Name: atac-seq assay with low mitochondrial dna contamination from primary human cd4+ t lymphocytes
Uploaded: 2019-03-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes at JoVE.com

Vi tackar Atsede Siba för teknisk support. C.S.C. stöds av NIH grant 1R61DA047032.

Detta förbättrade protokoll innehåller stegvisa instruktioner för att utföra ATAC-seq av CD4 + lymfocyter, från utgångsmaterialet helblod genom dataanalys (figur 1).
1. isolering av CD4 + T-celler från helblod
Obs: Utgångsmaterialet för detta protokoll är 15 mL av färskt helblod samlas in med hjälp av standardiserade förfaranden, så att källan av utgångsmaterialet väljas baserat på forskningsbehov. Skal...

<ol>
	<li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin,+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position.">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li><li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATAC-seq:+A+Method+for+Assaying+Chromatin+Accessibility+Genome-Wide.">ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 21, 1-29 (2015).</li><li>Song, L., Crawford, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNase-seq:+a+high-resolution+technique+for+mapping+active+gene+regulatory+elements+across+the+genome+from+mammalian+cells.">DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (2), (2010).</li><li>Pajoro, A., Mui&#241;o, J. M., Angenent, G. C., Kaufmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+Nucleosome+Occupancy+by+MNase-seq:+Experimental+Protocol+and+Computational+Analysis.">Profiling Nucleosome Occupancy by MNase-seq: Experimental Protocol and Computational Analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1675, 167-181 (2018).</li><li>Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAIRE+(Formaldehyde-Assisted+Isolation+of+Regulatory+Elements)+isolates+active+regulatory+elements+from+human+chromatin.">FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin.</a> Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).</li><li>Rosenberg, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+profiling+of+the+developing+mouse+brain+and+spinal+cord+with+split-pool+barcoding.">Single-cell profiling of the developing mouse brain and spinal cord with split-pool barcoding.</a> Science. 360 (6385), 176-182 (2018).</li><li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-specific+and+single-cell+chromatin+accessibility+charts+human+hematopoiesis+and+leukemia+evolution.">Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution.</a> Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).</li><li>Lu, Z., Hofmeister, B. T., Vollmers, C., DuBois, R. M., Schmitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+ATAC-seq+with+nuclei+sorting+for+discovery+of+cis-regulatory+regions+in+plant+genomes.">Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes.</a> Nucleic Acids Research. 45 (6), e41 (2017).</li><li>Lara-Astiaso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+state+dynamics+during+blood+formation.">Chromatin state dynamics during blood formation.</a> Science. 345 (6199), 943-949 (2014).</li><li>Gate, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+determinants+of+co-accessible+chromatin+regions+in+activated+T+cells+across+humans.">Genetic determinants of co-accessible chromatin regions in activated T cells across humans.</a> Nature Genetics. , (2018).</li><li>Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+interrogation+of+functional+elements+in+the+noncoding+genome.">High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome.</a> Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).</li><li>. FastQC A Quality Control tool for High Throughput Sequence Data. Babraham Bioinformatics Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc</a> (2018)</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+ATAC-seq+protocol+reduces+background+and+enables+interrogation+of+frozen+tissues.">An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues.</a> Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+accessible+chromatin+in+mammalian+preimplantation+embryos.">The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos.</a> Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).</li></ol>

Protokollet för modifierade ATAC-seq som presenteras i denna artikel ger reproducerbara resultat med minimal Mitokondrie DNA-kontaminering. Protokollet har framgångsrikt används för att karakterisera kromatin arkitekturen av människans primära PBMC10, humana monocyter, mus dendritiska celler (opublicerade) och odlade melanom cell linjer11. Vi räknar denna förbättrade lysis skick har potential att fungera för andra celltyper samt. Det förväntas också att detta a...

