Name: atac-seq assay with low mitochondrial dna contamination from primary human cd4+ t lymphocytes
Uploaded: 2019-03-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes at JoVE.com

Ringraziamo Atsede Siba per il supporto tecnico. C.s.c. è supportato da NIH grant 1R61DA047032.

Questo protocollo migliorato fornisce istruzioni dettagliate per eseguire ATAC-seq di linfociti CD4 +, da materiale di partenza di sangue intero attraverso l'analisi dei dati (Figura 1).
1. isolamento di CD4 + cellule di T dal sangue intero
Nota: Il materiale di partenza per questo protocollo è 15 mL di sangue intero fresco raccolti utilizzando le procedure standard, permettendo l'origine della materia prima di essere se...

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	<li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin,+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position.">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li><li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATAC-seq:+A+Method+for+Assaying+Chromatin+Accessibility+Genome-Wide.">ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 21, 1-29 (2015).</li><li>Song, L., Crawford, G. 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Babraham Bioinformatics Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc</a> (2018)</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+ATAC-seq+protocol+reduces+background+and+enables+interrogation+of+frozen+tissues.">An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues.</a> Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+accessible+chromatin+in+mammalian+preimplantation+embryos.">The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos.</a> Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).</li></ol>

Il protocollo modificato di ATAC-seq presentato in questo articolo fornisce risultati riproducibili con contaminazione minima di DNA mitocondriale. Il protocollo è stato usato per con successo caratterizzano l'architettura della cromatina di umano primario PBMCs10, monociti umani, le cellule dendritiche (inedite) del mouse, e linee cellulari di melanoma coltivate11. Anticipiamo la lisi migliorata condizione ha il potenziale di lavorare per altri tipi di cellule pure. È an...

Il dosaggio per transposase-accessibile della cromatina sequenziamento (ATAC-seq) è rapidamente diventato il principale metodo per interrogare architettura della cromatina. ATAC-seq può identificare regioni di cromatina accessibile attraverso il processo di tagmentation, la frammentazione e la codifica di DNA con lo stesso enzima, per produrre le librerie con cui sequenziamento può determinare l'accessibilità cromatinica attraverso un intero genoma. Questo processo di tagmentation è mediato dalla transposase Tn5 iperattivo, che taglia solo regioni aperte della cromatina a causa di composti sterico. Come taglia, la transposase Tn5 inserisce anche schede di sequenziamento che consentono la costruzione della libreria rapida mediante PCR e sequenziamento di nuova generazione di cromatina accessibile genoma1,2.
ATAC-seq è diventato il metodo preferito per determinare aree di accessibilità della cromatina a causa del protocollo relativamente semplice e veloce, la qualità e la gamma di informazioni che possono essere determinati dai suoi risultati e la piccola quantità di materiale necessario di partenza. Rispetto a dnasi-seq3 (che misura anche l'accessibilità della cromatina genoma), MNase-seq4 (che determina posizioni nucleosoma nelle regioni del genoma aperto), e la formaldeide-mediata FAIRE-seq5, ATAC-seq è più veloce, più economico e più riproducibili1. È anche più sensibile, lavorando con materiale di minor come 500 nuclei, rispetto ai 50 milioni nuclei richiesti per dnasi-seq3di partenza. ATAC-seq ha anche la capacità di fornire ulteriori informazioni sull'architettura di cromatina rispetto ad altri metodi, comprese le regioni di legame del fattore di trascrizione, nucleosoma posizionamento e cromatina aperta regioni1. Efficace, unicellulare ATAC-seq protocolli sono stati convalidati, fornendo informazioni sull'architettura della cromatina al livello unicellulare6,7.
ATAC-seq è stato utilizzato per caratterizzare l'architettura della cromatina attraverso un ampio spettro di tipi di ricerca e cellule, tra cui piante8, esseri umani9e molti altri organismi. E ' stato anche critico nell'identificazione di regolazione epigenetica di malattia stati7. Tuttavia, il protocollo più diffuso di ATAC-seq include il grave inconveniente di letture di sequenziamento di contaminazione da DNA mitocondriale. In alcuni set di dati, questo livello di contaminazione può essere alto come il 60% di sequenziamento risultati1. C'è uno sforzo concertato nel campo per ridurre queste letture mitocondriale contaminanti al fine di consentire l'applicazione più efficiente di ATAC-seq7,10,11. Qui presentiamo un protocollo ATAC-seq migliorato che riduce il tasso di contaminazione di DNA mitocondriale ad appena il 3%, permettendo la riduzione del 50% circa nel sequenziamento costi10. Ciò è reso possibile da un processo semplificato di isolamento di linfociti CD4 + e l'attivazione e un buffer di lisi migliorata che è fondamentale per minimizzare la contaminazione del DNA mitocondriale.
Questo protocollo modifiedATAC-seq è stato convalidato con una vasta gamma di cellule primarie, tra cui primario del sangue periferico umano cellule mononucleari (PBMCs)10, monociti umani primari e le cellule dendritiche (inedite) del mouse. È anche stato utilizzato con successo per interrogare le linee cellulari di melanoma in uno schermo regolarmente interspaziati breve palindromi ripetizioni (CRISPR) cluster di non-codificazione elements11. Inoltre, il pacchetto di analisi dei dati descritto in questo protocollo e forniti su GitHub fornisce ai ricercatori nuovi ed esperti con strumenti per analizzare i dati ATAC-seq. ATAC-seq è il dosaggio più efficace per eseguire il mapping all'accessibilità cromatinica attraverso un intero genoma, e modifiche al protocollo esistente che vengono introdotti qui permetterà ai ricercatori di produrre dati di alta qualità con bassa contaminazione di DNA mitocondriale, riducendo i costi di sequenziamento e migliorando la velocità di ATAC-seq.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X PBS, Sterile</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5810/5810&#160;R Swing Bucket Refrigerated Centrifuge with 50 mL, 15 mL, and 1.5 mL Tube Buckets</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22625501</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Round Bottom Plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>163320</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 4200 Tape Station System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>374081</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>11131D</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>11346D</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamagnet</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Gemini Bio Products</td>
			<td>100-500</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>50674626</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2393</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute PCR Purification Kit (Buffer PB, Buffer PE, Elution Buffer)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext High Fidelity 2X PCR Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0541</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera DNA Library Preparation Kit (2X TD Buffer, Tn5 Enzyme)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC1211030</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free Sterile dH20</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10977015</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20 (Tween20)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A25780</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Water Bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TSGP02</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit FlouroMeter</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosette Sep Human CD4+ Density Medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>15705</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>15022</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Resevoir</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>8096-11</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermocycler with Heated Lid</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5941</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atac-seq assay with low mitochondrial dna contamination from primary human cd4+ t lymphocytes

