Name: atac-seq assay with low mitochondrial dna contamination from primary human cd4+ t lymphocytes
Uploaded: 2019-03-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes at JoVE.com

우리는 기술 지원에 대 한 Atsede Siba를 감사합니다. C.S.C.는 NIH 그랜트 1R61DA047032에 의해 지원 됩니다.

이 향상 된 프로토콜 데이터 분석 (그림 1)을 통해 전체 혈액의 시작 물자에서 CD4 + 세포의 ATAC seq를 수행 하기 위한 단계별 지침을 제공 합니다.
1. 전체 혈액에서 CD4 + T 세포의 고립
참고: 이 프로토콜에 대 한 시작 물자는 선정 될 시작 물자의 소스 연구 요구 사항에 따라 수 있도록 표준 절차를 사용 하 여 수집 하는 신선?...

<ol>
	<li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin,+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position.">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li><li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATAC-seq:+A+Method+for+Assaying+Chromatin+Accessibility+Genome-Wide.">ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 21, 1-29 (2015).</li><li>Song, L., Crawford, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNase-seq:+a+high-resolution+technique+for+mapping+active+gene+regulatory+elements+across+the+genome+from+mammalian+cells.">DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (2), (2010).</li><li>Pajoro, A., Mui&#241;o, J. M., Angenent, G. C., Kaufmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+Nucleosome+Occupancy+by+MNase-seq:+Experimental+Protocol+and+Computational+Analysis.">Profiling Nucleosome Occupancy by MNase-seq: Experimental Protocol and Computational Analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1675, 167-181 (2018).</li><li>Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAIRE+(Formaldehyde-Assisted+Isolation+of+Regulatory+Elements)+isolates+active+regulatory+elements+from+human+chromatin.">FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin.</a> Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).</li><li>Rosenberg, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+profiling+of+the+developing+mouse+brain+and+spinal+cord+with+split-pool+barcoding.">Single-cell profiling of the developing mouse brain and spinal cord with split-pool barcoding.</a> Science. 360 (6385), 176-182 (2018).</li><li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-specific+and+single-cell+chromatin+accessibility+charts+human+hematopoiesis+and+leukemia+evolution.">Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution.</a> Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).</li><li>Lu, Z., Hofmeister, B. T., Vollmers, C., DuBois, R. M., Schmitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+ATAC-seq+with+nuclei+sorting+for+discovery+of+cis-regulatory+regions+in+plant+genomes.">Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes.</a> Nucleic Acids Research. 45 (6), e41 (2017).</li><li>Lara-Astiaso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+state+dynamics+during+blood+formation.">Chromatin state dynamics during blood formation.</a> Science. 345 (6199), 943-949 (2014).</li><li>Gate, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+determinants+of+co-accessible+chromatin+regions+in+activated+T+cells+across+humans.">Genetic determinants of co-accessible chromatin regions in activated T cells across humans.</a> Nature Genetics. , (2018).</li><li>Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+interrogation+of+functional+elements+in+the+noncoding+genome.">High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome.</a> Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).</li><li>. FastQC A Quality Control tool for High Throughput Sequence Data. Babraham Bioinformatics Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc</a> (2018)</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+ATAC-seq+protocol+reduces+background+and+enables+interrogation+of+frozen+tissues.">An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues.</a> Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+accessible+chromatin+in+mammalian+preimplantation+embryos.">The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos.</a> Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).</li></ol>

이 문서에 제공 된 수정된 ATAC seq 프로토콜 최소한의 미토 콘 드리 아 DNA 오염 재현 가능한 결과를 제공 합니다. 프로토콜이 되었습니다 사용 성공적으로 인간의 기본 PBMCs10, 인간 monocytes, (미 출판), 마우스 수지상 세포의 염색 질 건축 특징 및 교양된 흑색 종 세포 라인11. 우리는이 향상 된 세포 예상 상태 뿐만 아니라 다른 세포 유형 대 일 가능성이 있다. 그것 ?...