Analysen för transposase-tillgänglig kromatin sekvensering (ATAC-seq) har snabbt blivit den ledande metoden för förhör kromatin arkitekturen. ATAC-seq kan identifiera regioner av tillgängliga kromatin genom processen för tagmentation, fragmentera och taggning av DNA av samma enzym, att producera bibliotek som sekvensering kan bestämma kromatin tillgänglighet över en hela arvsmassa. Denna tagmentation process medieras av den hyperaktiva Tn5 transposase, som endast skär öppna regioner av kromatin på grund av nucleosomic Sterisk hinder. Eftersom det skär, skär den Tn5 transposase också sekvensering adaptrar som möjliggör snabb bibliotek konstruktion med PCR och nästa generations sekvensering av genome-wide tillgängliga kromatin1,2.
ATAC-seq har blivit rekommenderad metod för att bestämma regioner av kromatin tillgänglighet på grund av relativt enkel och snabb protokoll, kvalitet och utbud av information som kan vara beslutsam från dess resultat, och liten mängd utgångsmaterial krävs. Jämfört med DNAS-seq3 (som också mäter genome-wide kromatin tillgänglighet), MNase-seq4 (som bestämmer nukleosomens positioner i öppen genomet regioner) och formaldehyd-medierad FAIRE-seq5, ATAC-seq är snabbare, billigare och mer reproducerbar1. Det är också mer känsliga, arbeta med utgångsmaterial för så få som 500 kärnor, jämfört med 50 miljoner atomkärnor krävs för DNAS-seq3. ATAC-seq har också möjlighet att ge mer information om kromatin arkitekturen än andra metoder, inklusive regioner av transkription faktorn bindande, nukleosomens placering och öppna kromatin regionerna1. Effektiva, encelliga ATAC-seq protokoll har validerats, tillhandahålla information om kromatin arkitektur vid enskild cell nivå6,7.
ATAC-seq har använts för att karakterisera kromatin arkitektur över ett brett spektrum av typer av forskning och celler, inklusive växter8, människor9och många andra organismer. Det har också varit kritiska att identifiera epigenetisk reglering av sjukdom staterna7. Protokollet används mest ATAC-seq innehåller dock den stora nackdelen med kontaminering sekvensering läsningar av Mitokondrie-DNA. I vissa datauppsättningar, kan denna förorening vara så hög som 60% av sekvensering resultat1. Det finns en samlad insats i fältet för att minska dessa kontaminerande mitokondriell läsningar för att möjliggöra en effektivare tillämpning av ATAC-seq7,10,11. Här presenterar vi ett förbättrat ATAC-seq-protokoll som minskar andelen kontaminering av Mitokondrie DNA till bara 3%, vilket gör att minskning på cirka 50% sekvensering kostnader10. Detta möjliggörs genom en strömlinjeformad process av CD4 + lymfocyter isolering och aktivering och en förbättrad lyseringsbuffert som är avgörande för att minimera Mitokondrie DNA-kontaminering.
Denna modifiedATAC-seq-protokollet har validerats med ett brett utbud av primära celler, inklusive människans primära perifera mononukleära blodceller (PBMC)10, människans primära monocyter och mus dendritiska celler (opublicerade). Det har även använts framgångsrikt att förhöra melanom cell linjer i en klustrad regelbundet mellanliggande kort palindromic repetitioner (CRISPR) skärm av icke-kodande elements11. Dessutom förser Filpaketet data analys beskrivs i detta protokoll och som anges på GitHub nya och erfarna forskare med verktyg för att analysera ATAC-seq data. ATAC-seq är den mest effektiva analysen att mappa kromatin tillgänglighet över en hela arvsmassa, och ändringar av befintliga protokoll som införs här gör att forskare att producera högkvalitativa data med låg Mitokondrie DNA kontaminering, att minska sekvensering kostnader och förbättra ATAC-seq genomströmning.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X PBS, Sterile</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5810/5810&#160;R Swing Bucket Refrigerated Centrifuge with 50 mL, 15 mL, and 1.5 mL Tube Buckets</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22625501</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Round Bottom Plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>163320</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 4200 Tape Station System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>374081</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>11131D</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>11346D</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamagnet</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Gemini Bio Products</td>
			<td>100-500</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>50674626</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2393</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute PCR Purification Kit (Buffer PB, Buffer PE, Elution Buffer)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext High Fidelity 2X PCR Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0541</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera DNA Library Preparation Kit (2X TD Buffer, Tn5 Enzyme)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC1211030</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free Sterile dH20</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10977015</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20 (Tween20)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A25780</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Water Bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TSGP02</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit FlouroMeter</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosette Sep Human CD4+ Density Medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>15705</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>15022</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Resevoir</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>8096-11</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermocycler with Heated Lid</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5941</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atac-seq assay with low mitochondrial dna contamination from primary human cd4+ t lymphocytes