ATAC-seq è diventata una metodologia ampiamente usata nello studio dell'epigenetica a causa del suo approccio rapido e semplice alla mappatura del genoma accessibile della cromatina. In questa carta presentiamo un protocollo ATAC-seq migliorato che riduce la contaminazione letture di DNA mitocondriale. Mentre precedente ATAC-seq protocolli hanno lottato con una media di 50% contaminando il DNA mitocondriale si legge, il buffer di lisi ottimizzato introdotto in questo protocollo riduce la contaminazione di DNA mitocondriale a una media del 3%. Questo protocollo di ATAC-seq migliorata consente una riduzione del 50% nei pressi del costo di sequenziamento. Dimostriamo come queste librerie di ATAC-seq di alta qualità possono essere preparate da linfociti CD4 + attivati, fornendo istruzioni dettagliate da CD4 + isolamento dei linfociti da sangue intero attraverso l'analisi dei dati. Questo protocollo di ATAC-seq migliorata è stata convalidata in una vasta gamma di tipi di cellule e sarà di immediata utilità per i ricercatori che studiano l'accessibilità della cromatina.

A partire da 15 mL di sangue intero fresco, questo protocollo genera una media di 1 milione di cellule T CD4 +. Questi possono essere congelati per la successiva elaborazione o utilizzati immediatamente. Vitalità delle cellule T CD4 +, fresche o scongelate, era costantemente > 95%. Questo metodo di isolamento delle cellule T CD4 + consente flessibilità nel tempo di materiale e raccolta di origine. Questo protocollo di ATAC-seq migliorato produce una raccolta finale di più maggior di 1 ...

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ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

Qui, presentiamo un protocollo per eseguire un test per transposase-accessibile della cromatina (ATAC-seq) la sequenziazione su linfociti CD4 + umani. Il protocollo è stato modificato per ridurre al minimo la contaminazione letture di DNA mitocondriale dal 50% al 3% attraverso l'introduzione di un nuovo buffer di lisi.

