Name: atac-seq assay with low mitochondrial dna contamination from primary human cd4+ t lymphocytes
Uploaded: 2019-03-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes at JoVE.com

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この改良されたプロトコルは、データ解析 (図 1) による全血の原料から cd4 陽性リンパ球の ATAC seq を実行するための手順を説明します。
1. 全血からの cd 4 + T 細胞の分離
注:このプロトコルのための開始材料は研究の要件に基づいて選択する開始材料の源の標準手続きを使用して収集した新鮮な全血の 15 mL です。必要...

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	<li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin,+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position.">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li><li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATAC-seq:+A+Method+for+Assaying+Chromatin+Accessibility+Genome-Wide.">ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 21, 1-29 (2015).</li><li>Song, L., Crawford, G. 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この記事で紹介した修正の ATAC seq プロトコルは、最小限のミトコンドリア DNA 汚染で再現性のある結果を提供します。人間プライマリ PBMCs10、ひと単球 (未発表) マウス樹状細胞のクロマチン アーキテクチャの特性し、培養メラノーマ細胞線11正常にプロトコルが使用されています。この改良の換散を見込んで条件他のセルタイプのために働く可能性があり?...

トランスポザーゼ アクセス クロマチン (ATAC seq) をシーケンス用急速にクロマチン アーキテクチャを尋問のため主要な方法となっています。ATAC seq は tagmentation、断片化、シーケンスが全ゲノムにわたってクロマチン アクセシビリティを判断できますライブラリを生成する、同じ酵素によって DNA のタグ付けのプロセスを介してアクセス可能なクロマチン領域を識別できます。この tagmentation プロセスは、のみ nucleosomic 立体障害によるクロマチンの開いている領域をカット非常に活発の Tn5 トランスポサーゼによって媒介されます。それはカット、Tn5 トランスポザーゼはまたを可能にする PCR による迅速なライブラリ構築およびゲノムワイド アクセス クロマチン1,2次世代シーケンス シーケンス アダプターを挿入します。
ATAC seq クロマチン アクセシビリティ比較的単純で高速なプロトコル、品質とその結果、および開始に必要な材料の少量から判断できる情報の範囲のための領域を特定する最寄りの方法となっています。MNase seq4 (オープン ゲノム領域のヌクレオソームの位置が決まります)、(これはまたゲノム クロマチン接近性を測定) DNase seq3と比較して、ホルムアルデヒドを介した FAIRE seq5、ATAC seq はより速く、安く、そして再現性1。また、出発の数として DNase seq3に必要な 5000 万の核と比較して 500 の核物質の使用より敏感です。ATAC seq クロマチン アーキテクチャの詳細については、転写因子結合、ヌクレオソームの配置、クロマチン領域1の地域を含む他の方法よりもを提供することがあります。効果的な単一セルの ATAC seq プロトコルが検証されて、単一細胞レベル6,7クロマチン アーキテクチャに関する情報の提供します。
ATAC seq はクロマチン アーキテクチャを特徴づける植物8人間9、および他の多くの有機体を含む研究と細胞のタイプの広い範囲にわたって使用されています。また病気状態7のエピジェネティック制御を識別するに重要だった。しかし、最も広く使用されている ATAC seq プロトコルには、ミトコンドリア DNA から汚染シーケンス読み込みの主な欠点が含まれています。一部のデータ セットでこの汚染レベルは配列結果1の 60% と高いすることができます。ATAC seq7,10,11のより効率的なアプリケーションを可能にするためにこれらの汚染のミトコンドリアの読み取りを削減するフィールドに協調された努力があります。ご紹介わずか 3% にミトコンドリアの DNA 混入率を減らす向上の ATAC seq プロトコル シーケンス コスト10で約 50% の削減をできるようにします。これはミトコンドリアの DNA 汚染を最小限に抑える重要な改善の換散バッファーと活性化 cd 4 + リンパ球の隔離の合理化されたプロセスによって可能です。
この modifiedATAC seq プロトコルは、初代培養細胞、ひとの主な末梢血単核球 (PBMCs)10、人間の主要な球 (未発表) マウス樹状細胞などの広い範囲で検証されています。要素の非コード11クラスター化定期的に空間の短い回文繰り返し (CRISPR) 画面の悪性黒色腫細胞を尋問する正常にそれ使用されているも。さらに、このプロトコルで記述されている、GitHub 上で提供されるデータ分析パッケージは、ATAC seq データを分析するツールと新しいと経験豊富な研究者を提供します。ATAC seq クロマチン接近性を全体のゲノム全体マップに最も効果的な試金、ここで紹介されている既存のプロトコルに変更になります低のミトコンドリア DNA 汚染と高品質なデータを生成する研究者シーケンス処理のコストを削減し、ATAC seq のスループットの向上します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X PBS, Sterile</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5810/5810&#160;R Swing Bucket Refrigerated Centrifuge with 50 mL, 15 mL, and 1.5 mL Tube Buckets</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22625501</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Round Bottom Plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>163320</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 4200 Tape Station System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>374081</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>11131D</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>11346D</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamagnet</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Gemini Bio Products</td>
			<td>100-500</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>50674626</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2393</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute PCR Purification Kit (Buffer PB, Buffer PE, Elution Buffer)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext High Fidelity 2X PCR Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0541</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera DNA Library Preparation Kit (2X TD Buffer, Tn5 Enzyme)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC1211030</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free Sterile dH20</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10977015</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20 (Tween20)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A25780</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Water Bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TSGP02</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit FlouroMeter</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosette Sep Human CD4+ Density Medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>15705</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>15022</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Resevoir</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>8096-11</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermocycler with Heated Lid</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5941</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atac-seq assay with low mitochondrial dna contamination from primary human cd4+ t lymphocytes

