Name: atac-seq assay with low mitochondrial dna contamination from primary human cd4+ t lymphocytes
Uploaded: 2019-03-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes at JoVE.com

Мы благодарим Атседе Siba для технической поддержки. ЦСК поддерживается 1R61DA047032 гранта NIH.

Эта улучшенная протокол предоставляет пошаговые инструкции для выполнения ATAC-seq CD4 + лимфоцитов, от исходного материала цельной крови через анализ данных (рис. 1).
1. изоляция CD4 + Т-клеток из цельной крови
Примечание: Исходным материал?...

<ol>
	<li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin,+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position.">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li><li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATAC-seq:+A+Method+for+Assaying+Chromatin+Accessibility+Genome-Wide.">ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 21, 1-29 (2015).</li><li>Song, L., Crawford, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNase-seq:+a+high-resolution+technique+for+mapping+active+gene+regulatory+elements+across+the+genome+from+mammalian+cells.">DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (2), (2010).</li><li>Pajoro, A., Mui&#241;o, J. M., Angenent, G. C., Kaufmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+Nucleosome+Occupancy+by+MNase-seq:+Experimental+Protocol+and+Computational+Analysis.">Profiling Nucleosome Occupancy by MNase-seq: Experimental Protocol and Computational Analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1675, 167-181 (2018).</li><li>Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAIRE+(Formaldehyde-Assisted+Isolation+of+Regulatory+Elements)+isolates+active+regulatory+elements+from+human+chromatin.">FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin.</a> Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).</li><li>Rosenberg, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+profiling+of+the+developing+mouse+brain+and+spinal+cord+with+split-pool+barcoding.">Single-cell profiling of the developing mouse brain and spinal cord with split-pool barcoding.</a> Science. 360 (6385), 176-182 (2018).</li><li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-specific+and+single-cell+chromatin+accessibility+charts+human+hematopoiesis+and+leukemia+evolution.">Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution.</a> Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).</li><li>Lu, Z., Hofmeister, B. T., Vollmers, C., DuBois, R. M., Schmitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+ATAC-seq+with+nuclei+sorting+for+discovery+of+cis-regulatory+regions+in+plant+genomes.">Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes.</a> Nucleic Acids Research. 45 (6), e41 (2017).</li><li>Lara-Astiaso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+state+dynamics+during+blood+formation.">Chromatin state dynamics during blood formation.</a> Science. 345 (6199), 943-949 (2014).</li><li>Gate, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+determinants+of+co-accessible+chromatin+regions+in+activated+T+cells+across+humans.">Genetic determinants of co-accessible chromatin regions in activated T cells across humans.</a> Nature Genetics. , (2018).</li><li>Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+interrogation+of+functional+elements+in+the+noncoding+genome.">High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome.</a> Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).</li><li>. FastQC A Quality Control tool for High Throughput Sequence Data. Babraham Bioinformatics Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc</a> (2018)</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+ATAC-seq+protocol+reduces+background+and+enables+interrogation+of+frozen+tissues.">An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues.</a> Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+accessible+chromatin+in+mammalian+preimplantation+embryos.">The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos.</a> Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).</li></ol>

Измененный Протокол ATAC-seq, представленные в этой статье обеспечивает воспроизводимость результатов с минимальными митохондриальной ДНК загрязнения. Протокол была использована для успешно характеризуют хроматина архитектура человека первичного получения10, человека мон...