ATAC-seq analisi con DNA mitocondriale bassa contaminazione da primaria umana CD4 + linfociti T

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

Questo protocollo ATAC-seq modificato introduce un nuovo buffer di lisi che riduce le letture mitocondriali contaminanti dal 50% a meno del 3%La diminuzione della contaminazione mitocondriale consentirà ai ricercatori di eseguire ATAC-seq più efficienti con una diminuzione del 50% dei costi di sequenziamento. Abbiamo convalidato questo nuovo protocollo ATAC-seq nei PBPC primari umani, nei monociti primari umani, nelle cellule dendritiche del topo e nelle linee cellulari del melanoma. Crediamo che sarà efficace in una vasta gamma di tipi di cellule.Ridurre al minimo la perdita di campioni durante il processo di attivazione e selezione delle celle è fondamentale per ottenere risultati di alta qualità con ATAC-seq. Dimostreremo come gestire un piccolo numero di cellule da campioni preziosi utilizzando attrezzature di laboratorio di base. Per iniziare, scongelare una fiala di cellule CD4+T precedentemente isolate in un bagno d'acqua Celsius di 37 gradi fino a quando il ghiaccio non si è appena sciolto.Quindi trasferire delicatamente le cellule in un tubo conico da 15 millilitri contenente nove millilitri di RPMI completo pre-riscaldato. Centrifugare le cellule a 1.500 volte G e quattro gradi Celsius, per sei minuti. Quindi scartare il supernatante e rimescolare delicatamente il pellet in due millilitri di RPMI completo.Dopo aver ripetuto la centrifugazione, scartare il supernatante e rimescolare delicatamente le cellule in 0,5 millilitri di RPMI completo. Usa un emocitometro per contare le cellule. Utilizzando l'RPMI completo, regolare la densità delle sospensioni cellulari sulla piastra 50.000 CD4 + celle in 200 microlitri per pozzo di una piastra inferiore rotonda da 96 po '.Quindi, per preparare perline magnetiche, aliquote 12,5 microlitri di perline Human T-Activator CD3/CD28 per campione ATAC-seq su un tubo da 1,5 millilitri. Aggiungere un millilitro di 1x PBS al tubo e posizionarlo su un magnete per un minuto per lavare le perline. Rimuovere e scartare con cura il supernatante trasparente e rimuovere il tubo dal magnete.Riprendono le perline in 13 microlitri di RPMI completo per campione ATAC-seq. Per attivare le celle CD4+T con la concentrazione regolata, raccogliere 500.000 celle in 2,1 millilitri di mezzo RPMI completo in un tubo conico da 15 millilitri. Aggiungere 12,5 microlitri di perline Human T-Activator, preparati e lavati nei passaggi precedenti e mescolare delicatamente invertendo il tubo.Quindi trasferire delicatamente le cellule, con perline, in un serbatoio sterile. Utilizzando una pipetta multicanale, placcare 200 microlitri di cellule con perline per pozzo di una piastra a 96 po 'a fondo tondo e incubare in un incubatore di 37 gradi Celsius, 5%CO2 per 48 ore. Dopo l'incubazione completa, centrifugare la piastra a 423 volte G e la temperatura ambiente, per otto minuti.Rimuovere 100 microlitri di mezzo da ogni pozzo e raccoglierlo in un tubo conico prima di scartare, al fine di confermare nessuna perdita di perline. Quindi rimospendre il pellet cellulare nei restanti 100 microlitri di mezzo e raccogliere tutto in un tubo da 1,5 millilitri. Per isolare le celle CD4+, aggiungere 50 microlitri di perline coniugate CD4 prelavate a 500.000 celle in un millilitro di RPMI completo e invertire la miscela.Incubare per 20 minuti a quattro gradi Celsius, mentre si svolazza a mano ogni sei minuti per mescolare. Posizionare il tubo sul magnete per due minuti, fino a quando il supernatante non è chiaro, quindi rimuovere e scartare. Rimuovere il tubo dal magnete.Lavare le celle legate alle perline riutilizzandole in un millilitro di PBS, più il 2%FCS, e riposizionare il tubo sul magnete per un minuto. Scartare il supernatante chiaro e ripetere questo processo per un totale di tre lavaggi. Dopo il lavaggio finale, posizionare il tubo sul magnete per un minuto.Rimuoverlo, scartare il supernatante e posizionare il pellet sul ghiaccio. Successivamente, per eseguire l'isolamento dei nuclei, rimescolare le perline e le cellule in 50 microlitri di tampone di lysis fredda e centrifugare immediatamente a 500 G, quattro gradi Celsius, per 10 minuti. Rimuovere e scartare il supernatante.Per eseguire la reazione trasposasi, rimescolare il pellet di nuclei isolati con 50 microlitri di miscela di trasposasi Tn5. Incubare in un termociclo per 30 minuti a 37 gradi Celsius, con il coperchio impostato su 40 gradi Celsius, quindi tenere a quattro gradi Celsius al termine. Subito dopo il termociclismo, eseguire