Name: atac-seq assay with low mitochondrial dna contamination from primary human cd4+ t lymphocytes
Uploaded: 2019-03-22T14:00:00
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Este protocolo melhorado fornece instruções passo a passo para a realização de ATAC-seq de linfócitos CD4 +, de matérias-primas de sangue total por meio de análise de dados (Figura 1).
1. isolamento de células de CD4 + T do sangue inteiro
Nota: A matéria-prima para este protocolo é de 15 mL de sangue total fresco coletado usando procedimentos padrão, permitindo que a origem da matéria-prima a ser selecionado c...

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	<li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin,+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position.">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li><li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATAC-seq:+A+Method+for+Assaying+Chromatin+Accessibility+Genome-Wide.">ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 21, 1-29 (2015).</li><li>Song, L., Crawford, G. 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Babraham Bioinformatics Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc</a> (2018)</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+ATAC-seq+protocol+reduces+background+and+enables+interrogation+of+frozen+tissues.">An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues.</a> Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+accessible+chromatin+in+mammalian+preimplantation+embryos.">The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos.</a> Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).</li></ol>

O protocolo modificado de ATAC-seq apresentado neste artigo fornece resultados reprodutíveis com contaminação mínima de DNA mitocondrial. O protocolo tem sido usado para com êxito caracterizam a arquitetura da cromatina de humano primário PBMCs10, humanos monócitos, células dendríticas de rato (não publicadas), e11linhas de células de melanoma culta. Nós antecipamos essa lise melhorada condição tem o potencial de trabalho para outros tipos de células também....

O ensaio para transposase-acessível da cromatina sequenciamento (ATAC-seq) rapidamente se tornou o principal método para interrogar a arquitetura da cromatina. ATAC-seq pode identificar regiões da cromatina acessível através do processo de tagmentation, a fragmentação e marcação de DNA pela mesma enzima, para produzir as bibliotecas com o qual sequenciamento pode determinar a acessibilidade de cromatina através de um genoma inteiro. Este processo de tagmentation é mediado pelo transposase Tn5 hiperativo, o que só corta regiões abertas da cromatina devido nucleosomic estérico. Como corta, o transposase Tn5 insere também adaptadores de sequenciamento que permitem a construção de biblioteca rápida por PCR e a próxima geração sequenciamento de genoma-larga acessível cromatina1,2.
ATAC-seq tornou-se o método preferido para determinar as regiões de acessibilidade de cromatina, devido ao protocolo relativamente simples e rápido, qualidade e variedade de informações que podem ser determinadas a partir de seus resultados e a pequena quantidade de material necessário começar. Em comparação com DNase-seq3 (que também mede a acessibilidade de todo o genoma de cromatina), MNase-seq4 (que determina posições nucleossoma em regiões do genoma aberto), e a mediada por formaldeído FAIRE-seq5, ATAC-seq é mais rápido, mais barato e mais reprodutíveis1. Também é mais sensível, trabalhando com material de tão poucos como 500 núcleos, em comparação com os núcleos 50 milhões necessários para DNase-seq3começar. ATAC-seq também tem a capacidade de fornecer mais informações sobre a arquitetura da cromatina que outros métodos, incluindo regiões de ligação do fator de transcrição nucleossoma posicionamento e regiões de cromatina aberta1. Eficazes, single-cell ATAC-seq protocolos validados, fornecendo informações sobre a arquitetura da cromatina na célula única nível6,7.
ATAC-seq tem sido usado para caracterizar a arquitetura da cromatina através de um amplo espectro de tipos de pesquisa e de células, incluindo plantas8humanos9e muitos outros organismos. Também tem sido fundamental na identificação de regulação epigenética da doença Estados7. No entanto, o mais amplamente utilizado ATAC-seq protocolo inclui a grande desvantagem de contaminação leituras de sequenciamento do DNA mitocondrial. Em alguns conjuntos de dados, este nível de contaminação pode ser tão alto quanto 60% de resultados1de sequenciamento. Há um esforço concertado no campo para reduzir essas leituras mitocondriais contaminantes para permitir a aplicação mais eficiente da ATAC-seq7,10,11. Aqui nós apresentamos um protocolo melhorado da ATAC-seq que reduz a taxa de contaminação de DNA mitocondrial de apenas 3%, permitindo a redução de cerca de 50% em custos de sequenciamento10. Isto é feito possível por um processo simplificado de isolamento de linfócitos CD4 + e ativação e um tampão de Lise melhorada que é crítico em minimizar a contaminação de DNA mitocondrial.
Este protocolo modifiedATAC-seq foi validado com uma grande variedade de células primárias, incluindo humano primário do sangue periférico (PBMC) de células mononucleares10humanos primários monócitos e células dendríticas de rato (não publicadas). Ele também tem sido usado com sucesso para interrogar linhas de células de melanoma em uma tela de regularmente intercaladas curta palíndromo repetições (CRISPR) em cluster de elementos não-codificantes11. Além disso, o pacote de análise de dados descritos no presente protocolo e fornecido no GitHub fornece novos e experientes pesquisadores com ferramentas para analisar dados de ATAC-seq. ATAC-seq é o ensaio mais eficaz para mapear a acessibilidade de cromatina através de um genoma inteiro, e modificações no protocolo existente que são introduzidas aqui permitirá que pesquisadores produzir dados de alta qualidade com baixa contaminação de DNA mitocondrial, redução de custos de sequenciamento e melhorar o throughput de ATAC-seq.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X PBS, Sterile</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5810/5810&#160;R Swing Bucket Refrigerated Centrifuge with 50 mL, 15 mL, and 1.5 mL Tube Buckets</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22625501</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Round Bottom Plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>163320</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 4200 Tape Station System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>374081</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>11131D</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>11346D</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamagnet</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Gemini Bio Products</td>
			<td>100-500</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>50674626</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2393</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute PCR Purification Kit (Buffer PB, Buffer PE, Elution Buffer)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext High Fidelity 2X PCR Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0541</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera DNA Library Preparation Kit (2X TD Buffer, Tn5 Enzyme)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC1211030</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free Sterile dH20</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10977015</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20 (Tween20)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A25780</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Water Bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TSGP02</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit FlouroMeter</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosette Sep Human CD4+ Density Medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>15705</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>15022</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Resevoir</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>8096-11</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermocycler with Heated Lid</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5941</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atac-seq assay with low mitochondrial dna contamination from primary human cd4+ t lymphocytes

