Name: atac-seq assay with low mitochondrial dna contamination from primary human cd4+ t lymphocytes
Uploaded: 2019-03-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes at JoVE.com

Atsede Siba teknik destek için teşekkür ederiz. C.S.C. NIH grant 1R61DA047032 tarafından desteklenir.

Bu geliştirilmiş iletişim kuralı veri analizi (şekil 1) ile tam kan başlangıç malzemesinden ataç-seq CD4 + lenfosit, gerçekleştirmek için adım adım yönergeler sağlar.
1. yalıtım CD4 + T hücre tam kan
Not: Başlangıç bu iletişim kuralı için seçilecek başlangıç materyali kaynağıdır araştırma gereksinimleri temel alarak izin veren standart prosedürler kullanarak toplanan taze tam kan 15 mL m...

<ol>
	<li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin,+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position.">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li><li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATAC-seq:+A+Method+for+Assaying+Chromatin+Accessibility+Genome-Wide.">ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 21, 1-29 (2015).</li><li>Song, L., Crawford, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNase-seq:+a+high-resolution+technique+for+mapping+active+gene+regulatory+elements+across+the+genome+from+mammalian+cells.">DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (2), (2010).</li><li>Pajoro, A., Mui&#241;o, J. M., Angenent, G. C., Kaufmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+Nucleosome+Occupancy+by+MNase-seq:+Experimental+Protocol+and+Computational+Analysis.">Profiling Nucleosome Occupancy by MNase-seq: Experimental Protocol and Computational Analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1675, 167-181 (2018).</li><li>Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAIRE+(Formaldehyde-Assisted+Isolation+of+Regulatory+Elements)+isolates+active+regulatory+elements+from+human+chromatin.">FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin.</a> Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).</li><li>Rosenberg, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+profiling+of+the+developing+mouse+brain+and+spinal+cord+with+split-pool+barcoding.">Single-cell profiling of the developing mouse brain and spinal cord with split-pool barcoding.</a> Science. 360 (6385), 176-182 (2018).</li><li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-specific+and+single-cell+chromatin+accessibility+charts+human+hematopoiesis+and+leukemia+evolution.">Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution.</a> Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).</li><li>Lu, Z., Hofmeister, B. T., Vollmers, C., DuBois, R. M., Schmitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+ATAC-seq+with+nuclei+sorting+for+discovery+of+cis-regulatory+regions+in+plant+genomes.">Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes.</a> Nucleic Acids Research. 45 (6), e41 (2017).</li><li>Lara-Astiaso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+state+dynamics+during+blood+formation.">Chromatin state dynamics during blood formation.</a> Science. 345 (6199), 943-949 (2014).</li><li>Gate, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+determinants+of+co-accessible+chromatin+regions+in+activated+T+cells+across+humans.">Genetic determinants of co-accessible chromatin regions in activated T cells across humans.</a> Nature Genetics. , (2018).</li><li>Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+interrogation+of+functional+elements+in+the+noncoding+genome.">High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome.</a> Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).</li><li>. FastQC A Quality Control tool for High Throughput Sequence Data. Babraham Bioinformatics Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc</a> (2018)</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+ATAC-seq+protocol+reduces+background+and+enables+interrogation+of+frozen+tissues.">An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues.</a> Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+accessible+chromatin+in+mammalian+preimplantation+embryos.">The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos.</a> Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).</li></ol>

Bu makalede sunulan değiştirilmiş ataç-seq protokolü en az mitokondrial DNA kirlenme ile tekrarlanabilir sonuçlar sağlar. Protokol başarıyla Kromatin mimari insan birincil PBMCs10, insan monosit, fare dendritik hücreler (yayınlanmamış) karakterize ve kültürlü melanoma hücre11hatları için kullanılmıştır. Biz bu geliştirilmiş lizis tahmin durumu diğer hücre türleri için de iş potansiyeline sahiptir. Ayrıca bu çekirdeklerin yalıtım iletişim k...