Assay для Транспозаза доступные хроматина виртуализации (ATAC-seq) быстро стал ведущим методом для допроса хроматина архитектуры. ATAC-seq можно определить регионы доступны хроматина через процесс tagmentation, фрагментации и пометки ДНК же ферментом, производить библиотеки, с которыми последовательности можно определить доступность хроматина через весь геном. Этот процесс tagmentation при посредничестве гиперактивный Tn5 Транспозаза, который режет только открытые регионы хроматина из-за nucleosomic их пространственной помех. Как она режет, Tn5 Транспозаза также вставляет последовательность адаптеры, которые позволяют для быстрого библиотека строительство методом ПЦР и следующего поколения секвенирования генома всей доступной хроматина1,2.
ATAC-seq стала предпочтительным методом для определения регионов хроматина доступности из-за относительно простой и быстрый протокол, качество и спектр информации, которая может быть определена из его результаты и небольшое количество исходного материала требуется. По сравнению с DNase-seq3 (который также измеряет генома общесистемной хроматина доступность), MNase-seq4 (который определяет нуклеосома позиции в регионах открытых генома), и формальдегида опосредованной Фэр seq5, ATAC-seq быстрее, дешевле и более воспроизводимые1. Это также более чувствительным, работа с исходного материала всего лишь 500 ядер, по сравнению с 50 миллионов ядра, необходимые для DNase-seq3. ATAC-seq также имеет возможность предоставить дополнительные сведения об архитектуре хроматина чем другие методы, включая регионы привязки фактор транскрипции, нуклеосома позиционирования и открытые хроматина регионах1. Эффективный, одноклеточных ATAC-seq протоколы были подтверждены, предоставляя информацию о архитектуры хроматина в одной ячейки уровня6,7.
ATAC-seq используется для характеристики хроматина архитектуры через широкий спектр исследований и клетки типов, включая растения8,9людей и многих других организмов. Это также сыграло важную роль в идентификации эпигеномные регулирование болезни государств7. Однако наиболее широко используемый протокол ATAC-seq включает основным недостатком загрязнения гласит последовательности митохондриальной ДНК. В некоторых наборов данных этот уровень загрязнения может быть выше, чем 60% секвенирования результаты1. В поле, чтобы уменьшить эти загрязняющие митохондриальной читает для обеспечения более эффективного применения ATAC-seq7,10,11есть согласованные усилия. Здесь мы представляем улучшение ATAC-seq протокол, который снижает уровень загрязнения митохондриальной ДНК всего 3%, позволяя сокращение около 50% в последовательности по цене10. Это стало возможным путем упрощения процесса CD4 + лимфоцитов изоляции и активации и улучшение литического буфера, которая имеет решающее значение для сведения к минимуму загрязнения митохондриальной ДНК.
Этот протокол modifiedATAC-seq протестирована с широкий спектр первичных элементов, включая первичный периферической крови человека мононуклеарных клеток (получения)10, человека первичной моноцитов и дендритные клетки мыши (Неизданное). Он также успешно используется допросить линии клетки меланомы в кластеризованный экране регулярно interspaced короткие палиндром повторяется (ТРИФОСФАТЫ)-кодирования элементы11. Кроме того пакет анализа данных указанных в настоящем Протоколе и на GitHub предоставляет новым и опытным исследователей с инструментами для анализа данных ATAC-seq. ATAC-seq является наиболее эффективным методом для сопоставления хроматина доступность через весь геном, и изменения в существующий протокол, которые будут введены здесь позволит исследователям для производства высококачественных данных с низкой митохондриальной ДНК загрязнения, снижение издержек виртуализации и повышение ATAC-seq пропускную способность.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X PBS, Sterile</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5810/5810&#160;R Swing Bucket Refrigerated Centrifuge with 50 mL, 15 mL, and 1.5 mL Tube Buckets</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22625501</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Round Bottom Plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>163320</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 4200 Tape Station System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>374081</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>11131D</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>11346D</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamagnet</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Gemini Bio Products</td>
			<td>100-500</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>50674626</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2393</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute PCR Purification Kit (Buffer PB, Buffer PE, Elution Buffer)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext High Fidelity 2X PCR Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0541</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera DNA Library Preparation Kit (2X TD Buffer, Tn5 Enzyme)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC1211030</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free Sterile dH20</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10977015</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20 (Tween20)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A25780</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Water Bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TSGP02</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit FlouroMeter</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosette Sep Human CD4+ Density Medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>15705</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>15022</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Resevoir</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>8096-11</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermocycler with Heated Lid</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5941</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atac-seq assay with low mitochondrial dna contamination from primary human cd4+ t lymphocytes

ATAC-seq стал широко используется методология в изучении эпигенетики из-за его быстрый и простой подход к картирования генома всей доступной хроматина. В этой статье мы представляем улучшение ATAC-seq протокол, который уменьшает загрязнение митохондриальной ДНК читает. В то время как предыдущие протоколы ATAC-seq боролись с читает в среднем на 50%, загрязняя митохондриальной ДНК, оптимизированный литического буфера, представил в настоящем Протоколе уменьшает загрязнение митохондриальной ДНК в среднем 3%. Это улучшение ATAC-seq протокол обеспечивает около 50% сокращение стоимости последовательности. Мы демонстрируем, как эти библиотеки ATAC-seq высокого качества могут быть получены из активированных CD4 + лимфоцитов, шаг за шагом инструкции от CD4 + лимфоцитов изоляции из цельной крови путем анализа данных. Этот улучшенный протокол ATAC-seq протестирована в широком диапазоне типов клеток и будет немедленно воспользоваться исследователи, изучая хроматина доступности.

От 15 мл свежей цельной крови этот протокол генерирует в среднем 1 миллион клеток CD4 + T. Эти могут быть заморожены для последующей обработки или использовать немедленно. Жизнеспособность клеток CD4 + T, свежие или талой, был последовательно > 95%. Этот метод изоляции клеток CD4 ...