Transposase 액세스할 수 chromatin (ATAC-seq)을 시퀀싱에 대 한 분석 결과 빠르게 chromatin 구조 질의 대 한 주요 방법 되고있다. ATAC seq tagmentation, 분할 및 라이브러리는 시퀀싱 전체 게놈에서 chromatin 내게 필요한 옵션 확인 수를 생산 하는 동일한 효소에 의해 DNA의 태그의 과정을 통해 액세스할 수 있는 chromatin의 영역을 식별할 수 있습니다. 이 tagmentation 과정만 인하 nucleosomic 입체 지 장 때문 chromatin의 오픈 지역 활동적인 Tn5 transposase에 의해 중재 됩니다. 그것은 삭감으로 Tn5 transposase를 PCR에 의해 빠른 라이브러리 건설과 게놈 넓은 접근 chromatin1,2의 다음-세대 시퀀싱 시퀀싱 어댑터를 삽입 합니다.
ATAC seq 비교적 간단 하 고 빠른 프로토콜, 품질 및 그 결과, 그리고 시작 물자 필요의 작은 금액에서 결정 될 수 있는 정보의 범위 chromatin 접근성의 영역을 결정 하기 위해 선호 되는 방법 되고있다. 비해 DNase seq3 (는 또한 게놈 넓은 chromatin 접근성), MNase-seq4 (오픈 게놈 지역에 nucleosome 위치 결정), 그리고 포름알데히드 중재 시 키-seq5, ATAC seq 빠릅니다, 저렴 하 고 쉽게 재현 가능한1. 그것은 또한 더 중요 한 시작 물자의 500 핵, DNase seq3에 필요한 50 백만 핵에 비해 몇 가지 작업. ATAC seq는 또한 전사 인자 바인딩, nucleosome 위치, 및 오픈 chromatin 지역1의 영역을 포함 하 여 다른 방법 보다 chromatin 아키텍처에 대 한 자세한 정보를 얻을 수가 있다. 효과적인, 단일 셀 ATAC seq 프로토콜은 유효성이 검증, 단일 셀 레벨6,7chromatin 구조에 정보를 제공.
ATAC seq 식물8, 인간9, 그리고 다른 많은 유기 체를 포함 한 연구와 세포 종류의 넓은 스펙트럼에 걸쳐 chromatin 아키텍처의 특성에 사용 되었습니다. 그것은 또한 질병 상태7의 후 성적인 규칙 식별에 중요 한 되었습니다. 그러나, 가장 널리 사용 되는 ATAC seq 프로토콜 오염 시퀀싱 읽기 미토 콘 드리 아 DNA의 주요 단점은 포함합니다. 일부 데이터 집합에서이 오염 수준 시퀀싱 결과1의 60% 만큼 높을 수 있다. ATAC seq7,,1011의 더 효율적인 응용 프로그램을 허용 하려면 이러한 오염 미토 콘 드 리아 읽기를 줄이기 위해 필드에 공동된 노력이입니다. 여기 우리 현재 3%, 미토 콘 드리 아 DNA 오염 속도 감소 시키는 작업을 처리 하는 향상 된 ATAC seq 프로토콜 시퀀싱 비용10에서 약 50%의 감소를 허용 합니다. 이것은 CD4 + 림프 구 분리 및 활성화 및 미토 콘 드리 아 DNA 오염 최소화에 중요 한 향상 된 세포의 용 해 버퍼의 유선형된 과정에 의해 이루어집니다.
이 modifiedATAC-seq 프로토콜은 다양 한 인간의 기본 주변 혈액 단 세포 (PBMCs)10, 인간의 기본 monocytes 그리고 마우스 수지상 세포 (미 발표)을 포함 하 여 기본 셀 유효성이 검증 되었습니다. 그것은 또한 사용 되었습니다 성공적으로 비 코딩 요소11의 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR) 화면에서 흑색 종 세포 라인이. 또한,이 프로토콜에서 설명 하 고 GitHub에 제공 된 데이터 분석 패키지 제공 새로운 경험과 연구를 도구 ATAC seq 데이터를 분석 합니다. ATAC seq 전체 게놈에서 chromatin 접근성을 매핑하는 데 가장 효과적인 분석 결과 이며 여기에 도입 된 기존 프로토콜에 대 한 수정 연구원 낮은 미토 콘 드리 아 DNA 오염, 높은-품질 데이터를 생성 하면 시퀀싱 비용을 절감 하 고 ATAC seq 처리량을 개선.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X PBS, Sterile</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5810/5810&#160;R Swing Bucket Refrigerated Centrifuge with 50 mL, 15 mL, and 1.5 mL Tube Buckets</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22625501</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Round Bottom Plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>163320</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 4200 Tape Station System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>374081</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>11131D</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>11346D</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamagnet</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Gemini Bio Products</td>
			<td>100-500</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>50674626</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2393</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute PCR Purification Kit (Buffer PB, Buffer PE, Elution Buffer)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext High Fidelity 2X PCR Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0541</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera DNA Library Preparation Kit (2X TD Buffer, Tn5 Enzyme)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC1211030</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free Sterile dH20</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10977015</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20 (Tween20)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A25780</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Water Bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TSGP02</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit FlouroMeter</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosette Sep Human CD4+ Density Medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>15705</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>15022</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Resevoir</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>8096-11</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermocycler with Heated Lid</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5941</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atac-seq assay with low mitochondrial dna contamination from primary human cd4+ t lymphocytes