ATAC seq ゲノムワイド アクセス クロマチンのマッピングへの迅速かつ簡単なアプローチによるエピジェネティクスの研究で広く使われている方法論となっています。本稿ではミトコンドリア DNA の読み取りを汚染を減らす向上の ATAC seq プロトコルを提案する.以前の ATAC seq プロトコルに苦労している間ミトコンドリア DNA の汚染 50% の平均を読み取ると、この議定書で導入された最適化された換散バッファー 3% の平均にミトコンドリア DNA の汚染を軽減します。この改良の ATAC seq プロトコルは、シーケンシング コストに近い 50% 削減できます。データの分析を通じて全血からの cd 4 + リンパ球の隔離からのステップバイ ステップの手順を提供する活性化 cd4 リンパ球からこれらの高品質の ATAC seq ライブラリを準備できる方法を紹介します。改良されたこの ATAC seq プロトコルは細胞のタイプの広い範囲で検証されている、クロマチン接近性を勉強して研究者にすぐに使用されます。

新鮮な全血の 15 mL からは、このプロトコルは 100 万の cd4 陽性 T 細胞の平均を生成します。これらは、後で処理するため冷凍またはすぐに使用できます。新鮮なまたは解凍、cd 4 + T 細胞の生存率は一貫して > 95%。Cd4 陽性 T 細胞分離のこの方法は、柔軟性、ソースの材料とコレクションの時間この改良の ATAC seq プロトコル シーケンスの 1 ng/μ L を超える最後のライブラ...

