Name: measuring global cellular matrix metalloproteinase and metabolic activity in 3d hydrogels
Uploaded: 2019-01-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels at JoVE.com

المؤلف يود أن ينوه أوهايو السرطان البحث (OCR)، أوهايو، الولايات المتحدة الأمريكية لتمويل هذا العمل فضلا عن الملك سعود جامعة (جامعة الملك سعود)، الرياض، المملكة العربية السعودية لمقدمي البلاغ الأول. وتم قياس الوزن الجزيئي لاستشعار الببتيد نيون استخدام مصفوفة المساعدة، الامتزاز الليزر-التأين، وقت الطيران الكتلي (استخدام-TOF) مع مساعدة من الحرم الجامعي الكيميائية صك مركز قياس الطيف الكتلي والبروتينات مرفق في جامعة ولاية أوهايو.

1. إعداد المكونات المائية
<ol><li>توليف الفلورسنت الببتيدات حوزتي التحلل كما هو موضح في مكان آخر8، استخدام فلوريسسين كجزيء فلوري ودابسيل كما يحتوي. حل الببتيد في [دمس] لتركيز من 10 ملم ومخزن في ثلاجة-80 درجة مئوية في مختبرين (~ 30 ميليلتر) صغيرة لتجنب دورات تجميد أذاب المتكررة. ملاحظ...

