Name: atac-seq assay with low mitochondrial dna contamination from primary human cd4+ t lymphocytes
Uploaded: 2019-03-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes at JoVE.com

Vi takker Atsede Siba for kundestøtte. C.S.C. støttes av NIH grant 1R61DA047032.

Denne forbedrede protokollen gir trinnvise instruksjoner for utføring ATAC-seq av CD4 + lymfocytter, fra utgangsmaterialet hele blod gjennom dataanalyse (figur 1).
1. isolering av CD4 + T celler fra fullblod
Merk: Den starte materialet for denne protokollen er 15 mL av frisk hele blod samles inn ved hjelp av standard prosedyrer, slik at kilden til utgangsmaterialet velges basert på forskning krav. Skalere protokollen et...

<ol>
	<li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin,+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position.">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li><li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATAC-seq:+A+Method+for+Assaying+Chromatin+Accessibility+Genome-Wide.">ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 21, 1-29 (2015).</li><li>Song, L., Crawford, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNase-seq:+a+high-resolution+technique+for+mapping+active+gene+regulatory+elements+across+the+genome+from+mammalian+cells.">DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (2), (2010).</li><li>Pajoro, A., Mui&#241;o, J. M., Angenent, G. C., Kaufmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+Nucleosome+Occupancy+by+MNase-seq:+Experimental+Protocol+and+Computational+Analysis.">Profiling Nucleosome Occupancy by MNase-seq: Experimental Protocol and Computational Analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1675, 167-181 (2018).</li><li>Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAIRE+(Formaldehyde-Assisted+Isolation+of+Regulatory+Elements)+isolates+active+regulatory+elements+from+human+chromatin.">FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin.</a> Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).</li><li>Rosenberg, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+profiling+of+the+developing+mouse+brain+and+spinal+cord+with+split-pool+barcoding.">Single-cell profiling of the developing mouse brain and spinal cord with split-pool barcoding.</a> Science. 360 (6385), 176-182 (2018).</li><li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-specific+and+single-cell+chromatin+accessibility+charts+human+hematopoiesis+and+leukemia+evolution.">Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution.</a> Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).</li><li>Lu, Z., Hofmeister, B. T., Vollmers, C., DuBois, R. M., Schmitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+ATAC-seq+with+nuclei+sorting+for+discovery+of+cis-regulatory+regions+in+plant+genomes.">Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes.</a> Nucleic Acids Research. 45 (6), e41 (2017).</li><li>Lara-Astiaso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+state+dynamics+during+blood+formation.">Chromatin state dynamics during blood formation.</a> Science. 345 (6199), 943-949 (2014).</li><li>Gate, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+determinants+of+co-accessible+chromatin+regions+in+activated+T+cells+across+humans.">Genetic determinants of co-accessible chromatin regions in activated T cells across humans.</a> Nature Genetics. , (2018).</li><li>Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+interrogation+of+functional+elements+in+the+noncoding+genome.">High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome.</a> Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).</li><li>. FastQC A Quality Control tool for High Throughput Sequence Data. Babraham Bioinformatics Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc</a> (2018)</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+ATAC-seq+protocol+reduces+background+and+enables+interrogation+of+frozen+tissues.">An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues.</a> Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+accessible+chromatin+in+mammalian+preimplantation+embryos.">The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos.</a> Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).</li></ol>

Modifisert ATAC-seq protokollen presenteres i denne artikkelen gir reproduserbar resultater med minimal Mitokondrielt DNA forurensning. Protokollen har blitt vant til karakteriserer chromatin arkitektur menneskelige primære PBMCs10, menneskelige monocytter, musen dendrittiske celler (upublisert) og kultivert melanom cellen linjer11. Vi forventer denne forbedret lysis tilstand har potensial til å arbeide for andre celletyper også. Det er også forventet at denne kjerner i...