Watch this Scientific Journal Video about ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes at JoVE.com

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

Здесь мы представляем протокол для выполнения assay для виртуализации (ATAC-seq) активированный человека лимфоцитов CD4 + Транспозаза доступные хроматина. Протокол был изменен для сведения к минимуму загрязнения митохондриальной ДНК читает от 50% до 3% путем введения нового буфера lysis.

ATAC-seq Assay с низкой митохондриальной ДНК загрязнения от первичного человека CD4 + Т-лимфоцитов

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

Этот модифицированный протокол ATAC-seq вводит новый буфер лиза, который уменьшает загрязняющие митохондриальные считывания с 50% до менее чем 3%Снижение митохондриального загрязнения позволит исследователям выполнять более эффективные ATAC-seq с 50%снижением затрат на секвенирование. Мы проверили этот новый протокол ATAC-seq в первичных ПХМР человека, первичных моноцитах человека, дендритных клетках мыши и линиях клеток меланомы. Мы считаем, что он будет эффективен в широком диапазоне типов клеток.Минимизация потери выборки в процессе активации и отбора клеток имеет решающее значение для получения высококачественных результатов с помощью ATAC-seq. Мы продемонстрируем, как обрабатывать небольшое количество клеток из драгоценных образцов с помощью основного лабораторного оборудования. Для начала оттайте один флакон ранее изолированных клеток CD4-T в 37-градусной водяной бане по Цельсию до тех пор, пока лед только не растает.Затем аккуратно перенесите клетки в 15-миллилитровую коническую трубку, содержащую девять миллилитров предварительно разогретой полной RPMI. Центрифуга клеток в 1500 раз G, и четыре градуса по Цельсию, в течение шести минут. Затем отбросьте супернатант и аккуратно повторно посовелите гранулы в два миллилитров полного RPMI.После повторения центрифугации, отбросить супернатант, и осторожно повторного перерасхода клеток в 0,5 миллилитров полного RPMI. Используйте гемоцитометр для подсчета клеток. Используя полный RPMI, отрегулируйте плотность подвески ячейки до пластины 50 000 CD4-клеток в 200 микролитров на колодец 96-хорошо круглой нижней пластины.Затем, чтобы подготовить магнитные бусы, aliquot 12,5 микролитров человека T-Activator CD3/CD28 шарики на ATAC-seq образца 1,5 миллилитров трубки. Добавить один миллилитр 1x PBS в трубку, и поместите его на магнит в течение одной минуты, чтобы вымыть бисер. Аккуратно удалите и отбросьте чистый супернатант, и удалите трубку из магнита.Перепробовать бисер в 13 микролитров полного RPMI в ATAC-seq образца. Чтобы активировать клетки CD4'T с скорректированной концентрацией, соберите 500 000 ячеек в 2,1 миллилитров полной среды RPMI в 15-миллилитровой конической трубке. Добавьте 12,5 микролитров бусинок человека T-Activator, приготовленные и вымытые в предыдущих шагах, и аккуратно перемешайте трубку.Затем аккуратно перенесите клетки с бисером в стерильный резервуар. Использование многоканальные пипетки, пластины 200 микролитров клеток с бисером на колодец круглого дна 96-хорошо пластины, и инкубировать в 37-градусный по Цельсию, 5%CO2 инкубатор в течение 48 часов. После полной инкубации центрифуга пластины в 423 раза G, и комнатная температура, в течение восьми минут.Удалите 100 микролитров среды из каждой колодец, и собрать его в конической трубе перед отбрасывания, с тем чтобы подтвердить не потери бисера. Затем повторно помеская клеточная гранула в оставшиеся 100 микролитров среды, и собрать все в 1,5-миллилитровую трубку. Чтобы изолировать клетки CD4, добавьте 50 микролитров предварительно вымытых конъюгированных бусин CD4 в 500 000 ячеек в один миллилитр полного RPMI и инвертируйте для смешивания.Инкубировать в течение 20 минут при четырех градусах по Цельсию, в то время как руки стряхивая каждые шесть минут, чтобы смешать. Поместите трубку на магнит в течение двух минут, пока супернатант не будет ясен, а затем удалить и выбросить. Снимите трубку с магнита.Вымойте клетки, связанные бисером, повторно помыв их в один миллилитр PBS, плюс 2%FCS, и поместите трубку обратно на магнит в течение одной минуты. Откажитесь от явного супернатанта и повторите этот процесс в общей сложности три моет. После окончательной стирки поместите трубку на магнит на одну минуту.Удалите его, отбросьте супернатант и поместите гранулы на лед. Далее, чтобы выполнить изоляцию ядер, перерасход бисера и клеток в 50 микролитров холодного буфера лиза, и центрифуга сразу при 500 G, четыре градуса по Цельсию, в течение 10 минут. Удалите и отбросьте супернатант.Для выполнения реакции транспозазы, повторно использовать изолированные ядра гранулы с 50 микролитров Tn5 транспозазы смеси. Инкубировать в термоциклер в течение 30 минут при 37 градусах по Цельсию, с крышкой установить до 40 градусов по Цельсию, а затем провести при четырех градусах по Цельсию, когда завершена. Сразу же после термоциклов, выполнить быстрый скамейке верхней центрифуги спин-вниз.Поместите трубку на магнит в течение одной минуты, чтобы удалить бисер из продукта. Не удаляя трубку из магнита, перенесите четкий супернатант в колонку для очистки ДНК. Вымойте столбец один раз с 250 микролитров буфера ПБ, и дважды с 750 микролитров буфера PE.Затем добавьте 10 микролитров буфера elution, чтобы утехать образец. Настройка первоначальной реакции усиления ПЦР в трубке ПЦР без нуклеазы. Поместите трубку ПЦР в термоциклер и запустите программу усиления ПЦР.Затем завершите окончательное усиление ПЦР оставшихся 45 микролитров реакции ПЦР, как описано в рукописи. Поместите трубку ПЦР в термоциклер и запустите программу. После полного усиления очистите библиотеки с помощью комплекта очистки PCR, следуя протоколу производителя, утеря в 25 микролитров буфера elution.Последовательность подготовленных библиотек на секвенсоре следующего поколения со средней глубиной чтения 42 миллиона считых на образец. Этот улучшенный протокол ATAC-seq подготовил окончательную библиотеку с более чем одним нанограммом на микролитер для секвенирования. Контроль качества показал фрагменты ДНК между 200 и 1000 базовых пар, и дальнейшее секвенирование было выполнено с этими высококачественных библиотек.Библиотеки, подготовленные по этому протоколу, показали лишь 3%митохондриального загрязнения. Высокий процент годных к использования считых материалов достаточно постоянн в биологических репликациях. Этот протокол обеспечил весьма воспроизводимые результаты по техническим репликациям, а также биологическим репликациям.Кроме того, этот протокол занял 48 часов, а не одну неделю или более, как описано ранее, что привело к последовательной и эффективной активации, о чем свидетельствуют воспроизводимые результаты последовательности. Кроме того, прогнозируемые пики ATAC-seq были точно вызваны аналитическим конвейером. Анализ результатов секвенирования выявил явные изменения в состоянии хроматина во время активации Т-клеток человека.Дифференциально доступные области открытого хроматина были выявлены между шестью образцами до и через 48 часов после активации. Убедитесь, что реакция лиза ядер выполняется с охлажденными реагентами и материалами, чтобы максимизировать восстановление нетронутых ядер. Наш модифицированный буфер лиза ядер мягче на клетках, и сводит к минимуму загрязнение митохондриальной ДНК.Мы с нетерпением ожидаем, что этот модифицированный буфер лиза будет применяться и к одноядерным ATAC-seq. Мы знаем, что этот протокол позволит исследователям производить высококачественные данные ATAC-seq по сниженным затратам, помогая продвигать эпигенетическое поле. Протокол прост, быстр и не требует каких-либо опасных реагентов или инструментов, что делает его легко доступным для тех, кто является новым для ATAC-seq.