Tahlil transposase erişilebilir Kromatin (ataç-seq) sıralama için hızla Kromatin mimari sorguya için önde gelen yöntem haline gelmiştir. ATAÇ-seq tagmentation, parçalanan ve DNA'ın hangi ile karşıdan karşıya tüm bir genom Kromatin erişilebilirlik sıralama belirleyebilirsiniz kitaplıkları üretmek için aynı enzim tarafından etiketleme işlemi boyunca erişilebilir Kromatin bölgeleri tanımlayabilirsiniz. Bu tagmentation işlem yalnızca Kromatin nucleosomic steric engel nedeniyle açık bölgelerinde keser hiperaktif Tn5 transposase tarafından aracılık ettiği. Bu kesim, Tn5 transposase da hızlı Kütüphane İnşaat tarafından PCR ve yeni nesil sıralama genom genelinde erişilebilir Kromatin1,2için izin sıralaması bağdaştırıcısı ekler.
ATAÇ-seq Kromatin erişilebilirlik nispeten basit ve hızlı iletişim kuralı, kalite ve onun sonuçları ve az miktarda malzeme gerekli başlangıç belirlenebilir bilgi yelpazesi nedeniyle bölgelerinde belirlemek için tercih edilen yöntem haline gelmiştir. (Hangi Ayrıca genom çapında Kromatin erişilebilirlik) Dnaz seq3 , MNase-seq4 (hangi açık genom nucleosome tüfekleriyle belirler) karşılaştırıldığında ve formaldehit aracılı FAIRE-seq5, ATAÇ-seq hızlıdır, daha ucuz ve daha tekrarlanabilir1. Dnaz seq3için gerekli 50 milyon çekirdeği göre 500 çekirdeği olarak az malzeme ile başlayan çalışma daha hassas da. ATAÇ-seq da transkripsiyon faktörü bağlama, nucleosome konumlandırma ve açık Kromatin bölgeleri1de dahil olmak üzere diğer yöntemlere göre Kromatin mimarisi hakkında daha fazla bilgi sağlama yeteneği vardır. Etkili, tek hücreli ataç-seq protokolleri doğrulandıktan, tek hücreli seviye6,7, Kromatin mimarisi hakkında bilgi sağlarsınız.
ATAÇ-seq Kromatin Mimarlık araştırma ve hücre türleri, bitkiler8, insanlar9ve birçok diğer organizmalar da dahil olmak üzere geniş bir spektrum üzerinde tanımlamak için kullanılmıştır. Ayrıca hastalık Birleşik7epigenetik Yönetmeliği teşhis etmek için kritik olmuştur. Ancak, en yaygın kullanılan ataç-seq Protokolü önemli dezavantajı kirlenme sıralama okunma mitokondrial DNA içerir. Bazı veri kümeleri bu kontaminasyon düzeyi olarak sıralama sonuçlar%160 yüksek olabilir. ATAÇ-seq7,10,11daha verimli kullanma için izin vermek için bu bulaşıcı mitokondrial okuma azaltmak üzere alana bir çaba olduğunu. Burada yaklaşık % 50 azalma sıralama maliyeti10dakika sonra izin mitokondrial DNA kirlenme oranı sadece % 3, azaltır geliştirilmiş bir ataç-seq Protokolü mevcut. Bu aerodinamik sürecin CD4 + lenfosit yalıtım ve harekete geçirmek ve mitokondriyal DNA kirlenme minimize kritik bir geliştirilmiş lizis arabellek mümkün olmaktadır.
Bu modifiedATAC-seq Protokolü Primer hücre, insan birincil periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs)10, insan birincil monosit ve fare dendritik hücreler (yayınlanmamış) de dahil olmak üzere geniş bir doğrulandı. Bu da başarıyla melanoma hücre hatlarında kümelenmiş bir düzenli olarak interspaced kısa palindromik yineler (CRISPR) ekran öğeleri11kodlamayan sorguya çekmek için kullanılmıştır. Ayrıca, bu protokol için açıklanan ve GitHub üzerinde sağlanan veri çözümleme paketi ataç-seq verileri çözümlemek için yeni ve deneyimli araştırmacılar araçları sağlar. ATAÇ-seq Kromatin erişilebilirlik tüm bir genom eşlemek için en etkili tahlil olduğunu ve burada sunulan değişiklikler mevcut protokol için araştırmacılar yüksek kaliteli veri düşük mitokondrial DNA kirlenme ile üretmek için izin verir, sıralama maliyeti azaltır ve ataç-seq üretilen iş.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X PBS, Sterile</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5810/5810&#160;R Swing Bucket Refrigerated Centrifuge with 50 mL, 15 mL, and 1.5 mL Tube Buckets</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22625501</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Round Bottom Plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>163320</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 4200 Tape Station System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>374081</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>11131D</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>11346D</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamagnet</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Gemini Bio Products</td>
			<td>100-500</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>50674626</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2393</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute PCR Purification Kit (Buffer PB, Buffer PE, Elution Buffer)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext High Fidelity 2X PCR Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0541</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera DNA Library Preparation Kit (2X TD Buffer, Tn5 Enzyme)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC1211030</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free Sterile dH20</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10977015</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20 (Tween20)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A25780</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Water Bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TSGP02</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit FlouroMeter</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosette Sep Human CD4+ Density Medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>15705</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>15022</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Resevoir</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>8096-11</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermocycler with Heated Lid</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5941</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atac-seq assay with low mitochondrial dna contamination from primary human cd4+ t lymphocytes