Analysen for transposase tilgjengelig chromatin sekvensering (ATAC-seq) har raskt blitt den ledende metoden for avhør chromatin arkitektur. ATAC-seq kan identifisere områder av tilgjengelig chromatin gjennom tagmentation, fragmentering og merking av DNA av det samme enzymet, å produsere biblioteker som sekvensering kan bestemme chromatin tilgjengelighet på tvers av en hel genom. Denne tagmentation prosessen er formidlet av hyperaktiv Tn5 transposase, som bare skjærer åpne områder av chromatin på grunn av nucleosomic steric hindring. Som skjærer, setter Tn5 transposase også sekvensering adaptere som tillater rask biblioteket bygging av PCR og neste generasjons sekvensering av genomet hele tilgjengelig chromatin1,2.
ATAC-seq blitt den foretrukne metoden for å bestemme regioner i chromatin tilgjengelighet på grunn av relativt enkel og rask protokollen, kvalitet og utvalg av informasjon som kan fastslås fra resultatene, og lite starter materiale kreves. Forhold til DNase-seq3 (som måler også genomet hele chromatin tilgjengelighet), MNase-seq4 (som bestemmer nucleosome posisjoner i åpne genomet områder), og formaldehyd-mediert FAIRE-seq5, ATAC-seq er raskere, billigere og mer reproduserbar1. Det er også mer følsomme, arbeider med å starte materialet i løpet av 500 kjerner, sammenlignet med 50 millioner kjerner kreves for DNase-seq3. ATAC-seq har også muligheten til å gi mer informasjon om chromatin arkitektur enn andre metoder, inkludert områder av transkripsjon faktor bindende, nucleosome plassering og åpne chromatin regioner1. Effektiv, encellede ATAC-seq protokoller har validert, gir informasjon om chromatin arkitektur på encellede nivå6,7.
ATAC-seq har blitt brukt til å beskrive chromatin arkitektur over et bredt spekter av forskning og celler typer, inkludert planter8, mennesker9og mange andre organismer. Det har også vært kritisk identifisere epigenetic regulering av sykdom stater7. Men inkluderer den mest brukte ATAC-seq-protokollen den store ulempen av forurensning sekvensering leseoperasjoner fra Mitokondrielt DNA. I noen datasett, kan dette forurensning nivået være så høy som 60% av sekvensering resultater1. Det er en felles innsats i feltet for å redusere disse forurensende mitokondrie leser for å tillate mer effektiv bruk av ATAC-seq7,10,11. Her presenterer vi en forbedret ATAC-seq-protokoll som reduserer Mitokondrielt DNA forurensning hastigheten til bare 3%, slik at reduksjon av rundt 50% i sekvensering koster10. Dette er gjort mulig av en strømlinjeformet prosessen med CD4 + lymfocytt isolasjon og aktivisering og en forbedret lyseringsbuffer som er avgjørende i å minimalisere Mitokondrielt DNA forurensning.
Denne modifiedATAC-seq-protokollen er validert med en rekke primære cellene, inkludert menneskelige primære perifert blod mononukleære celler (PBMCs)10, menneskelige primære monocytter og mus dendrittiske celler (upublisert). Det er også brukt klarer å avhøre melanom cellelinjer i en gruppert regelmessig interspaced kort palindromic gjentar (CRISPR) skjerm ikke-koding elementer11. I tillegg tilbyr data analyse pakken beskrevet i denne protokollen og gitt på GitHub nye og erfarne forskere med verktøy for å analysere ATAC-seq data. ATAC-seq er den mest effektive analysen tilordne chromatin tilgjengelighet på tvers av en hel genomet, og endringer i eksisterende protokollen som introduseres her vil tillate forskere å produsere høykvalitets data med lav Mitokondrielt DNA forurensning, redusere sekvensering kostnader og forbedre ATAC-seq gjennomstrømming.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X PBS, Sterile</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5810/5810&#160;R Swing Bucket Refrigerated Centrifuge with 50 mL, 15 mL, and 1.5 mL Tube Buckets</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22625501</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Round Bottom Plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>163320</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 4200 Tape Station System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>374081</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>11131D</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>11346D</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamagnet</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Gemini Bio Products</td>
			<td>100-500</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>50674626</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2393</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute PCR Purification Kit (Buffer PB, Buffer PE, Elution Buffer)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext High Fidelity 2X PCR Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0541</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera DNA Library Preparation Kit (2X TD Buffer, Tn5 Enzyme)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC1211030</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free Sterile dH20</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10977015</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20 (Tween20)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A25780</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Water Bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TSGP02</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit FlouroMeter</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosette Sep Human CD4+ Density Medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>15705</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>15022</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Resevoir</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>8096-11</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermocycler with Heated Lid</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5941</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atac-seq assay with low mitochondrial dna contamination from primary human cd4+ t lymphocytes