ATAC seq 신속 하 고 간단한 접근 방식 게놈 넓은 접근 chromatin 매핑 때문에 epigenetics의 연구에 널리 사용 되는 방법론 되고있다. 이 문서에서 우리는 미토 콘 드리 아 DNA 읽기 오염 감소 하는 향상 된 ATAC seq 프로토콜 제시. 이 프로토콜에 최적화 된 세포의 용 해 버퍼 감소 3%의 평균에 미토 콘 드리 아 DNA 오염 이전 ATAC seq 프로토콜 분투 하는 동안 50% 오염 미토 콘 드리 아 DNA의 평균이 읽습니다. 이 향상 된 ATAC seq 프로토콜 시퀀싱 비용에 가까운 50% 감소를 허용 한다. 시연 어떻게이 높은-품질 ATAC seq 라이브러리 활성화 된 CD4 + 세포에서 준비 될 수 있다 데이터 분석을 통해 전체 혈액에서 CD4 + 림프 구 분리에서 단계별 지침을 제공 합니다. 이 향상 된 ATAC seq 프로토콜 다양 한 셀 형식에에서 검증은 고 chromatin 접근성을 공부 하는 연구원에 즉시 사용 될 것입니다.

신선한 전 혈의 15 mL에서이 프로토콜 1 백만 CD4 + T 세포의 평균을 생성합니다. 이들은 나중에 처리에 대 한 동결 하거나 즉시 사용 될 수 있습니다. 신선한 또는 해 동, CD4 + T 세포의 생존 능력은 일관 되 게 > 95%. CD4 + T 세포 고립의이 메서드는 소스 재료와 컬렉션 시간에 유연성에 대 한 수 있습니다. 이 향상 된 ATAC seq 프로토콜 시퀀싱 µ 1 ng/L 보다 큰 마지막 라이브러리를 ?...

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ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

여기, 우리는 transposase 액세스할 수 chromatin (ATAC-seq) 활성화 된 CD4 + 인간 림프 톨에 시퀀싱에 대 한 분석 결과 수행 하는 프로토콜을 제시. 프로토콜은 새로운 세포의 용 해 버퍼의 도입을 통해 3%로 50%에서 미토 콘 드리 아 DNA 읽기 오염 최소화 하기 위해 수정 되었습니다.