ATAC-seq har blivit en allmänt använd metod i studiet av epigenetik på grund av dess snabba och enkla strategi att mappning av genome-wide tillgängliga kromatin. I denna uppsats presenterar vi ett förbättrat ATAC-seq-protokoll som minskar kontaminerande Mitokondrie DNA läsningar. Medan tidigare ATAC-seq protokoll har kämpat med läser i genomsnitt 50% kontaminerande Mitokondrie-DNA, optimerad lyseringsbuffert infört i protokollet minskar Mitokondrie DNA-kontaminering till i genomsnitt på 3%. Detta förbättrade ATAC-seq-protokollet möjliggör en nära 50% minskning av sekvensering kostnaden. Vi visar hur dessa högkvalitativa ATAC-seq bibliotek kan framställas från aktiverade CD4 + lymfocyter, som tillhandahåller stegvisa instruktioner från CD4 + lymfocyter isolering från helblod genom analys av data. Detta förbättrade ATAC-seq-protokollet har validerats i en rad olika celltyper och kommer att vara till omedelbar nytta för forskare som studerar kromatin tillgänglighet.

Från 15 mL av färskt helblod genererar detta protokoll ett genomsnitt på 1 miljon CD4 + T-celler. Dessa kan frysas för senare behandling eller användas omedelbart. Lönsamhet av CD4 + T celler, färska eller tinade, var konsekvent > 95%. Denna metod av CD4 + T cell isolering ger flexibilitet i källa material och samling tid. Detta förbättrade ATAC-seq protokoll producerar ett sista bibliotek med större än 1 ng/µL för sekvensering. Kvalitetskontroll utförs med hjälp av kommer...

Watch this Scientific Journal Video about ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes at JoVE.com

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

Här presenterar vi ett protokoll för att utföra ett test för transposase-tillgänglig kromatin sekvensering (ATAC-seq) på aktiverade CD4 + mänskligt lymfocyter. Protokollet har modifierats för att minimera kontaminering Mitokondrie DNA läsningar från 50% till 3% genom införandet av en ny lyseringsbuffert.

ATAC-seq Assay med låg Mitokondrie-DNA kontaminering från primära humana CD4 + T-lymfocyter