ATAC-seq tornou-se uma metodologia amplamente utilizada no estudo da epigenética, devido à sua abordagem rápida e simples de mapear todo o genoma de cromatina acessível. Neste trabalho apresentamos um protocolo melhorado de ATAC-seq que reduz contaminando leituras de DNA mitocondriais. Enquanto o anterior ATAC-seq protocolos têm lutado com uma média de 50%, contaminando o DNA mitocondrial lê, a Lise otimizado introduzido neste protocolo reduz contaminação de DNA mitocondrial de uma média de 3%. Este protocolo ATAC-seq melhorado permite a quase 50% de redução do custo de sequenciamento. Vamos demonstrar como essas bibliotecas de ATAC-seq de alta qualidade podem ser preparadas de linfócitos CD4 + ativados, fornecendo instruções passo a passo do isolamento de linfócitos CD4 + de sangue total através da análise de dados. Este protocolo ATAC-seq melhorado foi validado em uma ampla gama de tipos de células e será de uso imediato para pesquisadores estudando acessibilidade de cromatina.

De 15 mL de sangue total fresco, este protocolo gera uma média de 1 milhão de células de CD4 + T. Estes podem ser congelados para mais tarde processar ou usados imediatamente. Viabilidade das células T CD4 +, frescas ou descongeladas, foi consistentemente > 95%. Este método de isolamento de célula CD4 + T permite flexibilidade no tempo de material e a coleção de origem. Este protocolo ATAC-seq melhorado produz uma biblioteca final de mais de 1 ng / µ l para o sequenciamento. Cont...

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ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

Aqui, apresentamos um protocolo para realizar um ensaio de cromatina transposase-acessível sequenciando (ATAC-seq) em linfócitos humanos registrados CD4 +. O protocolo foi modificado para minimizar contaminando leituras de DNA mitocondriais de 50% para 3%, através da introdução de um novo buffer de Lise.