Research

JoVE Journal

Genetics

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

Конструкция и использование низкой стоимости, Автоматизированная Morbidostat для адаптивной эволюции бактерий в Антибиотик Выбор лекарственных средств

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

В Ситу маркировки репликации митохондриальной ДНК в Drosophila взрослых яичников с помощью EDU Окрашивание

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

Оценка загрязнения ДНК в образцах РНК, основанный на рибосомной ДНК

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Картирование генома всей доступной хроматина в основной человеческий Т-лимфоцитов, ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Методология для точного обнаружения метилирования митохондриальной ДНК

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Изоляция, виртуализации и анализа внеклеточного микроРНК от мезенхимальных стволовых клеток человека

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

Лентивирные посредничества Джин Silencing в человека Pseudoislet Подготовлено в низких пластин присоединения

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...

Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas

Опухолевая сфера произвлечения и лечения из первичных опухолевых клеток, изолированных от мыши Rhabdomyosarcomas

Rhabdomyosarcoma (RMS) is the most common soft tissue sarcoma in children. Although significant efforts have enabled the identification of common ...

Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues

Микроспутниковая ДНК Генотипирование и поток Цитометрия Плоиди Анализ формалин фиксированной Парафин-встроенный Hydatidiform Моляровые ткани

Hydatidiform mole (HM) is an abnormal human pregnancy characterized by excessive trophoblastic proliferation and abnormal embryonic development. There are ...

3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells

3D Многоцветный инструмент ДНК FISH для изучения ядерной архитектуры в первичных клетках человека

A major question in cell biology is genomic organization within the nuclear space and how chromatin architecture can influence processes such as gene ...