ATAC-seq blitt en mye brukt metode i studiet av epigenetics på grunn av sin raske og enkle tilnærming til kartlegging genomet hele tilgjengelig chromatin. I denne artikkelen presenterer vi en forbedret ATAC-seq-protokoll som reduserer forurensende Mitokondrielt DNA leser. Mens tidligere ATAC-seq protokoller har slitt med leser gjennomsnittlig 50% forurensende Mitokondrielt DNA, optimalisert lyseringsbuffer introdusert i denne protokollen reduserer Mitokondrielt DNA forurensning til et gjennomsnitt av 3%. Denne forbedrede ATAC-seq-protokollen tillater en nær 50% reduksjon i sekvensering kostnadene. Vi viser hvordan disse høy kvalitet ATAC-seq biblioteker kan tilberedes fra aktivert CD4 + lymfocytter, trinnvise instruksjoner fra CD4 + lymfocytt isolasjon fra hele blod gjennom dataanalyse. Denne forbedrede ATAC-seq-protokollen er validert i en rekke celletyper og blir umiddelbar bruk for forskere studere chromatin tilgjengelighet.

Fra 15 mL frisk fullblod genererer denne protokollen et gjennomsnitt på 1 million CD4 + T celler. Dette kan fryses for senere behandling eller brukes umiddelbart. Levedyktighet av CD4 + T celler, friske eller tinte, var konsekvent > 95%. Denne metoden av CD4 + T cellen aisolering gir fleksibilitet i kilde materiale og samling tid. Denne forbedrede ATAC-seq-protokollen gir et siste bibliotek med større enn 1 ng/µL for sekvenser. Kvalitetskontroll utført ved hjelp av kommersielt tilgjen...

Watch this Scientific Journal Video about ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes at JoVE.com

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

Her presenterer vi en protokoll for å utføre en analyse for transposase tilgjengelig chromatin sekvensering (ATAC-seq) på aktivert CD4 + menneskelige lymfocytter. Protokollen er endret for å minimere forurensende Mitokondrielt DNA leser fra 50% til 3% gjennom innføring av en ny lyseringsbuffer.

ATAC-seq analysen med lav Mitokondrielt DNA forurensning fra primære menneskelige CD4 + T-lymfocytter