ATAC-seq ensaio com DNA mitocondrial baixa contaminação de primária humana CD4 linfócitos T

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

Este protocolo ATAC-seq modificado introduz um novo tampão de lise que diminui a contaminação das leituras mitocondriais de 50% para menos de 3%A diminuição da contaminação mitocondrial permitirá aos pesquisadores realizar um ATAC-seq mais eficiente com uma redução de 50% nos custos de sequenciamento. Validamos este novo protocolo ATAC-seq em PBMCs primários humanos, monócitos primários humanos, células dendríticas de camundongos e linhas celulares de melanoma. Acreditamos que será eficaz em uma ampla gama de tipos de células.Minimizar a perda de amostras durante o processo de ativação e seleção celular é fundamental para obter resultados de alta qualidade com ATAC-seq. Vamos demonstrar como lidar com um pequeno número de células de amostras preciosas usando equipamentos básicos de laboratório. Para começar, descongele um frasco de células CD4+T anteriormente isoladas em um banho de água Celsius de 37 graus até que o gelo derreta.Em seguida, transfira suavemente as células para um tubo cônico de 15 mililitros contendo nove mililitros de RPMI completo pré-aquecido. Centrifugar as células a 1.500 vezes G, e quatro graus Celsius, por seis minutos. Em seguida, descarte o supernasce e retire suavemente a pelota em dois mililitros de RPMI completo.Depois de repetir a centrifugação, descarte o supernasce e resuspenque suavemente as células em 0,5 mililitros de RPMI completo. Use um hemótmetro para contar as células. Usando RPMI completo, ajuste a densidade de suspensão celular para a placa 50,000 células CD4+em 200 microliters por poço de uma placa de fundo redondo de 96 poços.Em seguida, para preparar contas magnéticas, alíquota de 12,5 microliters de contas Humanas T-Activator CD3/CD28 por amostra ATAC-seq para um tubo de 1,5 mililitro. Adicione um mililitro de 1x PBS ao tubo, e coloque-o em um ímã por um minuto para lavar as contas. Remova e descarte cuidadosamente o supernanato claro e remova o tubo do ímã.Resuspenja as contas em 13 microliters de RPMI completo por amostra ATAC-seq. Para ativar as células CD4+T com a concentração ajustada, colete 500.000 células em 2,1 mililitros de meio RPMI completo em um tubo cônico de 15 mililitros. Adicione 12,5 microliters de contas T-Activator Humanas, preparados e lavados em etapas anteriores, e misture suavemente invertendo o tubo.Em seguida, transfira suavemente as células, com contas, para um reservatório estéril. Usando uma pipeta multicanal, placa 200 microliters de células com contas por poço de uma placa de fundo redondo de 96 poços, e incubar em uma incubadora de 37 graus Celsius, 5% de CO2 por 48 horas. Após a incubação completa, centrifufique a placa a 423 vezes G, e temperatura ambiente, por oito minutos.Remova 100 microliters de meio de cada poço e colete-o em um tubo cônico antes de descartar, a fim de confirmar nenhuma perda de contas. Em seguida, resuspenja a pelota celular nos 100 microliters restantes de médio, e colete tudo em um tubo de 1,5 mililitro. Para isolar as células CD4+, adicione 50 microliters de contas conjugadas CD4 pré-lavadas a 500.000 células em um mililitro de RPMI completo, e inverta para misturar.Incubar por 20 minutos a quatro graus Celsius, enquanto aperta a mão a cada seis minutos para misturar. Coloque o tubo sobre o ímã por dois minutos, até que o supernasce esteja limpo e, em seguida, remova e descarte. Remova o tubo do ímã.Lave as células ligadas a contas reutilizando-as em um mililitro de PBS, mais 2% FCS, e coloque o tubo de volta no ímã por um minuto. Descarte o supernatante claro e repita este processo para um total de três lavagens. Após a lavagem final, coloque o tubo no ímã por um minuto.Remova-o, descarte o supernasce e coloque a pelota no gelo. Em seguida, para realizar o isolamento dos núcleos, resuspensar as contas e células em 50 microliters de tampão de lise fria, e centrífuga imediatamente a 500 G, quatro graus Celsius, por 10 minutos. Remova e descarte o supernaspe.Para realizar a reação transposase, resuspenja a pelota de núcleos isolados com 50 microliters de mistura de transposase Tn5. Incubar em um termociclador por 30 minutos a 37 