<ol>
	<li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+the+third+dimension+-+how+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues.">Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).</li><li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Physiological+Events+in+2D+vs.+3D+Cell+Culture.">Modeling Physiological Events in 2D vs. 3D Cell Culture.</a> Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).</li><li>Hoarau-V&#233;chot, J., Rafii, A., Touboul, C., Pasquier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Halfway+between+2D+and+Animal+Models:+Are+3D+Cultures+the+Ideal+Tool+to+Study+Cancer-Microenvironment+Interactions.">Halfway between 2D and Animal Models: Are 3D Cultures the Ideal Tool to Study Cancer-Microenvironment Interactions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), (2018).</li><li>Lee, S. -. H., Miller, J. S., Moon, J. J., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytically+Degradable+Hydrogels+with+a+Fluorogenic+Substrate+for+Studies+of+Cellular+Proteolytic+Activity+and+Migration.">Proteolytically Degradable Hydrogels with a Fluorogenic Substrate for Studies of Cellular Proteolytic Activity and Migration.</a> Biotechnology Progress. 21 (6), 1736-1741 (2005).</li><li>DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+click+reactions+for+synthesizing+and+patterning+three-dimensional+cell+microenvironments.">Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments.</a> Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).</li><li>Chalasani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-Cell+Imaging+of+Protease+Activity:+Assays+to+Screen+Therapeutic+Approaches.">Live-Cell Imaging of Protease Activity: Assays to Screen Therapeutic Approaches.</a> Methods in Molecular Biology. 1574, 215-225 (2017).</li><li>Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M., Moin, K., Sloane, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Protease+Activity+in+Living+Cells:+From+Two+Dimensions+to+Four+Dimensions.">Visualizing Protease Activity in Living Cells: From Two Dimensions to Four Dimensions.</a> Current Protocols in Cell Biology. 04, (2008).</li><li>Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+matrix+metalloproteinase+activity+in+3D+cellular+microenvironments+using+a+fluorogenic+peptide+substrate.">Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate.</a> Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).</li><li>Nagase, H., Visse, R., Murphy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+matrix+metalloproteinases+and+TIMPs.">Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs.</a> Cardiovascular Research. 69 (3), 562-573 (2006).</li><li>Tokito, A., Jougasaki, M., Tokito, A., Jougasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+Metalloproteinases+in+Non-Neoplastic+Disorders.">Matrix Metalloproteinases in Non-Neoplastic Disorders.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1178 (2016).</li><li>Visse, R., Nagase, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases+and+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases:+structure,+function,+and+biochemistry.">Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry.</a> Circulation Research. 92 (8), 827-839 (2003).</li><li>Vihinen, P., K&#228;h&#228;ri, V. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases+in+cancer:+Prognostic+markers+and+therapeutic+targets.">Matrix metalloproteinases in cancer: Prognostic markers and therapeutic targets.</a> International Journal of Cancer. 99 (2), 157-166 (2002).</li><li>Yodkeeree, S., Garbisa, S., Limtrakul, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrahydrocurcumin+inhibits+HT1080+cell+migration+and+invasion+via.+downregulation+of+MMPs+and+uPA1.">Tetrahydrocurcumin inhibits HT1080 cell migration and invasion via. downregulation of MMPs and uPA1.</a> APHS Acta Pharmacologica Sinica. 29 (7), 853-860 (2008).</li><li>Yodkeeree, S., Chaiwangyen, W., Garbisa, S., Limtrakul, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin,+demethoxycurcumin+and+bisdemethoxycurcumin+differentially+inhibit+cancer+cell+invasion+through+the+down-regulation+of+MMPs+and+uPA.">Curcumin, demethoxycurcumin and bisdemethoxycurcumin differentially inhibit cancer cell invasion through the down-regulation of MMPs and uPA.</a> The Journal of Nutritional Biochemistry. 20 (2), 87-95 (2009).</li><li>Mabry, K. M., Schroeder, M. E., Payne, S. Z., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+High-Throughput+Cell+Encapsulation+Platform+to+Study+Changes+in+Cell-Matrix+Interactions.">Three-Dimensional High-Throughput Cell Encapsulation Platform to Study Changes in Cell-Matrix Interactions.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 8 (34), 21914-21922 (2016).</li><li>Sridhar, B. V., Doyle, N. R., Randolph, M. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalently+tethered+TGF-&#946;1+with+encapsulated+chondrocytes+in+a+PEG+hydrogel+system+enhances+extracellular+matrix+production.">Covalently tethered TGF-&#946;1 with encapsulated chondrocytes in a PEG hydrogel system enhances extracellular matrix production.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 102 (12), 4464-4472 (2014).</li><li>Sridhar, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+cellularly+degradable+PEG+hydrogel+to+promote+articular+cartilage+extracellular+matrix+deposition.">Development of a cellularly degradable PEG hydrogel to promote articular cartilage extracellular matrix deposition.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (5), 702-713 (2015).</li><li>Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoinitiated+polymerization+of+PEG-diacrylate+with+lithium+phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate:+polymerization+rate+and+cytocompatibility.">Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility.</a> Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).</li><li>Mucha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Type-1+Matrix+Metalloprotease+and+Stromelysin-3+Cleave+More+Efficiently+Synthetic+Substrates+Containing+Unusual+Amino+Acids+in+Their+P1'+Positions.">Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1' Positions.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (5), 2763-2768 (1998).</li><li>Chai, S. C., Goktug, A. N., Chen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+Validation+in+High+Throughput+Screening+-+from+Concept+to+Application.">Assay Validation in High Throughput Screening - from Concept to Application.</a> Drug Discovery and Development. , (2015).</li><li>Iversen, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTS+Assay+Validation.">HTS Assay Validation.</a> Assay Guidance Manual. , (2004).</li><li>Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+bioscaffolds+for+3D+culture+of+melanoma+cells+reveal+increased+MMP+activity+and+migration+with+BRAF+kinase+inhibition.">Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 5366-5371 (2015).</li><li>Patterson, J., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+proteolytic+degradation+of+molecularly+engineered+PEG+hydrogels+in+response+to+MMP-1+and+MMP-2.">Enhanced proteolytic degradation of molecularly engineered PEG hydrogels in response to MMP-1 and MMP-2.</a> Biomaterials. 31 (30), 7836-7845 (2010).</li></ol>

ويجمل العديد من الجوانب الهامة للبيئة الحية في زراعة الخلايا في المختبر 3D. ومع ذلك، ثقافة 3D يجعل أيضا تقييم الدالة cell وإشارات صعبة، تتطلب العديد من الاختبارات البيولوجية استرجاع الخلوية وإعداد كبيرة من الخلايا. ولذلك، وضع نظام بسيط الثقافة 3D التي تمكن من قياس وظيفة الخلوية دون عينة أخرى ت...