ATAC seq 분석 결과 주 인간의 CD4 + T 세포에서 낮은 미토 콘 드리 아 DNA 오염

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

이 수정된 ATAC-seq 프로토콜은 미토콘드리아 판독을 50%에서 3% 미만으로 감소시키는 새로운 용해 완충제에 도입되어 미토콘드리아 오염이 감소하여 연구원이 시퀀싱 비용의 50% 감소로 보다 효율적인 ATAC-seq를 수행할 수 있게 합니다. 우리는 인간 1 차적인 PBMC, 인간 1 차적인 단핵구, 마우스 수지상 세포 및 흑색종 세포 주에 있는 이 새로운 ATAC-seq 프로토콜을 검증했습니다. 우리는 그것이 세포 모형의 넓은 범위에서 효과적일 것이라고 믿습니다.세포 활성화 및 선택 프로세스 중 샘플 손실을 최소화하는 것은 ATAC-seq로 고품질 결과를 얻는 데 매우 중요합니다. 우리는 기본 실험실 장비를 사용하여 귀중한 견본에서 세포의 작은 수를 취급하는 방법을 보여줄 것입니다. 먼저 이전에 격리된 CD4+T 셀의 유리병을 37도 의 수조에서 해동하여 얼음이 녹을 때까지 해동하십시오.그런 다음 세포를 15밀리리터 원내 튜브로 부드럽게 이송하여 9밀리리터의 완전 RPMI를 함유하고 있습니다. 세포를 1, 500배, 섭씨 4도에서 6분간 원심분리합니다. 그런 다음 상체를 버리고 완전한 RPMI의 2 밀리리터에서 펠릿을 부드럽게 다시 놓습니다.원심분리를 반복한 후, 상체를 버리고, 완전한 RPMI의 0.5 밀리리터에서 세포를 부드럽게 재보페한다. 혈세포계를 사용하여 세포를 계산합니다. 완전한 RPMI를 사용하여, 96웰 의 둥근 바닥 플레이트의 웰 당 200 마이크로 리터에 플레이트 50, 000 CD4 +셀에 셀 서스펜션 밀도를 조정합니다.그런 다음, 자기 구슬을 준비하기 위해, 1.5 밀리리터 튜브에 ATAC-seq 샘플 당 인간 T-액티베이터 CD3/CD28 구슬의 알리쿼트 12.5 마이크로리터. 튜브에 1x PBS1 밀리리터를 넣고 자석에 1분간 놓아 구슬을 씻습니다. 클리어 상체를 조심스럽게 제거하고 버리고 자석에서 튜브를 제거합니다.ATAC-seq 샘플당 완전한 RPMI의 13 마이크로리터에서 구슬을 재보선합니다. 조정된 농도로 CD4+T 세포를 활성화하려면 15밀리리터 원컬 튜브에서 완전한 RPMI 배지의 2.1 밀리리터에서 500, 000 세포를 수집합니다. 인간 T-액티베이터 구슬 12.5 마이크로리터를 넣고, 이전 단계에서 준비하고 세척한 후 튜브를 반전시켜 부드럽게 섞습니다.그런 다음 구슬로 세포를 멸균 저수지로 부드럽게 옮기십시오. 다중 채널 파이펫을 사용하여, 라운드 하단 96 웰 플레이트의 웰 당 구슬이있는 세포의 200 마이크로 리터를 플레이트, 37도 섭씨, 48 시간 동안 5 %CO2 인큐베이터에서 배양. 완전한 인큐베이션 후, 접시를 423배 G, 실온으로 8분간 원심분리합니다.비드 손실을 확인하기 위해 각 우물에서 100 마이크로 리터의 매체를 제거하고 폐기하기 전에 원문 튜브에서 수집합니다. 그런 다음 나머지 100 마이크로 리터의 세포 펠릿을 다시 중단하고 1.5 밀리리터 튜브에서 모든 것을 수집합니다. CD4+세포를 격리하려면 미리 세척된 CD4 컨쥬게이드 구슬 50마이크로리터를 500개, 000셀을 완전한 RPMI의 1밀리리터에 넣고 혼합을 반전시다.섭씨 4도에서 20분 간 배양하고, 6분마다 손으로 쓸어넘기면 섞어보겠습니다. 상류체가 명확해질 때까지 2분간 자석에 튜브를 놓고 제거하고 버립니다. 자석에서 튜브를 제거합니다.PBS의 1밀리리터와 2%FCS로 비드 바운드 셀을 세척하고 튜브를 1분 동안 자석에 다시 놓습니다. 명확한 상체를 버리고 총 세 번의 세 가지 세정을 위해이 과정을 반복합니다. 마지막 세척 후, 1 분 동안 자석에 튜브를 배치합니다.그것을 제거하고 상체를 버리고 펠릿을 얼음 위에 놓습니다. 다음으로, 핵 절연을 수행하기 위해, 차가운 용해 완충제의 50 마이크로 리터에서 구슬과 세포를 재연하고, 원심분리기는 섭씨 4도인 500G에서 즉시 10분 동안 재연한다. 상체를 제거하고 폐기합니다.트랜스포지아제 반응을 수행하기 위해, Tn5 트랜스포지아제 믹스의 50 마이크로리터로 격리된 핵 펠릿을 재보종한다. 온도 37도에서 30분 동안 열순환기를 배양하고 뚜껑은 섭씨 40도로 설정된 다음 완료되면 섭씨 4도에서 유지하십시오. 열사이클링 직후 빠른 벤치 탑 원심분리기 스핀다운을 수행합니다.제품에서 구슬을 제거하기 위해 자석에 튜브를 1 분 동안 놓습니다. 자석에서 튜브를 제거하지 않고 명확한 상체를 DNA 정화 컬럼으로 옮기십시오. PB 버퍼 250 마이크로리터로 한 번, PE 버퍼 750 마이크로리터로 두 번 컬럼을 세척합니다.그런 다음 용출 버퍼 10 마이크로리터를 추가하여 샘플을 엘로우트합니다. 뉴클레아제없는 PCR 튜브에 초기 PCR 증폭 반응을 설정합니다. PCR 튜브를 열순환기에 넣고 PCR 증폭 프로그램을 실행합니다.그런 다음 원고에 설명된 대로 PCR 반응의 나머지 45 마이크로리터의 최종 PCR 증폭을 완료합니다. PCR 튜브를 열순환기에 배치하고 프로그램을 실행합니다. 완전한 증폭 후 제조업체의 프로토콜에 따라 PCR 정리 키트를 사용하여 라이브러리를 정수하여 용출 버퍼의 25 마이크로리터를 용출합니다.준비된 라이브러리를 차세대 시퀀서에 시퀀서에 시퀀서당 평균 읽기 깊이 4,200만 개에 시퀀스합니다. 이 향상된 ATAC-seq 프로토콜은 시퀀싱을 위해 마이크로리터 당 1나노그램 이상의 최종 라이브러리를 생성했습니다. 품질 관리는 200과 1 사이의 DNA 단편을 보여주었으며, 000 개의 기본 쌍, 그리고 이러한 고품질 라이브러리와 함께 추가 시퀀싱이 수행되었다.이 프로토콜에 따라 준비된 라이브러리는 3%의 미토콘드리아 오염만 을 보였다. 사용 가능한 읽기의 높은 비율은 생물학적 복제에 걸쳐 충분히 일정합니다. 이 프로토콜은 생물학적 복제뿐만 아니라 기술적 복제에 걸쳐 매우 재현 가능한 결과를 제공했습니다.또한 이 프로토콜은 이전에 설명한 대로 1주일 이상이 아닌 48시간이 걸렸으며, 그 결과 재현 가능한 시퀀싱 결과에 의해 입증된 일관되고 효율적인 활성화가 이루어졌습니다. 또한 분석 파이프라인에서 예측된 ATAC-seq 피크를 정확하게 호출했습니다. 시퀀싱 결과 분석은 인간 T 세포 활성화 도중 크로마틴 상태에 있는 명확한 변경을 밝혔습니다.개방 된 크로마틴의 차별화 접근 영역은 활성화 후 6 개의 샘플과 48 시간 사이에 확인되었습니다. 핵 리시스 반응이 냉기 시약 및 재료로 수행되어 그대로 핵의 회복을 극대화하도록 하십시오. 우리의 변형 된 핵 리시스 버퍼는 세포에 온화하고, 미토콘드리아 DNA를 오염 최소화.우리는 또한 단 하나 핵 ATAC-seq에 적용되는 이 수정한 용해 완충을 기대합니다. 우리는 이 프로토콜이 연구원이 감소된 비용으로 더 높은 품질의 ATAC-seq 데이터를 생성할 수 있다는 것을 알고 있으며, 후성 유전학 분야를 전달하는 데 도움이 됩니다. 이 프로토콜은 간단하고 빠르며 위험한 시약이나 계측기를 필요로 하지 않으므로 ATAC-seq에 새로 액세스할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Genetics