graus Celsius, com a tampa definida para 40 graus Celsius, e depois manter a quatro graus Celsius quando completa. Imediatamente após o termociclismo, realize um rápido spin-down de centrífuga de bancada.Coloque o tubo sobre o ímã por um minuto para remover as contas do produto. Sem remover o tubo do ímã, transfira o supernatante claro para uma coluna de purificação de DNA. Lave a coluna uma vez com 250 microliters de tampão PB, e duas vezes com 750 microliters de tampão pe.Em seguida, adicione 10 microliters de tampão de elução para eluto da amostra. Configure a reação inicial de amplificação do PCR em um tubo PCR sem nuclease. Coloque o tubo PCR no termociclador e execute o programa de amplificação do PCR.Em seguida, complete a amplificação final do PCR dos 45 microliters restantes da reação pcr, conforme descrito no manuscrito. Coloque o tubo PCR no termociclador e execute o programa. Após a amplificação completa, purifique as bibliotecas usando um kit de limpeza PCR, seguindo o protocolo do fabricante, eluindo em 25 microliters do buffer de elução.Sequencie as bibliotecas preparadas em um sequenciador de próxima geração para uma profundidade de leitura média de 42 milhões de leituras por amostra. Este protocolo ATAC-seq melhorado produziu uma biblioteca final de mais de um nanograma por microliter para sequenciamento. O controle de qualidade mostrou fragmentos de DNA entre 200 e 1.000 pares de base, e mais sequenciamento foi realizado com essas bibliotecas de alta qualidade.As bibliotecas preparadas seguindo este protocolo mostraram apenas 3% de contaminação mitocondrial. A alta porcentagem de leituras utilizáveis é suficientemente constante em todas as réplicas biológicas. Este protocolo forneceu resultados altamente reprodutíveis através de réplicas técnicas, bem como réplicas biológicas.Além disso, este protocolo levou 48 horas, em vez de uma semana ou mais como descrito anteriormente, resultando em ativação consistente e eficiente, como demonstrado pelos resultados de sequenciamento reprodutível. Além disso, os picos atac-seq previstos foram chamados com precisão pelo pipeline de análise. A análise do resultado do sequenciamento revelou mudanças claras no estado da cromatina durante a ativação da célula T humana.Foram identificadas regiões de cromatina aberta entre seis amostras antes e 48 horas após a ativação. Certifique-se de que a reação de lise dos núcleos seja realizada com reagentes e materiais refrigerados, a fim de maximizar a recuperação de núcleos intactos. Nosso tampão de lise de núcleos modificados é mais suave nas células, e minimiza contaminar o DNA mitocondrial.Estamos ansiosos para que este tampão de lise modificado seja aplicado em núcleos únicos ATAC-seq também. Sabemos que este protocolo permitirá que os pesquisadores produzam dados ATAC-seq de maior qualidade a um custo reduzido, ajudando a encaminhar o campo epigenético. O protocolo é simples, rápido e não requer reagentes ou instrumentos perigosos, tornando-o facilmente acessível para aqueles novos para ATAC-seq.

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Silenciamento gênico mediado por Lentivirus em Pseudoislet humano preparado em placas de baixo acessório

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...

Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas

Derivação e tratamento de tumorsphere de células tumorais primárias isoladas de rabdomiossarcoma de camundongo

Rhabdomyosarcoma (RMS) is the most common soft tissue sarcoma in children. Although significant efforts have enabled the identification of common ...

Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues

Microsatellite DNA genotipagem e fluxo citometria de análise Ploidy de formalina-fixa parafina-Embedded Hydatidiform molar tecidos

Hydatidiform mole (HM) is an abnormal human pregnancy characterized by excessive trophoblastic proliferation and abnormal embryonic development. There are ...

3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells

Ferramenta de peixe de DNA Multicolor 3D para estudar arquitetura nuclear em células primárias humanas

A major question in cell biology is genomic organization within the nuclear space and how chromatin architecture can influence processes such as gene ...