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

Detta modifierade ATAC-seq-protokoll inför en ny lysbuffert som minskar förorenande mitokondriellt läsningar från 50%till mindre än 3%Den minskade mitokondriella kontamineringen gör det möjligt för forskare att utföra effektivare ATAC-sekvensq med en 50%minskning av sekvenseringskostnader. Vi har validerat detta nya ATAC-seq-protokoll i mänskliga primära PBMCs, mänskliga primära monocyter, mus dendritiska celler och melanom cellinjer. Vi tror att det kommer att vara effektivt i ett brett spektrum av celltyper.Att minimera provförlust under cellaktiverings- och urvalsprocessen är avgörande för att erhålla högkvalitativa resultat med ATAC-seq. Vi kommer att demonstrera hur man hanterar ett litet antal celler från dyrbara prover med hjälp av grundläggande laboratorieutrustning. Till att börja med tina en flaska tidigare isolerade CD4 + T-celler i en 37-graders Celsius vattenbad tills isen har just smält.Sedan försiktigt överföra cellerna till en 15-milliliter koniska rör som innehåller nio milliliter av förvörd komplett RPMI. Centrifugera cellerna vid 1, 500 gånger G, och fyra grader Celsius, i sex minuter. Sedan kasta supernatant, och försiktigt återanvända pelleten i två milliliter av komplett RPMI.Efter att centrifugeringen upprepats, kassera supernatanten och försiktigt återanvända cellerna i 0,5 milliliter av komplett RPMI. Använd en hemocytometer för att räkna cellerna. Med hjälp av kompletta RPMI, justera cellen suspensionens densitet till plattan 50, 000 CD4 +celler i 200 mikroliter per brunn av en 96-väl rund-botten platta.Sedan, för att förbereda magnetiska pärlor, alikvot 12,5 mikroliter av Human T-Activator CD3/CD28 pärlor per ATAC-seq prov till en 1,5 milliliter rör. Tillsätt en milliliter av 1x PBS till röret, och placera den på en magnet i en minut för att tvätta pärlorna. Ta försiktigt bort och kassera den klara supernatanten, och ta bort röret från magneten.Resuspend pärlorna i 13 mikroliter av komplett RPMI per ATAC-seq prov. För att aktivera CD4+T-cellerna med den justerade koncentrationen, samla 500, 000 celler i 2,1 milliliter av komplett RPMI-medium i ett koniskt rör på 15 milliliter. Tillsätt 12,5 mikroliter av Human T-Activator pärlor, förberedda och tvättade i tidigare steg, och blanda försiktigt genom att invertera röret.Överför sedan försiktigt cellerna, med pärlor, till en steril reservoar. Med hjälp av en flerkanalspipett, plattan 200 mikroliter celler med pärlor per brunn av en rund-botten 96-brunnsplatta, och inkubera i en 37-graders Celsius, 5%CO2 inkubator i 48 timmar. Efter fullständig inkubation, centrifug plåten vid 423 gånger G, och rumstemperatur, i åtta minuter.Ta bort 100 mikroliter medium från varje brunn, och samla in den i ett koniskt rör innan du kasserar, för att bekräfta ingen pärla förlust. Sedan resuspend cellen pelleten i de återstående 100 mikroliter av medium, och samla allt i en 1,5-milliliter rör. För att isolera CD4+celler, tillsätt 50 mikroliter av förtvättade CD4 konjugerade pärlor till 500, 000 celler i en milliliter av komplett RPMI, och invertera att blanda.Inkubera i 20 minuter vid fyra grader Celsius, medan hand-flicking var sjätte minut för att blanda. Placera röret på magneten i två minuter, tills supernatanten är klar och ta sedan bort och kassera. Ta bort röret från magneten.Tvätta pärla-bundna celler genom att resuspending dem i en milliliter av PBS, plus 2% FCS, och placera röret tillbaka på magneten i en minut. Kasta den tydliga supernatanten och upprepa denna process för totalt tre tvättar. Efter den slutliga tvätten, placera röret på magneten i en minut.Ta bort den, kasta supernatanten och lägg pelleten på is. Nästa, för att utföra kärnor isolering, resuspend pärlorna och cellerna i 50 mikroliter av kall lys buffert, och centrifug omedelbart vid 500 G, fyra grader Celsius, i 10 minuter. Ta bort och kasta supernatanten.För att utföra transposasreaktionen, resuspend den isolerade kärnor pellet med 50 mikroliter av Tn5 transposase mix. Inkubera i en termocyklare i 30 minuter vid 37 grader Celsius, med locket inställt på 40 grader Celsius, och håll sedan vid fyra grader Celsius när det är klart. Omedelbart efter thermocycling, utför en snabb bänk-top centrifuge spin-down.Placera röret på magneten i en minut för att ta bort pärlorna från produkten. Utan att ta bort röret från magneten, överför den tydliga supernatanten till en DNA-reningskolumn. Tvätta kolonnen en gång med 250 mikroliter PB-buffert, och två gånger med 750 mikroliter PE-buffert.Tillsätt sedan 10 mikroliter elueringsbuffert för att elera provet. Ställ in den initiala PCR-amplifieringsreaktionen i ett nukleasfritt PCR-rör. Placera PCR-röret i termocyklern, och kör PCR-förstärkningsprogrammet.Slutför sedan den slutliga PCR-förstärkningen av de återstående 45 mikroliter av PCR-reaktionen, som beskrivs i manuskriptet. Placera PCR-röret i termocyklaren och kör programmet. Efter fullständig förstärkning, rena biblioteken med hjälp av en PCR cleanup kit, efter tillverkarens protokoll, eluering i 25 mikroliter av eluering buffert.Sekvens de förberedda biblioteken på en nästa generations sequencer till ett genomsnittligt läsdjup på 42 miljoner läsningar per prov. Detta förbättrade ATAC-seq-protokoll producerade ett slutligt bibliotek på större än ett nanogram per mikroliter för sekvensering. Kvalitetskontroll visade DNA-fragment mellan 200 och 1, 000 baspar, och ytterligare sekvensering utfördes med dessa högkvalitativa bibliotek.Bibliotek som utarbetats efter detta protokoll visade endast 3%mitokondriell kontaminering. Den höga andelen användbara avläsningar är tillräckligt konstant över biologiska replikat. Detta protokoll som mycket reproducerbara resultat över tekniska replikat, samt biologiska replikat.Dessutom tog detta protokoll 48 timmar, snarare än en vecka eller mer som tidigare beskrivits, vilket resulterar i konsekvent och effektiv aktivering, vilket visas av reproducerbara sekvenseringsresultat. Dessutom, förutspådde ATAC-seq toppar var korrekt kallas av analysen rörledningen. Sekvensering resultat analys visade tydliga förändringar i kromatin tillstånd under mänskliga T cell aktivering.Differentiellt åtkomliga regioner av öppna kromatin identifierades mellan sex prover före och 48 timmar efter aktivering. Se till att atomkärnor lysreaktionen utförs med kylda reagenser och material, för att maximera återvinningen av intakta kärnor. Vår modifierade kärnor lysbuffert är skonsammare för cellerna, och minimerar förorenande mitokondriellt DNA.Vi ser fram emot att denna modifierade lysbuffert tillämpas på enstaka kärnor ATAC-seq också. Vi vet att detta protokoll kommer att tillåta forskare att producera högre kvalitet ATAC-seq data till en minskad kostnad, hjälper till att vidarebefordra det epigenetiska området. Protokollet är enkelt, snabbt och kräver inga farliga reagenser eller instrument, vilket gör det lättillgängligt för de nya till ATAC-seq.