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

Denne modifiserte ATAC-seq protokollen introduserer en ny lysis buffer som reduserer forurensende mitokondrie leser fra 50% til mindre enn 3%Den reduserte mitokondrieforurensning vil tillate forskere å utføre mer effektiv ATAC-seq med en 50% reduksjon i sekvenseringskostnader. Vi har validert denne nye ATAC-seq protokollen i menneskelige primære PBMCer, menneskelige primære monocytter, mus dendrittiske celler, og melanom cellelinjer. Vi tror det vil være effektivt i et bredt spekter av celletyper.Minimere prøvetap under celleaktiverings- og utvelgelsesprosessen er avgjørende for å oppnå resultater av høy kvalitet med ATAC-seq. Vi vil demonstrere hvordan man håndterer et lite antall celler fra dyrebare prøver ved hjelp av grunnleggende laboratorieutstyr. Til å begynne med tine ett hetteglass med tidligere isolerte CD4+T-celler i et 37-graders Celsius-vannbad til isen nettopp har smeltet.Deretter overfører du cellene forsiktig til et konisk rør på 15 milliliter som inneholder ni milliliter forhåndsoppvarmet fullstendig RPMI. Sentrifuger cellene ved 1, 500 ganger G, og fire grader Celsius, i seks minutter. Kast deretter det overnaturlige, og forsiktig resuspend pellet i to milliliter med fullstendig RPMI.Etter å ha gjentatt sentrifugeringen, kast supernatanten og resuspend cellene forsiktig i 0,5 milliliter med fullstendig RPMI. Bruk et hemocytometer for å telle cellene. Bruk fullstendig RPMI til å justere cellefjæringstettheten til plate 50,000 CD4+-celler i 200 mikroliter per brønn av en 96-brønn rundbunnsplate.Deretter, for å forberede magnetiske perler, aliquot 12,5 mikroliter av Human T-Activator CD3 / CD28 perler per ATAC-seq prøve til en 1,5 milliliter tube. Tilsett en milliliter 1x PBS til røret, og legg den på en magnet i ett minutt for å vaske perlene. Fjern og kast det klare overnaturlige forsiktig, og fjern røret fra magneten.Resuspend perlene i 13 mikroliter med komplett RPMI per ATAC-seq prøve. For å aktivere CD4+T-cellene med justert konsentrasjon, samle 500,000 celler i 2,1 milliliter komplett RPMI medium i en 15-milliliter konisk rør. Tilsett 12,5 mikroliter av humane T-Activator perler, forberedt og vasket i tidligere trinn, og bland forsiktig ved å invertere røret.Deretter overfører du forsiktig cellene, med perler, til et sterilt reservoar. Ved hjelp av en flerkanals pipette, plate 200 mikroliter celler med perler per brønn av en rund bunn 96-brønnplate, og inkubere i en 37-graders Celsius, 5% CO2 inkubator i 48 timer. Etter fullstendig inkubasjon sentrifuger platen ved 423 ganger G, og romtemperatur, i åtte minutter.Fjern 100 mikroliter medium fra hver brønn, og samle det i et konisk rør før du kaster, for å bekrefte ingen perletap. Deretter gjenbruker cellepelleten i de resterende 100 mikroliter av medium, og samle alt i et 1,5-milliliter rør. For å isolere CD4 + celler, legg til 50 mikroliter forhåndsvaskede CD4 konjugerte perler til 500 000 celler i en milliliter komplett RPMI, og inverterer for å blande.Inkuber i 20 minutter ved fire grader Celsius, mens hånd-flicking hvert sjette minutt å blande. Plasser røret på magneten i to minutter, til supernatant er klar, og fjern og kast deretter. Fjern røret fra magneten.Vask de perlebundne cellene ved å bruke dem på en milliliter PBS, pluss 2% FCS, og plasser røret tilbake på magneten i ett minutt. Kast det klare overnatant, og gjenta denne prosessen for totalt tre vasker. Etter den siste vasken, plasser røret på magneten i ett minutt.Fjern den, kast supernatanten og legg pelleten på isen. Deretter, for å utføre kjerneiisolasjon, resuspend perlene og cellene i 50 mikroliter kald lysis buffer, og sentrifuge umiddelbart ved 500 G, fire grader Celsius, i 10 minutter. Fjern og kast overnatanten.For å utføre transposasereaksjonen, resuspend den isolerte kjernepelleten med 50 mikroliter Tn5 transposaseblanding. Inkuber i en termocycler i 30 minutter ved 37 grader Celsius, med lokket satt til 40 grader Celsius, og hold deretter på fire grader Celsius når det er ferdig. Umiddelbart etter termocycling, utfør en rask benk-top sentrifuge spin-down.Plasser røret på magneten i ett minutt for å fjerne perlene fra produktet. Uten å fjerne røret fra magneten, overfør det klare overnatantet til en DNA-rensekolonne. Vask kolonnen én gang med 250 mikroliter PB-buffer, og to ganger med 750 mikroliter PE-buffer.Deretter legger du til 10 mikroliter elutionbuffer for å elute prøven. Sett opp den første PCR-forsterkningsreaksjonen i et kjernefritt PCR-rør. Plasser PCR-røret i termocycleren, og kjør PCR-forsterkningsprogrammet.Deretter fullfører du den endelige PCR-forsterkningen av de resterende 45 mikroliter av PCR-reaksjon, som beskrevet i manuskriptet. Plasser PCR-røret i termocycleren og kjør programmet. Etter fullstendig forsterkning renser du bibliotekene ved hjelp av et PCR-oppryddingssett, etter produsentens protokoll, og eluting i 25 mikroliter av elutionbufferen.Sekvenser de forberedte bibliotekene på en neste generasjons sequencer til en gjennomsnittlig lesedybde på 42 millioner leser per utvalg. Denne forbedrede ATAC-seq-protokollen produserte et endelig bibliotek med større enn ett nanogram per mikroliter for sekvensering. Kvalitetskontroll viste DNA-fragmenter mellom 200 og 1000 basispar, og ytterligere sekvensering ble utført med disse bibliotekene av høy kvalitet.Biblioteker utarbeidet etter denne protokollen viste bare 3% mitokondrieforurensning. Den høye prosentandelen av brukbare lys er tilstrekkelig konstant på tvers av biologiske repliker. Denne protokollen ga svært reproduserbare resultater på tvers av tekniske repliker, samt biologiske repliker.I tillegg tok denne protokollen 48 timer, i stedet for en uke eller mer som tidligere beskrevet, noe som resulterte i konsekvent og effektiv aktivering, som demonstrert ved reproduserbare sekvenseringsresultater. Videre ble spådde ATAC-seq topper nøyaktig kalt av analyserørledningen. Sekvensering resultatanalyse viste klare endringer i kromatin tilstand under menneskelig T celle aktivering.Differensialvennlige områder med åpent kromatin ble identifisert mellom seks prøver før og 48 timer etter aktivering. Kontroller at kjernene lysisreaksjonen utføres med kjølte reagenser og materialer, for å maksimere utvinningen av intakte kjerner. Vår modifiserte kjernelysbuffer er mildere på cellene, og minimerer forurensende mitokondrie-DNA.Vi ser frem til at denne modifiserte lysisbufferen også brukes på enkjerners ATAC-seq. Vi vet at denne protokollen vil tillate forskere å produsere ATAC-seq-data av høyere kvalitet til en redusert kostnad, noe som bidrar til å videresende det epigenetiske feltet. Protokollen er enkel, rask og krever ingen farlige reagenser eller instrumenter, noe som gjør den lett tilgjengelig for de som er nye til ATAC-seq.