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ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

ここでは、活性化 cd4 人間リンパ球を (ATAC seq) をシーケンス処理トランスポザーゼ アクセス クロマチンのアッセイを実行するプロトコルを提案します。プロトコルは、新しい換散バッファーの導入により 3% に 50% からミトコンドリア DNA の読み取りの汚染を最小限に変更されています。

主なヒト cd4 陽性 T リンパ球から低ミトコンドリア DNA 汚染 ATAC seq 試金

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

この改変ATAC-seqプロトコルは、ミトコンドリアの汚染読み取りを50%から3%未満に減少させる新しいリシスバッファーを導入し、ミトコンドリア汚染の減少により、研究者はシーケンシングコストの50%減少でより効率的なATAC-seqを実行することができます。我々は、ヒトの一次PBMC、ヒト一次単球、マウス樹状細胞、および黒色腫細胞株におけるこの新しいATAC-seqプロトコルを検証した。幅広い細胞種に効果があると考えています。ATAC-seqを使用して高品質の結果を得るためには、細胞の活性化および選択プロセス中のサンプル損失を最小限に抑えることは重要です。基本的な実験装置を用いて、貴重なサンプルから少数の細胞を扱う方法を実演します。まず、氷が溶けるまで、以前に単離されたCD4+T細胞のバイアルを37°Cの水浴で解凍します。その後、細胞を9ミリリットルの完全RPMIを含む15ミリリットルの円錐管にそっと移します。細胞を1、500倍G、摂氏4度で6分間遠心分離する。その後、上清を捨て、完全なRPMIの2ミリリットルにペレットを穏やかに再懸濁する。遠心分離を繰り返した後、上清を捨て、完全なRPMIの0.5ミリリットルで細胞を穏やかに再懸濁する。細胞を数えるために、ヘモサイトメーターを使用してください。完全なRPMIを使用して、96ウェルの丸底プレートのウェルあたり200マイクロリットルの50,000 CD4+セルに細胞懸濁密度を調整します。次いで、磁気ビーズを調製し、1.5ミリリットルチューブに対して1.5ミリリットルのチューブに対して、ヒトT-アクティベーターCD3/CD28ビーズのアリコート12.5マイクロリットルをATAC-seqサンプルに調製した。1倍のPBSをチューブに1ミリリットル加え、磁石の上に1分間置いてビーズを洗います。清澄上清を慎重に取り出して捨て、マグネットからチューブを取り出します。ATAC-seqサンプル当たり完全なRPMIの13マイクロリットルでビーズを再懸濁します。調整された濃度でCD4+T細胞を活性化するには、15ミリリットルの円錐管に完全なRPMI培地の2.1ミリリットルで500,000細胞を集める。12.5マイクロリットルのヒトT-アクティベータービーズを追加し、前のステップで調製して洗浄し、チューブを反転して穏やかに混合します。その後、ビーズで細胞を滅菌貯蔵所に静かに移します。マルチチャネルピペットを使用して、ラウンドボトム96ウェルプレートのウェルあたりビーズを含む200マイクロリットルのセルをプレートし、37°C、5%CO2インキュベーターで48時間インキュベーターします。完全なインキュベーションの後、423倍Gでプレートを遠心分離し、室温を8分間処理する。各ウェルから100マイクロリットルの培地を取り出し、ビーズの損失を確認するために、廃棄する前に円錐形のチューブに集めます。次に、培地の残りの100マイクロリットルの細胞ペレットを再懸濁し、1.5ミリリットルのチューブにすべてを集める。CD4+細胞を単離するには、完全なRPMIの1ミリリットルで500,000個の細胞にあらかじめ洗浄されたCD4コンジュゲートビーズ50マイクロリットルを加え、反転して混合します。摂氏4度で20分間インキュベートし、6分ごとに手でフリックして混ぜます。上清がはっきりするまでチューブをマグネットに2分間置き、取り出して捨てます。マグネットからチューブを取り外します。ビーズ結合細胞をPBSの1ミリリットルに加えて2%FCSで再懸濁して洗浄し、チューブを磁石に1分間戻します。透明な上清を捨て、このプロセスを合計3回の打ち上げに繰り返します。最後の洗浄の後、マグネットにチューブを1分間置きます。それを取り除き、上清を捨て、ペレットを氷の上に置きます。次に、核単離を行うために、50マイクロリットルの冷たいリシスバッファーでビーズおよび細胞を再懸濁し、遠心分離機を500G、摂氏4度で直ちに10分間再懸濁する。上清を取り除き、捨てます。トランスポザーゼ反応を行うために、分離された核ペレットを50マイクロリットルのTn5トランスポザーゼミックスで再懸濁する。