نظم الثقافة (3D) ثلاثية الأبعاد غالباً ما أوثق الخص في فيفو الاستجابات الخلوية من نظم الثقافة (2D) ثنائي الأبعاد التقليدية، انظر عدة منشورات ممتازة1،،من23 . بيد استخدام نظم الثقافة ثلاثية الأبعاد لقياس وظيفة الخلية قد تم تحدي نظراً لصعوبة استرجاع الخلوية وكذلك عينة التجهيز. يحد هذا الصعوبة قياس العديد من الوظائف الخلوية في نظم الاستزراع 3D. للتغلب على هذه الصعوبة، هناك حاجة إلى تقنيات جديدة تمكن من السهل قياس وظيفة الخلية داخل بيئات 3D. طريقة واحدة لمعالجة هذه الحاجة هو وضع المواد التي لا دعم الثقافة خلية ثلاثية الأبعاد فحسب بل تشمل أيضا أجهزة استشعار لقياس وظيفة الخلية. على سبيل المثال، أدرجت العديد من النظم المائية فلوروجينيك البروتياز مويتيس كليافابلي لتمكين التصور حوزتي النشاط داخل بيئات 3D4،5،،من67. بينما هذه الأنظمة استخدمت أصلاً للتصوير المجهري، هذه النظم كما يمكن تطويعها للاستخدام في مقايسة نشاط أية (MMP) مصفوفة عالمية استخدام قارئ لوحة قياسية، مما يتيح قياس سهلة لوظيفة الخلية في 3D 8من البيئة.
يتولى، فوق عائلة من الزنك البروتياز، تلعب أدواراً حاسمة في التوازن أنسجة طبيعية وفي العديد من الأمراض. يتولى تتحلل ويعيد المصفوفة خارج الخلية (ECM)، وتنشق مستقبلات سطح الخلية والسيتوكينات وتفعيل أخرى يتولى9،10. يتولى دوراً حاسما في العمليات الفسيولوجية مثل التئام الجروح والأمراض مثل التهاب المفاصل وتصلب الشرايين، ومرض الزهايمر، والسرطان (انظر ملاحظات في 9،،من1011). بالسرطان، وهي مستويات عالية من التعبير MMP ارتباطاً وثيقا بسرطان خبيث وسوء التشخيص12. وعلاوة على ذلك، يتولى المساهمة في تطور الورم بالتشجيع على غزو خلايا السرطان والهجرة، العمليات الخلوية التي هي ظواهر طبيعتها 3D13،14. ولذلك، هناك الكثير من الاهتمام في القدرة على قياس نشاط نظام التمثيل التناسبي المختلط في الثقافة 3D في سياقات عديدة، بما في ذلك الدراسات البيولوجية الأساسية وفحص فحوصات المخدرات.
الهلاميات المائية شماعة تستخدم على نطاق واسع للثقافة خلية ثلاثية الأبعاد بسبب مضمونها ارتفاع المياه، ومقاومة للبروتين الامتزاز، والطابع الانضباطي. قد تم فونكتيوناليزيد شماعة الهلاميات المائية مع عدد من مويتيس لوظيفة الخلية مباشرة، كما هو الحال مع الببتيدات ECM mimetic مثل إدارات RLD وإيكفاف تسهيل التصاق الخلايا، أو توجيه الربط لعوامل النمو مثل تحويل عامل النمو-بيتا (TGF-β) 15،16. في الآونة الأخيرة، وقد تم فونكتيوناليزيد شماعة الهلاميات المائية مع استشعار الببتيدات التي تمكن من قياس وظيفة الخلية ك جيدا5،8. على وجه التحديد، استخدام نظام هيدروجيل شماعة فونكتيوناليزيد مع فلوروجينيك القابلة للتحلل MMP قياس الببتيد تمكين النشاط MMP الخلوية في الثقافات 3D مع قارئ لوحة قياسية ومطلوب لا إجراء مزيد من المعالجة. هذه الأنظمة أيضا متوافقة مع قياسات أخرى لوظيفة الخلوية، بما في ذلك النشاط الأيضي. ويرد هنا، بروتوكول لقياس نشاط نظام التمثيل التناسبي المختلط للخلايا المستزرعة في هيدروجيل شماعة 3D فونكتيوناليزيد مع فلوروجينيك ببتيد القابلة للتحلل نظام التمثيل التناسبي المختلط، والنتائج المعروضة تبين التجارب الأولية التحسين اللازمة لاستخدام هذه المقايسة. تم تغليف الخلايا البشرية سرطان الجلد (A375) في الهلاميات المائية فلوروجينيك عبر طائفة من البذر الكثافة لتحديد كثافة البذر المناسبة التي تقع ضمن نطاق العامل المقايسة. بعد 24 ساعة تغليف، قيست MMP والنشاط الأيضي في استخدام قارئ ميكروسكوبية قياسية. المقبل، كان تطبيع نشاط نظام التمثيل التناسبي المختلط للنشاط الأيضي لتحديد كثافة البذر داخل نطاق الخطي المقايسة. وأخيراً، حسبت معامل داخل لوحة من اختلاف النسب المئوية (% السيرة الذاتية) بين تريبليكاتيس للتفكير في إمكانية تكرار نتائج النتائج التي تم الحصول عليها. ويتيح هذا الأسلوب الثقافة خلية 3D بسيطة وسريعة وسهلة القياس حوزتي نشاط بعينه الحد الأدنى من المعالجة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:723px;" width="723">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">1X Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:268px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10-010-049</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Activated charcoal&#160;</td>
			<td style="width:268px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C3345</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Black round bottom 96-well plate</td>
			<td style="width:268px;">Brand-Tech</td>
			<td style="width:119px;">89093-600</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Cell adhesion peptide (CRGDS)</td>
			<td style="width:268px;">GenScript USA Inc.</td>
			<td style="width:119px;">custom made</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Collagenase enzyme type I&#160;</td>
			<td style="width:268px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">17100-017</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Dextran</td>
			<td style="width:268px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D4876</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">DMEM High Glucose Media</td>
			<td style="width:268px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11965118</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td style="width:268px;">Seradigm</td>
			<td style="width:119px;">1500-500</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Fluorescence microplate reader&#160;</td>
			<td style="width:268px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">Cytation 3</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:268px;">Hausser Scientific Co.</td>
			<td style="width:119px;">3200</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:268px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">25030-081</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">MMP-degradable peptide crosslinker (KCGPQG&#8595;IWGQCK)</td>
			<td style="width:268px;">GenScript USA Inc.</td>
			<td style="width:119px;">custom made</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">NaOH</td>
			<td style="width:268px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S318500</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Penicillin /streptomycin</td>
			<td style="width:268px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Resazurin (Alamar Blue)</td>
			<td style="width:268px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">DAL1100</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">UV light&#160;</td>
			<td style="width:268px;">UVP</td>
			<td style="width:119px;">95-0006-02</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring global cellular matrix metalloproteinase and metabolic activity in 3d hydrogels

