Name: measuring global cellular matrix metalloproteinase and metabolic activity in 3d hydrogels
Uploaded: 2019-01-22T15:00:00
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著者は、キング サウド大学 (KSU)、リヤド、サウジアラビア最初の著者のスポンサーと同様、オハイオ州がん研究 (OCR)、ああ、この仕事を資金調達のため米国を認めたいと思います。蛍光ペプチド センサーの分子量は、マトリックス、支援レーザー脱離イオン化法、キャンパス化学楽器センター質量分析及びプロテオミクスから支援を受けて飛行時間 (MALDI-TOF) 質量分析法を用いて測定しました。オハイオ州立大学の施設。

1. ハイドロゲル コンポーネントの準備
<ol><li>8、フルオレセイン蛍光分子としてや、クェンチャーとして dabcyl 活用他前述の蛍光プロテアーゼ分解性ペプチドを合成します。10 mM の濃度の DMSO のペプチドや凍結融解の繰り返しを避けるために小さい (〜 30 μ L) 因数で-80 ° C の冷凍庫に保管を溶解します。 注: これらのペプチドは、市販も購入できます。このプロトコルに?...

<ol>
	<li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+the+third+dimension+-+how+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues.">Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).</li><li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Physiological+Events+in+2D+vs.+3D+Cell+Culture.">Modeling Physiological Events in 2D vs. 3D Cell Culture.</a> Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).</li><li>Hoarau-V&#233;chot, J., Rafii, A., Touboul, C., Pasquier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Halfway+between+2D+and+Animal+Models:+Are+3D+Cultures+the+Ideal+Tool+to+Study+Cancer-Microenvironment+Interactions.">Halfway between 2D and Animal Models: Are 3D Cultures the Ideal Tool to Study Cancer-Microenvironment Interactions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), (2018).</li><li>Lee, S. -. H., Miller, J. S., Moon, J. J., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytically+Degradable+Hydrogels+with+a+Fluorogenic+Substrate+for+Studies+of+Cellular+Proteolytic+Activity+and+Migration.">Proteolytically Degradable Hydrogels with a Fluorogenic Substrate for Studies of Cellular Proteolytic Activity and Migration.</a> Biotechnology Progress. 21 (6), 1736-1741 (2005).</li><li>DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. 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M., Schroeder, M. E., Payne, S. Z., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+High-Throughput+Cell+Encapsulation+Platform+to+Study+Changes+in+Cell-Matrix+Interactions.">Three-Dimensional High-Throughput Cell Encapsulation Platform to Study Changes in Cell-Matrix Interactions.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 8 (34), 21914-21922 (2016).</li><li>Sridhar, B. V., Doyle, N. R., Randolph, M. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalently+tethered+TGF-&#946;1+with+encapsulated+chondrocytes+in+a+PEG+hydrogel+system+enhances+extracellular+matrix+production.">Covalently tethered TGF-&#946;1 with encapsulated chondrocytes in a PEG hydrogel system enhances extracellular matrix production.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+bioscaffolds+for+3D+culture+of+melanoma+cells+reveal+increased+MMP+activity+and+migration+with+BRAF+kinase+inhibition.">Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 5366-5371 (2015).</li><li>Patterson, J., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+proteolytic+degradation+of+molecularly+engineered+PEG+hydrogels+in+response+to+MMP-1+and+MMP-2.">Enhanced proteolytic degradation of molecularly engineered PEG hydrogels in response to MMP-1 and MMP-2.</a> Biomaterials. 31 (30), 7836-7845 (2010).</li></ol>

3 D の in vitro における細胞培養を繰り返す体内環境の多くの重要な側面です。3次元培養も評価する細胞機能になり、携帯電話の検索と多数のセルを必要と多くの生物学的アッセイ挑戦を伝達します。したがって、開発処理と 3次元培養システムの有用性を大きくさらにサンプルなし細胞機能の測定を可能にする単純な 3次元培養システム。ここで説明した 3 D システムは、様々 な異なるアプリ...