サーモサイクラーで摂氏37度で30分間インキュベートし、蓋を摂氏40度に設定し、完成したら摂氏4度で保持します。サーモサイクリングの直後に、素早いベンチトップ遠心分離機のスピンダウンを行います。チューブをマグネットに1分間置き、ビーズを製品から取り除きます。マグネットからチューブを取り外さずに、透明な上清をDNA精製カラムに移します。250マイクロリットルのPBバッファーでカラムを1回洗浄し、750マイクロリットルのPEバッファーで2回洗浄します。その後、溶出バッファーの 10 マイクロリットルを追加して、サンプルを溶出します。ヌクレアーゼを含まない PCR チューブに初期 PCR 増幅反応を設定します。PCR チューブをサーモサイクラーに入れ、PCR 増幅プログラムを実行します。次に、原稿に記載されているように、残りの45マイクロリットルのPCR反応の最終的なPCR増幅を完了する。PCR チューブをサーモサイクラーに入れ、プログラムを実行します。完全な増幅後、PCRクリーンアップキットを使用してライブラリを浄化し、メーカーのプロトコルに従い、溶出バッファーの25マイクロリットルで溶出します。サンプルごとに平均読み取り深さ 4,200 万読み込みまで、次世代シーケンサー上の準備済みライブラリをシーケンスします。この改良されたATAC-seqプロトコルは、シーケンシング用にマイクロリットル当たり1ナノグラム以上の最終ライブラリを生成した。品質管理は、200と1,000塩基対の間のDNA断片を示し、さらにシーケンシングは、これらの高品質のライブラリで行われました。このプロトコルに従って作製されたライブラリーは、わずか3%ミトコンドリア汚染を示した。使用できる読み取りの高い割合は、生物学的複製全体で十分に一定です。このプロトコルは、生物学的複製だけでなく、技術的な複製全体にわたって非常に再現性の高い結果を提供しました。さらに、このプロトコルは、前述のように1週間以上ではなく48時間かかり、再現可能なシーケンスの結果によって示されるように、一貫した効率的な活性化をもたらしました。さらに、予測されたATAC-seqピークは、分析パイプラインによって正確に呼び出されました。シーケンシング結果分析は、ヒトT細胞活性化中のクロマチン状態の明確な変化を明らかにした。開いたクロマチンの差動可能な領域は、活性化の前と48時間後の6つのサンプルの間で同定された。核の回収を最大限にするため、核の反応を冷やされた試薬と材料で行ってください。当社の修飾核リシスバッファーは、細胞に優しく、ミトコンドリアDNAの汚染を最小限に抑えます。この改変されたライシスバッファーが単核ATAC-seqにも適用されることを楽しみにしています。このプロトコルは、研究者がコストを削減して高品質のATAC-seqデータを生成し、エピジェネティック分野を前進させるのに役立つことを知っています。このプロトコルは簡単で迅速で、危険な試薬や機器を必要としないため、ATAC-seqに新しい人にとっては簡単にアクセスできます。

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Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas

マウス横紋筋肉腫から単離された原発性腫瘍細胞からの腫瘍球誘導と治療

Rhabdomyosarcoma (RMS) is the most common soft tissue sarcoma in children. Although significant efforts have enabled the identification of common ...

Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues

ホルマリン固定パラフィン埋め込みヒダチジフォームモル組織のマイクロサテライトDNAジェノタイピングとフローサイトメトリープロイディ解析

Hydatidiform mole (HM) is an abnormal human pregnancy characterized by excessive trophoblastic proliferation and abnormal embryonic development. There are ...

3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells

ヒト初等細胞の核アーキテクチャを研究する3D多色DNA FISHツール

A major question in cell biology is genomic organization within the nuclear space and how chromatin architecture can influence processes such as gene ...