ATAÇ-seq epigenetik genom genelinde erişilebilir Kromatin eşleme için hızlı ve basit yaklaşımı nedeniyle çalışmada yaygın olarak kullanılan bir yöntem haline gelmiştir. Bu yazıda biz mitokondrial DNA okuma kirletici azaltır geliştirilmiş bir ataç-seq Protokolü mevcut. Önceki ataç-seq protokolleri ile mücadele var ise ortalama % 50 oranında mitokondrial DNA kirletici okur, bu protokol için sunulan en iyi duruma getirilmiş lizis arabellek % 3 ortalama mitokondrial DNA kirlenme azaltır. Bu gelişmiş ataç-seq iletişim kuralı sıralaması maliyet bir çevre % 50 azalma sağlar. Bu yüksek kaliteli ataç-seq kütüphanelerin aktif CD4 + lenfositlerinin, hazır nasıl CD4 + lenfosit izolasyonu tam kan veri analizi ile kimden adım adım yönergeler sağlama göstermektedir. Bu gelişmiş ataç-seq Protokolü hücre tipleri geniş bir doğrulanır ve Kromatin erişilebilirlik eğitim araştırmacılar için acele kullanma olacaktır.

Taze tam kan 15 mL, bu protokol ortalama 1 milyon CD4 + T hücreleri oluşturur. Bunlar daha sonra işlenmek için dondurulmuş ya da hemen kullanılabilir. CD4 + T hücreleri, taze veya çözülmüş, canlılık olduğunu sürekli > % 95. Bu yöntem CD4 + T hücre izolasyon kaynak malzeme ve toplama zamanında için esneklik sağlar. Bu gelişmiş ataç-seq Protokolü 1 ng/µL sıralama için daha büyük bir final Kütüphanesi üretir. Kalite kontrol ticari olarak mevcut sistemleri kul...

Watch this Scientific Journal Video about ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes at JoVE.com

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

Burada, bir tahlil transposase erişilebilir Kromatin (ataç-seq) aktif CD4 + insan lenfositler üzerinde sıralama için gerçekleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Protokol % 50 mitokondrial DNA okuma yeni bir lizis arabellek başlanarak % 3 bulaşıcı en aza indirmek için değiştirildi.

ATAÇ-seq tahlil birincil insan CD4 + T lenfositleri kirlenme düşük mitokondrial DNA ile