Research

JoVE Journal

Genetics

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

Design og bruk av en lav pris, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bakterier Under Antibiotika Drug Selection

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Merking av mitokondriell DNA replikasjon i Drosophila voksen Eggstokkene Edu Farging

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

Vurdering av DNA forurensning i RNA eksempler basert på Ribosomal DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Kartlegging genomet hele tilgjengelig Chromatin i primære menneskelige T-lymfocytter av ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Metodikk for nøyaktig påvisning av Mitokondrielt DNA metylering

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Isolere, sekvensering og analysere ekstracellulære MicroRNAs fra menneskelige stamceller

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

Lentiviral mediert gen demping i Human Pseudoislet forberedt på lav Vedleggs plater

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...

Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas

Tumorsphere avledning og behandling fra primære tumor celler isolert fra mus Rhabdomyosarcomas

Rhabdomyosarcoma (RMS) is the most common soft tissue sarcoma in children. Although significant efforts have enabled the identification of common ...

Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues

Mikrosatellittmarkør DNA genotyperingteknologi og Flow flowcytometri Ploidy analyser av formalin-fast parafin-embedded Blæremola molar vev

Hydatidiform mole (HM) is an abnormal human pregnancy characterized by excessive trophoblastic proliferation and abnormal embryonic development. There are ...

3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells

3D flerfarget DNA FISH verktøy for å studere kjernefysisk arkitektur i menneskelige primære celler

A major question in cell biology is genomic organization within the nuclear space and how chromatin architecture can influence processes such as gene ...