिलीलीटर में फिर से खर्च करके मनका-बाध्य कोशिकाओं को धोएं, साथ ही 2% एफसीएस, और ट्यूब को एक मिनट के लिए चुंबक पर वापस रखें। स्पष्ट सुपरनेट को त्यागें, और कुल तीन वॉश के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं। अंतिम धोने के बाद, ट्यूब को चुंबक पर एक मिनट के लिए रखें।इसे निकालें, सुपरनैंट को त्यागें, और गोली को बर्फ पर रखें। इसके बाद, नाभिक अलगाव करने के लिए, 10 मिनट के लिए 50 ग्राम, 500 ग्राम, चार डिग्री सेल्सियस पर तुरंत 50 माइक्रोलीटर में मोतियों और कोशिकाओं को फिर से खर्च करें। सुपरनेट को निकालें और त्यागें।ट्रांसपोसेस प्रतिक्रिया करने के लिए, टीएन5 ट्रांसपोसेस मिश्रण के 50 माइक्रोलीटर के साथ अलग-अलग नाभिक गोली को फिर से खर्च करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एक थर्मोसाइकिलर में इनक्यूबेट, ढक्कन के साथ ४० डिग्री सेल्सियस के लिए सेट, और फिर पूरा होने पर चार डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो । थर्मोसाइक्लिंग के तुरंत बाद, एक त्वरित बेंच-टॉप अपकेंद्रित्र स्पिन-डाउन करें।उत्पाद से मोतियों को हटाने के लिए एक मिनट के लिए ट्यूब को चुंबक पर रखें। चुंबक से ट्यूब को हटाने के बिना, स्पष्ट सुपरनिटेंट को डीएनए शुद्धिकरण कॉलम में स्थानांतरित करें। पीबी बफर के 250 माइक्रोलीटर के साथ एक बार कॉलम धोएं, और पीई बफर के 750 माइक्रोलीटर के साथ दो बार।फिर नमूने को स्पष्ट करने के लिए एल्यूशन बफर के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें। एक नाभिक मुक्त पीसीआर ट्यूब में प्रारंभिक पीसीआर प्रवर्धन प्रतिक्रिया स्थापित करें। पीसीआर ट्यूब को थर्मोसाइकिलर में रखें, और पीसीआर प्रवर्धन कार्यक्रम चलाएं।फिर पांडुलिपि में वर्णित पीसीआर प्रतिक्रिया के शेष 45 माइक्रोलीटर का अंतिम पीसीआर प्रवर्धन पूरा करें। पीसीआर ट्यूब को थर्मोसाइकिलर में रखें और प्रोग्राम चलाएं। पूर्ण प्रवर्धन के बाद, निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए पीसीआर क्लीनअप किट का उपयोग करके पुस्तकालयों को शुद्ध करें, एल्यूशन बफर के 25 माइक्रोलीटर में eluting।अनुक्रम एक अगली पीढ़ी के अनुक्रम पर तैयार पुस्तकालयों ४२,०,० की एक औसत पढ़ने की गहराई के लिए नमूना प्रति पढ़ता है । इस बेहतर ATAC-seq प्रोटोकॉल अनुक्रमण के लिए प्रति माइक्रोलीटर एक नैनोग्राम से अधिक की एक अंतिम पुस्तकालय का उत्पादन किया । गुणवत्ता नियंत्रण २०० और 1, 000 आधार जोड़े के बीच डीएनए टुकड़े दिखाया, और आगे अनुक्रमण इन उच्च गुणवत्ता वाले पुस्तकालयों के साथ किया गया था ।इस प्रोटोकॉल के बाद तैयार पुस्तकालयों में केवल 3% माइटोकॉन्ड्रियल संदूषण दिखाया गया। इस्सक reads का उच्च प्रतिशत जैविक प्रतिकृति में पर्याप्त रूप से स्थिर है। इस प्रोटोकॉल ने तकनीकी प्रतिकृति के साथ-साथ जैविक प्रतिकृति में अत्यधिक प्रजनन योग्य परिणाम प्रदान किए।इसके अतिरिक्त, इस प्रोटोकॉल में पहले वर्णित एक सप्ताह या उससे अधिक के बजाय 48 घंटे लगे, जिसके परिणामस्वरूप सुसंगत और कुशल सक्रियण हुआ, जैसा कि प्रजनन योग्य अनुक्रमण परिणामों द्वारा प्रदर्शित किया गया है। इसके अलावा, भविष्यवाणी की ATAC-seq चोटियों सही विश्लेषण पाइपलाइन द्वारा बुलाया गया । अनुक्रमण परिणाम विश्लेषण मानव टी सेल सक्रियण के दौरान क्रोमेटिन राज्य में स्पष्ट परिवर्तन से पता चला ।सक्रियण के पहले और ४८ घंटे बाद छह नमूनों के बीच खुले क्रोमेटिन के अंतर से सुलभ क्षेत्रों की पहचान की गई थी । सुनिश्चित करें कि नाभिक लाइसिस प्रतिक्रिया ठंडा अभिकर्णों और सामग्रियों के साथ किया जाता है, ताकि बरकरार नाभिक की वसूली को अधिकतम किया जा सके। हमारा संशोधित नाभिक लाइसिस बफर कोशिकाओं पर जेंटलर है, और माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए को दूषित करता है।हम इस संशोधित लाइसिस बफर को एकल-नाभिक ATAC-seq पर भी लागू करने के लिए तत्पर हैं। हम जानते हैं कि यह प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को कम लागत पर उच्च गुणवत्ता वाले ATAC-seq डेटा का उत्पादन करने की अनुमति देगा, जिससे एपिजेनेटिक क्षेत्र को आगे बढ़ाने में मदद मिलेगी। प्रोटोकॉल सीधा, तेजी से है, और किसी भी खतरनाक अभिकर्ची या उपकरणों की आवश्यकता नहीं है, यह आसानी से ATAC-seq के लिए नए उन लोगों के लिए सुलभ बना रही है ।