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

Bu modifiye ATAC-seq protokolü, mitokondriyal okumaların kontamine sini azaltan yeni bir lisis tamponunu %50'den %3'ün daha az azaltan mitokondriyal kontaminasyonun azalması araştırmacıların sıralama maliyetlerinde %50'lik bir düşüşle daha verimli ATAC-seq yapmalarını sağlayacaktır. Bu yeni ATAC-seq protokolünü insan primer PBMC'lerinde, insan primer monositlerinde, fare dendritik hücrelerinde ve melanom hücre hatlarında doğruladık. Çok çeşitli hücre tiplerinde etkili olacağına inanıyoruz.Hücre aktivasyonu ve seçim sürecinde örnek kaybını en aza indirmek, ATAC-seq ile yüksek kaliteli sonuçlar elde etmek için çok önemlidir. Temel laboratuvar ekipmanlarını kullanarak değerli numunelerden az sayıda hücrenin nasıl işleyeceğini göstereceğiz. Başlamak için, buz eriyene kadar 37 derecelik santigrat su banyosunda önceden izole edilmiş CD4+T hücrelerinden oluşan bir şişeyi eritin.Daha sonra hücreleri hafifçe, önceden ısıtılmış tam RPMI'nin dokuz mililitresini içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Hücreleri 1, 500 kat G ve dört santigrat derecede altı dakika santrifüj edin. Sonra supernatant atın ve yavaşça tam RPMI iki mililitre pelet resuspend.Santrifüjü tekrarladıktan sonra, süpernatantı atın ve hücreleri 0,5 mililitre tam RPMI'de yavaşça askıya alın. Hücreleri saymak için bir hemositometre kullanın. Tam RPMI kullanarak, hücre süspansiyon yoğunluğunu 96 kuyulu yuvarlak alt plakanın kuyusu başına 200 mikrolitrede 50, 000 CD4+hücreye ayarlayın.Daha sonra, manyetik boncukhazırlamak için, 1.5 mililitrelik bir tüp aTAC-seq örnek başına İnsan T-Aktivatör CD3/CD28 boncuk 12.5 mikrolitre aliquot. Tüpe bir mililitre 1x PBS ekleyin ve boncukları yıkamak için bir dakika lığına mıknatısın üzerine yerleştirin. Dikkatle kaldırmak ve net supernatant atın ve mıknatıs tan tüp çıkarın.ATAC-seq numunesi başına 13 mikrolitre komple RPMI boncukları yeniden askıya alın. Cd4+T hücrelerini ayarlanmış konsantrasyonla etkinleştirmek için, 15 mililitrelik konik bir tüpte 2,1 mililitre tam RPMI ortamında 500,000 hücre toplayın. İnsan T-Aktivatör boncuk12,5 mikrolitre ekleyin, hazırlanan ve önceki adımlarda yıkanmış, ve yavaşça tüp ters karıştırarak.Sonra yavaşça steril bir rezervuar için, boncuk ile hücreleri aktarın. Çok kanallı bir pipet kullanarak, yuvarlak dipli 96 kuyulu bir plakanın kuyusuna boncuk içeren 200 mikrolitre hücre plakası ve 48 saat boyunca 37 derece santigrat, %5 CO2 kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın. Tam kuluçkadan sonra, plakayı 423 kez G ve oda sıcaklığında sekiz dakika santrifüj edin.Her kuyudan 100 mikrolitre orta litre çıkarın ve boncuk kaybını doğrulamak için atmadan önce konik bir tüpte toplayın. Daha sonra orta kalan 100 mikrolitre hücre pelet resuspend ve 1.5 mililitrelik bir tüp her şeyi toplamak. CD4+hücrelerini izole etmek için, 50 mikrolitre önceden yıkanmış CD4 konjuge boncukları bir mililitre lik tam RPMI'de 500, 000 hücreye ekleyin ve karıştırmak için ters çevirin.Dört santigrat derecede 20 dakika kuluçkaya yat, karıştırmak için her altı dakikada bir el ile hareket ettirin. Tüpü iki dakika boyunca mıknatısın üzerine yerleştirin, ta ki supernatant temiz olana kadar, ve sonra çıkarıp atın. Tüpü mıknatıstan çıkarın.Boncuk la bağlı hücreleri bir mililitre PBS,artı %2 FCS'de yeniden suyararak yıkayın ve tüpü bir dakika lığına mıknatısın üzerine yerleştirin. Açık supernatant atın ve üç yıkar toplam için bu işlemi tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, bir dakika için mıknatıs üzerinde tüp yerleştirin.Çıkarın, supernatant atın ve buz üzerine pelet yerleştirin. Daha sonra, çekirdek izolasyongerçekleştirmek için, soğuk lysis tampon 50 mikrolitre boncuk ve hücreleri yeniden askıya almak ve santrifüj hemen 500 G, dört derece santigrat, 10 dakika. Supernatant'ı çıkarın ve atın.Transposaz reaksiyonu gerçekleştirmek için, 50 mikrolitre Tn5 transposaz karışımı ile izole çekirdek pelet resuspend. 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca bir termocycler inkübün, kapak 40 santigrat derece ayarlanmış, ve sonra tamamlandığında dört derece santigrat tutun. Termobisikletten hemen sonra, hızlı bir tezgah üstü santrifüj spin-down gerçekleştirin.Üründen boncukkaldırmak için bir dakika için mıknatıs üzerine tüp yerleştirin. Mıknatıstan tüpü çıkarmadan, berrak süpernatant'ı DNA arıtma sütununa aktarın. Kolonu 250 mikrolitre PB tamponu ve 750 mikrolitre PE tamponu ile iki kez yıkayın.Daha sonra numuneyi uzaklaştırmak için 10 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyin. Nucleaz içermeyen bir PCR tüpte ilk PCR amplifikasyon reaksiyonu ayarlayın. PCR tüpünü termocycler'a yerleştirin ve PCR amplifikasyon programını çalıştırın.Daha sonra, el yazmasında açıklandığı gibi kalan 45 mikrolitre PCR reaksiyonunun son PCR amplifikasyonunu tamamlayın. PCR tüpünü termocycler'a yerleştirin ve programı çalıştırın. Tam amplifikasyon sonra, bir PCR temizleme kiti kullanarak kütüphaneler arındırın, üreticinin protokolünü izleyerek, elüsyon arabelleği 25 mikrolitre eluting.Hazırlanan kitaplıkları yeni nesil bir sıralayıcıda, örnek başına ortalama 42 milyon okuma derinliğine sıralayın. Bu geliştirilmiş ATAC-seq protokolü sıralama için mikrolitre başına bir nanogramdan daha büyük bir son kütüphane üretti. Kalite kontrol 200 ve 1,000 baz çifti arasında DNA parçaları gösterdi ve daha fazla sıralama bu yüksek kaliteli kütüphaneler ile yapıldı.Bu protokol den sonra hazırlanan kütüphaneler de sadece %3 mitokondriyal kontaminasyon gösterdi. Kullanılabilir okumaların yüksek yüzdesi biyolojik çoğaltmalar arasında yeterince sabittir. Bu protokol, biyolojik kopyaların yanı sıra teknik kopyalar arasında son derece tekrarlanabilir sonuçlar sağladı.Ayrıca, bu protokol, daha önce açıklandığı gibi bir hafta veya daha fazla değil, 48 saat sürdü ve tekrarlanabilir sıralama sonuçlarıyla gösterildiği gibi tutarlı ve verimli etkinleştirme yle sonuçlandı. Ayrıca, tahmin ATAC-seq zirveleri doğru analiz boru hattı tarafından çağrıldı. Sıralama sonucu analizi insan T hücre aktivasyonu sırasında kromatin durumunda net değişiklikler ortaya koymuştur.Açık kromatinin farklı olarak erişilebilen bölgeleri aktivasyondan önce ve 48 saat sonra altı örnek arasında tanımlanmıştır. Bozulmamış çekirdeklerin geri kazanımını en üst düzeye çıkarmak için çekirdekli lysis reaksiyonunun soğutulmuş reaktifler ve malzemelerle yapıldığından emin olun. Modifiye çekirdekli lysis tamponumuz hücrelerde daha naziktir ve mitokondriyal DNA'yı kirleten en aza indirir.Bu modifiye lisis tamponunun tek çekirdekli ATAC-seq'a da uygulanmasını dört gözle bekliyoruz. Bu protokolün araştırmacıların daha yüksek kaliteli ATAC-seq verilerini daha düşük bir maliyetle üretmesine olanak sağlayacağını biliyoruz ve epigenetik alanın iletilmesine yardımcı olacaktır. Protokol basit, hızlı ve herhangi bir tehlikeli reaktif veya enstrüman gerektirmez, atac-seq yeni olanlar için kolayca erişilebilir hale.