ثلاثي الأبعاد (3D) خلية ثقافة النظم غالباً ما أوثق الخص في فيفو الاستجابات الخلوية ووظائف من النظم التقليدية من ثقافة ثنائية الأبعاد (2D). بيد أن قياس وظيفة الخلية في الثقافة 3D غالباً أكثر تحديا. تتطلب العديد من الاختبارات البيولوجية استرجاع المواد الخلوية التي يمكن أن تكون صعبة في الثقافات 3D. طريقة واحدة للتصدي لهذا التحدي هو وضع المواد الجديدة التي تمكن من قياس وظيفة الخلية داخل المواد. هنا، يقدم طريقة لقياس نشاط أية (MMP) مصفوفة الخلوية في 3D الهلاميات المائية في شكل 96-جيدا. في هذا النظام، هو فونكتيوناليزيد المائية poly(ethylene glycol) (شماعة) مع جهاز استشعار كليافابلي نظام التمثيل التناسبي المختلط فلوروجينيك. الخلوية نظام التمثيل التناسبي المختلط نشاط يتناسب مع شدة الأسفار ويمكن أن يقاس مع قارئ ميكروسكوبية قياسية. التصغير من هذا التحليل بشكل جيد 96 تخفيض الوقت اللازم لإعداد تجريبية باستخدام 50% وكاشف بنسبة 80% في حالة مقارنة بالإصدار السابق 24-جيدا للفحص. هذا التحليل أيضا متوافقة مع قياسات أخرى لوظيفة الخلوية. على سبيل المثال، تحليل نشاط أيضي يتجلى هنا، التي يمكن أن تجري في وقت واحد مع نظام التمثيل التناسبي المختلط قياسات النشاط داخل المائية نفس. ويتجلى المقايسة مع الخلايا البشرية سرطان الجلد مغلفة عبر مجموعة من الخلية البذر الكثافة لتحديد كثافة التغليف المناسبة لنطاق العمل التحليل. بعد 24 ساعة تغليف الخلية، MMP وقراءات النشاط الأيضي كانت متناسبة مع الخلية البذر الكثافة. بينما يتجلى المقايسة هنا مع واحد فلوروجينيك الركيزة القابلة للتحلل، يمكن تكييفها وفقا لمجموعة متنوعة من النظم المائية وأجهزة استشعار أخرى الفلورسنت المقايسة والمنهجية. مثل هذا تحليل يوفر منبرا تثقيف 3D العملية وكفاءة والوصول إليها بسهولة لمجموعة متنوعة من التطبيقات.