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

디자인과 낮은 비용의 사용, 자동 Morbidostat 박테리아의 적응 진화에 대한 항생제 약물 선택에서

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

연구

유전학

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

에듀 염색에 의한 초파리 성인 난소에서 미토콘드리아 DNA 복제의 제자리 라벨에

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

Ribosomal DNA에 따라 RNA 샘플에서 DNA 오염 평가

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

ATAC Seq에 의해 기본 인간 T 림프 톨에 게놈 넓은 접근 Chromatin 매핑

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

미토 콘 드리 아 DNA 메 틸 화의 정확한 탐지를 위한 방법론

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

격리, 시퀀싱 및 인간 중간 엽 줄기 세포에서 세포 외 MicroRNAs 분석

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

렌티 바이러스는 낮은 부착 플레이트에 준비 인간의 의사에 유전자 침묵 중재

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...

Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas

마우스 횡문근에서 분리 된 원발성 종양 세포에서 종양 구체 유도 및 치료

Rhabdomyosarcoma (RMS) is the most common soft tissue sarcoma in children. Although significant efforts have enabled the identification of common ...

Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues

마이크로위성 DNA 게노티핑 및 유동 세포분석분석분석포르민고정파라핀내장화증모금조직

Hydatidiform mole (HM) is an abnormal human pregnancy characterized by excessive trophoblastic proliferation and abnormal embryonic development. There are ...

3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells

인간의 1 차 세포에서 핵 아키텍처를 연구하는 3D 다색 DNA FISH 도구

A major question in cell biology is genomic organization within the nuclear space and how chromatin architecture can influence processes such as gene ...