un rapido spin-down di centrifuga da banco.Posizionare il tubo sul magnete per un minuto per rimuovere le perline dal prodotto. Senza rimuovere il tubo dal magnete, trasferire il supernatante trasparente in una colonna di purificazione del DNA. Lavare la colonna una volta con 250 microlitri di tampone PB e due volte con 750 microlitri di tampone PE.Quindi aggiungere 10 microlitri di tampone di eluizione per eludere il campione. Impostare la reazione di amplificazione PCR iniziale in un tubo PCR privo di nucleasi. Posizionare il tubo PCR nel termociclo e eseguire il programma di amplificazione PCR.Quindi completare l'amplificazione FINALE PCR dei restanti 45 microlitri di reazione PCR, come descritto nel manoscritto. Posizionare il tubo PCR nel termociclo e eseguire il programma. Dopo l'amplificazione completa, purificare le librerie utilizzando un kit di pulizia PCR, seguendo il protocollo del produttore, eluindo in 25 microlitri del buffer di eluizione.Sequenziare le librerie preparate su un sequencer di nuova generazione a una profondità di lettura media di 42 milioni di letture per campione. Questo protocollo ATAC-seq migliorato produsse una libreria finale di più di un nanogrammo per microlitro per sequenziamento. Il controllo di qualità ha mostrato frammenti di DNA tra le 200 e le 1.000 coppie di basi, e un ulteriore sequenziamento è stato eseguito con queste librerie di alta qualità.Le librerie preparate a seguito di questo protocollo hanno mostrato solo il 3% di contaminazione mitocondriale. L'alta percentuale di letture utilizzabili è sufficientemente costante tra le repliche biologiche. Questo protocollo ha fornito risultati altamente riproducibili tra repliche tecniche, nonché repliche biologiche.Inoltre, questo protocollo ha richiesto 48 ore, anziché una settimana o più come descritto in precedenza, con conseguente attivazione coerente ed efficiente, come dimostrato dai risultati di sequenziamento riproducibili. Inoltre, i picchi di ATAC-seq previsti sono stati accuratamente chiamati dalla pipeline di analisi. L'analisi dei risultati di sequenziamento ha rivelato chiari cambiamenti nello stato della cromatina durante l'attivazione delle cellule T umane.Le regioni differenziali accessibili della cromatina aperta sono state identificate tra sei campioni prima e 48 ore dopo l'attivazione. Assicurarsi che la reazione di llisi dei nuclei sia eseguita con reagenti e materiali refrigerati, al fine di massimizzare il recupero di nuclei intatti. Il nostro tampone di lisi dei nuclei modificato è più delicato sulle cellule e riduce al minimo la contaminazione del DNA mitocondriale.Attendiamo con impazienza che questo tampone di lisi modificato venga applicato anche ai singoli nuclei ATAC-seq. Sappiamo che questo protocollo consentirà ai ricercatori di produrre dati ATAC-seq di qualità superiore a un costo ridotto, contribuendo a inoltrare il campo epigenetico. Il protocollo è semplice, rapido e non richiede reagenti o strumenti pericolosi, rendendolo facilmente accessibile a coloro che sono nuovi ad ATAC-seq.

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Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Metodologia per la rilevazione accurata di metilazione del DNA mitocondriale

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Isolare, sequenziamento e analisi dei microRNA extracellulari dalle cellule staminali mesenchimali umane

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

Lentiviral mediato gene silenziamento in pseudoislet umano preparato in piastre a basso attaccamento

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...

Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas

Derivazione della sfera di tumore e trattamento da cellule tumorali primarie isolate da Rhabdomyosarcomas del topo

Rhabdomyosarcoma (RMS) is the most common soft tissue sarcoma in children. Although significant efforts have enabled the identification of common ...

Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues

Pulitura del DNA microsatellite e citometria di flusso Ploidy Analisi dei tessuti molari Molari Molari Molar fissati di paraffino fissati in parina

Hydatidiform mole (HM) is an abnormal human pregnancy characterized by excessive trophoblastic proliferation and abnormal embryonic development. There are ...

3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells

3D Multicolor DNA FISH Tool per studiare l'architettura nucleare nelle cellule primarie umane

A major question in cell biology is genomic organization within the nuclear space and how chromatin architecture can influence processes such as gene ...