وكان التحليل الحالي مقتبسة من نظام ثقافة المائية 3D المتقدمة سابقا وتتسم فونكتيوناليزيد مع استشعار كليفابل نظام التمثيل التناسبي المختلط فلوروجينيك8. جهاز استشعار نظام التمثيل التناسبي المختلط فلوروجينيك المستخدمة هنا يتكون من تسلسل الببتيد، جبلاك (بميوب?...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels at JoVE.com

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

ويرد هنا، بروتوكولا لتغليف واستزراع الخلايا في الهلاميات المائية poly(ethylene glycol) (شماعة) فونكتيوناليزيد مع أية مصفوفة فلوروجينيك (MMP)-الببتيد القابلة للتحلل. يتم قياس MMP الخلوية والنشاط الأيضي مباشرة من الثقافات المائية باستخدام قارئ ميكروسكوبية قياسية.

قياس أية مصفوفة الخلوية العالمية والنشاط الأيضي في الهلاميات المائية 3D

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

3D الثقافة يجعل من الصعب قياس وظيفة الخلوية ، وذلك باستخدام معيار المقاييس البيولوجية. يتيح هذا البروتوكول قياس النشاط الخلوي واللوميتيك دون معالجة عينات إضافية، باستخدام مستشعر الفلورسنت وقارئ اللوحة الدقيقة القياسي. ويتيح هذا البروتوكول عددا من التطبيقات الجديدة، بما في ذلك فحص العقاقير ذات الإنتاجية العالية.بالإضافة إلى ذلك، يمكن تبادل أجهزة الاستشعار الفلورسنت مع جهاز استشعار مختلف لقياس وظائف البروتيازات الأخرى أو الخلية. من المهم أن تخطط بعناية خارج التجربة مقدما، واستكمال جميع الحسابات لإعداد هيدروجيل، والإعداد جميع المعدات والكواشف لتقليل الخلايا الوقت في التعليق. للبدء، وإعداد وسائل الإعلام مع 1٪ الفحم جردت مصل البقر الجنين، واثنين من MM L-الجلوتامين، 10 وحدات لكل مل من البنسلين، و 10 ميكروغرام لكل مل من الستربتومايسين.لا تستخدم فينول وسائل الإعلام الحمراء، التي لديها أكثر التداخل fluorescence. لجعل الضوابط الإيجابية، إضافة البكتيريا الكولاجين نوع واحد إلى وسائل الإعلام المقايسة في تركيزات 10 و 1000 ميكروغرام لكل مل. المقبل، وإعداد حل السلائف هيدروجيل عن طريق إضافة الكواشف إلى أنبوب 1.5 مل.تأكد من دوامة بعد إضافة كل مكون. ثم تقسيم الحل إلى أنابيب 1.5 مل متعددة لظروف مختلفة. لتغليف الخلايا في الهيدروجيل، أولاً قم بإعداد تعليق خلية واحدة عن طريق غسل طبق 10 سم من خلايا الورم الميلانيني A375 مع 10 مل من PBS.ثم، إضافة 0.05٪ التربسين إلى الطبق، لتريبسينيزي الخلايا. احتضان الطبق في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون، لمدة ثلاث دقائق. بعد الاحتضان، عد الخلايا مع قياس الهيموزيت.بعد ذلك، الطرد المركزي حل الخلية في 314 مرات G لمدة ثلاث دقائق. استلهمت وسائل الإعلام والثقافة، والخلايا resuspend في المخزن المؤقت PBS في حوالي ثلاثة أضعاف الكثافة مغلفة النهائي. عد الخلايا مرة أخرى لضمان تركيز دقيق للخلايا.ثم، إضافة الخلايا المعلقة في برنامج تلفزيوني إلى كل أنبوب من حل السلائف هيدروجيل وفقا لكثافة البذر المطلوبة، ومزيج عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. بالنسبة للظروف التي يتم التحكم فيها، قم بإضافة برنامج PBS و الدوامة فقط. المقبل، ماصة 10 ميكرولترات من محلول السلائف هيدروجيل في منتصف كل بئر من العقيمة، أسود، جولة القاع 96 لوحة جيدا.