Research

JoVE Journal

Genetics

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

Tasarım ve Düşük Maliyetli kullanımı, Otomatik Morbidostat Bakterilerin Adaptif Evolution için antibiyotik ilaç Seçimi Altında

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Edu Boyama tarafından Drosophila Yetişkin Yumurtalıkların Mitokondriyal DNA replikasyonu Yerinde Etiketlenmesi içinde

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

DNA kirlenme ribozomal DNA tabanlı RNA örneklerinde değerlendirilmesi

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Birincil insan T lenfositler tarafından ataç-Seq genom genelinde erişilebilir Kromatin eşleme

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Mitokondrial DNA metilasyonu doğru algılanması için metodoloji

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

İzole, sıralama ve insan Mezenkimal Kök hücreleri ekstrasellüler mikroRNA'lar analiz

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

Düşük ataşman plakalarına hazırlanmış ınsan Pseudoislet 'te lentiviral aracılı gen susturulması

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...

Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas

Mouse Rhabdomiyosarkomlardan İzole Edilen Primer Tümör Hücrelerinden Tümörfer Türevve Tedavisi

Rhabdomyosarcoma (RMS) is the most common soft tissue sarcoma in children. Although significant efforts have enabled the identification of common ...

Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues

Formalin-sabit Parafin gömülü Hydatidiform Molar Dokuların Mikrouydu DNA Genotipleme ve Akış Sitometri Ploidy Analizleri

Hydatidiform mole (HM) is an abnormal human pregnancy characterized by excessive trophoblastic proliferation and abnormal embryonic development. There are ...

3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells

3D Çok Renkli DNA FISH Aracı İnsan Birincil Hücrelerde Nükleer Mimari Çalışma

A major question in cell biology is genomic organization within the nuclear space and how chromatin architecture can influence processes such as gene ...