Research

JoVE Journal

Genetics

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

Utformning och användning av en låg kostnad, Automated Morbidostat för Adaptive Evolution av bakterier under antibiotikum Drug Val

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Märkning av mitokondrie-DNA-replikering i Drosophila vuxen Äggstockar från edu färgning

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

Bedömning av DNA kontaminering i RNA-prover baserat på Ribosomal DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Mappning av Genome-wide tillgängliga kromatin i primära humana T-lymfocyter av ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Metodik för korrekt upptäckt av mitokondrie-DNA metylering

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Isolera, sekvensering och analysera extracellulära mikroRNA från humana mesenkymala stamceller

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

Lentiviral medierad gen ljuddämpning i humant Pseudoholmen beredd i låga fästplattor

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...

Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas

Tumorsphere härledning och behandling från primära tumörceller isolerade från mus Rhabdomyosarcomas

Rhabdomyosarcoma (RMS) is the most common soft tissue sarcoma in children. Although significant efforts have enabled the identification of common ...

Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues

Microsatellite DNA genotypning och flödescytometri Ploidy analyser av formalin-fast paraffin-inbäddade Hydatidiform molar vävnader

Hydatidiform mole (HM) is an abnormal human pregnancy characterized by excessive trophoblastic proliferation and abnormal embryonic development. There are ...

3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells

3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells 3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells 3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells 3D

A major question in cell biology is genomic organization within the nuclear space and how chromatin architecture can influence processes such as gene ...