فحص بصريا وضع الهيدروجيل داخل الآبار. يمكن إعادة وضع الهيدروجيل غير المركز باستخدام طرف ماصة قبل البلمرة. لتبلمر محلول السلائف الهيدروجيل، يعرض اللوحة لضوء الأشعة فوق البنفسجية عند 4 مللي واط لكل سنتيمتر مربع، لمدة ثلاث دقائق.بعد ذلك، إضافة 150 ميكرولترات من وسائل الإعلام المقايسة لجميع الآبار التي تحتوي على الخلايا المغلفة، و 150 ميكرولترات من محلول انزيم الكولاجيناز إلى آبار الضوابط الإيجابية. أضف 150 ميكروليترات من حاجز PBS إلى الآبار الخارجية للطبق لتقليل التبخر أثناء الحضانة. استخدم قارئ الصهقرة الدقيقة لقياس شدة الفلورسنت في اللوحة في ساعة الصفر ، على الفور بعد التغليف.حدد بروتوكول لوحة 96 96 مع 494 نانومتر الإثارة، و 521 نانومتر أطوال موجية للانبعاثات. بعد ذلك، احتضان لوحة في 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون، لمدة 18 ساعة. ثم إضافة الكواشف النشاط الأيضي في حجم واحد إلى 10 إلى نسبة حجم في بئر لجميع الظروف والضوابط.احتضان لوحة في 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون، لمدة ست ساعات. وأخيرا ، وقياس كثافة الفلورسنت من لوحة في 24 ساعة ، والتغليف وظيفة. حدد بروتوكول لوحة البئر المعتمة 96، مع 494 نانومتر استثارة، و521 نانومتر أطوال موجية للانبعاثات، لنشاط MMP.لقياس النشاط الأيضي، حدد 560 نانومتر الإثارة، و 590 نانومتر أطوال موجات الانبعاثات. في هذه الدراسة، عند تعرض جهاز استشعار الفلوروجينيك للبروتيس المناسبة، يتم فصل quencher و Fluorophore، وزيادة الفلورسينس. قياسات الفلوريسنس من الهيدروجيل المحتضنة مع انزيم الكولاجين البكتيرية نوع واحد، وتبين أن أقل إشارة تم الكشف عن إنتاجها من قبل الضوابط السلبية، مع عدم وجود الكولاجيناز.في حين تم إنتاج أعلى إشارة تم الكشف عنها بواسطة 1000 ميكروغرام لكل مل من الكولاجيناز أو أعلى، عندما تبدأ الإشارة في الهضبة. وكان نطاق العمل المحسوب من حوالي 0.16 إلى 474 ميكروغرام لكل مل من الكولاجيناز. كانت قراءات الفلوريسنس لخط خلايا الورم الميلانيني A375، المغلفة في مجموعة من الكثافات بعد التغليف مباشرة، منخفضة عبر كثافات البذر، ومشابهة للجل المسيطر بدون خلايا كما هو متوقع.بعد 24 ساعة من التغليف، كان نشاط MMP متناسبًا بشكل مباشر مع كثافة البذر، وتدرج كثافات البذر عند أو أكثر من مليون خلية لكل مل، ضمن حدود نطاق العمل. وكانت قياسات النشاط الأيضي لخط الخلية A375، أيضا متناسبة بشكل مباشر مع كثافة البذر الخلية. عن طريق تطبيع نشاط MMP إلى النشاط الأيضي، لم يكن هناك فرق كبير في نشاط MMP لكل خلية في كثافات البذر أكبر من 2 مليون خلية لكل مل.تقنيات الأنابيب المناسبة مهم. وهذا يشمل نصائح ما قبل التبول لتحقيق كميات دقيقة من الحلول اللزجة. أيضا، مركزة حل السلائف هيدروجيل داخل البئر، أمر بالغ الأهمية لتحقيق قياسات دقيقة من قبل قارئ لوحة.لتحديد MMPs محددة التي تساهم في نشاط MMP يقاس هنا، يمكن استخدام مقايسات التعبير مثل لطخة الغربية أو PCR. يتطلب استخدام الخلايا الحية إجراء السلامة البيولوجية السليم، وتقنية معقمة، ومجلس وزراء السلامة البيولوجية. ضوء الأشعة فوق البنفسجية هو خطر، واستخدام درع لحماية المستخدم، ولا ننظر مباشرة في ضوء.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