Research

JoVE Journal

Genetics

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

डिजाइन और एक कम लागत का उपयोग, बैक्टीरिया की अनुकूली विकास के लिए एंटीबायोटिक दवा चयन के तहत स्वचालित Morbidostat

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Edu धुंधला द्वारा ड्रोसोफिला एडल्ट अंडाशय में mitochondrial डीएनए प्रतिकृति के सीटू लेबलिंग में

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

राइबोसोमल डीएनए के आधार पर आरएनए नमूनों में डीएनए संदूषण का आकलन

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

मानचित्रण जीनोम-वाइड सुलभ क्रोमेटिन प्राथमिक मानव टी लिम्फोसाइटों में ATAC-Seq द्वारा

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Mitochondrial डीएनए मिथाइल का सटीक पता लगाने के लिए क्रियाविधि

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

आइसोलेटिंग, अनुक्रमण और मानव mesenchymal स्टेम कोशिकाओं से extracellular micrornas का विश्लेषण

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

Lentiviral मध्यस्थता जीन Silencing में मानव Peudoislet कम अनुलग्नक प्लेट्स में तैयार

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...

Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas

ट्यूमर मंडल व्युत्पत्ति और प्राथमिक ट्यूमर कोशिकाओं से उपचार माउस Rabdoyosarcomas से अलग

Rhabdomyosarcoma (RMS) is the most common soft tissue sarcoma in children. Although significant efforts have enabled the identification of common ...

Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues

माइक्रोसैटेलाइट डीएनए जेनोटाइपिंग और फ्लो साइटोमेट्री प्लॉयडी फॉर्मलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड हाइडाटिफॉर्म मोलर टिज़केस का विश्लेषण करता है।

Hydatidiform mole (HM) is an abnormal human pregnancy characterized by excessive trophoblastic proliferation and abnormal embryonic development. There are ...

3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells

मानव प्राथमिक कोशिकाओं में परमाणु वास्तुकला का अध्ययन करने के लिए 3डी बहुरंगी डीएनए मछली उपकरण

A major question in cell biology is genomic organization within the nuclear space and how chromatin architecture can influence processes such as gene ...