الكمي لالعالمي الانبساطي وظيفة عن طريق تحليل يستند النمذجة-الحركية من Transmitral التدفق عبر الشكلية ملء Parametrized الانبساطي

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

مستو التدرج نظام إنتشار المعنية بالتحقيق في الانجذاب الكيميائي في الكولاجين مصفوفة 3D

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

الانضباطي الهلاميات المائية من الرئوي خارج الخلية مصفوفة للثقافة خلية 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

إنتاج بروتين الايلاستين مثل الهلاميات المائية للتغليف وإيمونوستينينج من الخلايا في 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

البنكرياس المشتقة الانسجه المستمدة مصفوفة بيونك للطباعة 3D خلايا البنكرياس لادن الانسجه يبني

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

A الإنسان 3D مصفوفة-الخلايا الشحمية نموذج ثقافة لدراسة مصفوفة خليه الأيض الأيضي

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging

سلالة تسيطر عليها من هيدروجيلس 3D تحت التصوير المجهري لايف

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized ...

Measuring 3D In-vivo Shoulder Kinematics using Biplanar Videoradiography

قياس 3D في الجسم الحي الكتف الحركية باستخدام ثنائية الكواكب فيديو راديوجرافي

The shoulder is one of the human body's most complex joint systems, with motion occurring through the coordinated actions of four individual joints, ...

Cellular Affinity of Particle-Stabilized Emulsion to Boost Antigen Internalization

التقارب الخلوي للمستحلب المستقر للجسيمات لتعزيز استيعاب المستضد

The cellular affinity of micro-/nanoparticles is the precondition for cellular recognition, cellular uptake, and activation, which are essential for drug ...

Microengineering 3D Collagen Hydrogels with Long-Range Fiber Alignment

الهندسة المجهرية 3D الكولاجين الهلاميات المائية مع محاذاة الألياف طويلة المدى

Aligned collagen I (COL1) fibers guide tumor cell motility, influence endothelial cell morphology, control stem cell differentiation, and are a hallmark ...