三次元 (3 D) 培養システム多くの場合より密接に二次元 (2 D) の伝統文化システムよりも生体内の細胞応答を要約、いくつか優れた出版物1,2,3を参照.しかし、細胞の機能を測定する三次元培養システムを利用して携帯電話の検索の難しさのために挑戦している、さらに処理のサンプルします。この難易度は、3次元培養システムで多くの細胞機能の測定を制限します。この困難を克服するために新しい技術が必要な 3 D 環境内で細胞機能の簡単な測定を可能にします。この必要性に対処する方法の 1 つは、3 D 細胞培養のサポートだけでなく、また、細胞の機能を測定するセンサーを組み込む材料の開発です。たとえば、いくつかのハイドロゲル システムは蛍光プロテアーゼ分解部分 3 D 環境4,5,6,7内プロテアーゼ活性の可視化を有効にするを組み込まれています。一方、これらのシステムは、もともと顕微鏡イメージングのために利用された、これらのシステムも 3 D で細胞機能の簡易測定を有効にする標準的なプレート リーダーを使用してグローバル ・ マトリックス マトリックスメタロプロテアーゼ (MMP) の活性用適応できます。環境8。
Mmp、亜鉛プロテアーゼのスーパーファミリーは、正常組織の恒常性と多くの疾患で重要な役割を果たします。Mmp が低下して細胞外マトリックス (ECM) を改造、サイトカインと細胞表面受容体を切断、他 Mmp の9,10をアクティブにします。Mmp は、関節炎、動脈硬化、アルツハイマー病、および癌 ( 9,10,11のレビューを参照してください) などの疾患、創傷治癒など生理学的なプロセスで重要な役割を果たします。癌で高い MMP の発現は癌の転移と予後不良12相関します。さらに、Mmp は、癌細胞の浸潤や移行、本質的に 3 D 現象13,14細胞プロセスを促進することによって腫瘍の進行に貢献します。したがって、基礎生物学的研究や薬剤のスクリーニングの試金など、多くの場面で 3 D 培養の MMP 活性を測定することに関心があります。
ペグ ゲルは、高含水率により 3 D 細胞培養、タンパク質吸着と可変自然への抵抗のため活躍しています。ペグ ヒドロゲルは、細胞接着を促進する増殖因子 β (TGF-β)の変換などの成長因子のテザリングを直接 RGD、RLD と IKVAV のような ECM 擬態ペプチドなど直接セルに関数、鎖の数と機能されて15,16。最近では、PEG ヒドロゲルよく5,8と細胞機能の測定を可能にするセンサー ペプチド修飾されてが。具体的には、ペグ ハイドロゲル システムの使用は修飾と蛍光標準プレート リーダー 3 D 培養細胞の MMP 活性の測定 MMP 分解ペプチドを有効に、それ以上の処理は必要ありません。これらのシステムは、細胞機能、代謝活性を含む他の測定。蛍光の MMP 分解ペプチド修飾 3 D ペグ ハイドロゲルとこれの使用のために必要な最初の最適化実験を示す示された結果で培養された細胞の MMP 活性の測定のためのプロトコルの説明ここでは、試金。ひと悪性黒色腫細胞 (A375) された播種アッセイの作業範囲内にある適切な播種密度を決定する量の範囲で蛍光ゲルでカプセル化されます。カプセル化の 24 h 後 MMP と代謝活性を標準的なマイクロ プレート リーダーを用いた測定しました。次に、MMP 活性アッセイの線形範囲内播種密度を決定するための代謝活性と正常化しました。最後に、得られた結果の再現性を反映するようにトリプリケート間変動パーセンテージ (%cv) のプレート内の係数を求めた。このメソッドには、シンプルで高速な 3 D 細胞培養、および最小限のサンプル処理とプロテアーゼ活性の簡易測定ができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:723px;" width="723">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">1X Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:268px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10-010-049</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Activated charcoal&#160;</td>
			<td style="width:268px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C3345</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Black round bottom 96-well plate</td>
			<td style="width:268px;">Brand-Tech</td>
			<td style="width:119px;">89093-600</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Cell adhesion peptide (CRGDS)</td>
			<td style="width:268px;">GenScript USA Inc.</td>
			<td style="width:119px;">custom made</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Collagenase enzyme type I&#160;</td>
			<td style="width:268px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">17100-017</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Dextran</td>
			<td style="width:268px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D4876</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">DMEM High Glucose Media</td>
			<td style="width:268px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11965118</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td style="width:268px;">Seradigm</td>
			<td style="width:119px;">1500-500</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Fluorescence microplate reader&#160;</td>
			<td style="width:268px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">Cytation 3</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:268px;">Hausser Scientific Co.</td>
			<td style="width:119px;">3200</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:268px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">25030-081</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">MMP-degradable peptide crosslinker (KCGPQG&#8595;IWGQCK)</td>
			<td style="width:268px;">GenScript USA Inc.</td>
			<td style="width:119px;">custom made</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">NaOH</td>
			<td style="width:268px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S318500</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Penicillin /streptomycin</td>
			<td style="width:268px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Resazurin (Alamar Blue)</td>
			<td style="width:268px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">DAL1100</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">UV light&#160;</td>
			<td style="width:268px;">UVP</td>
			<td style="width:119px;">95-0006-02</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring global cellular matrix metalloproteinase and metabolic activity in 3d hydrogels

しばしば三次元 (3 D) 細胞培養システムが、生体内での細胞および機能をより密接に要約するので、二次元 (2 D) の伝統文化システムよりも。しかし、三次元培養における細胞機能の測定より困難頻繁です。多くの生物学的アッセイは、3 D の文化で困難なことができる細胞材料の取得を要求します。この課題に対処する方法の 1 つは材料内の細胞機能の測定を有効にする新しい材料を開発します。ここでは、96 ウェル フォーマットで 3 D ゲルにおける細胞外マトリックス マトリックスメタロプロテアーゼ (MMP) の活性の測定の手法を提案します。このシステムで蛍光の MMP 分解センサー poly(ethylene glycol) (PEG) ハイドロゲルに修飾します。細胞遊走は蛍光強度に比例して、標準的なマイクロ プレート リーダーで測定することができます。96 ウェル フォーマットにこのアッセイの小型化アッセイの前 24 ウェルのバージョンと比較して条件ごとに 80% 50% と試薬の使用によって実験のセットアップに必要な時間の短縮。この試金はまた細胞機能の他の測定と互換性です。たとえば、代謝活性アッセイは、ここで示します同じハイドロゲル内の MMP 活性測定を同時に行なうことができます。ヒトメラノーマ細胞播種密度アッセイの作業範囲の適切なカプセル化の密度を決定するセルの範囲にわたってカプセル化でアッセイを発揮します。カプセル化細胞の 24 h 後 MMP と代謝活性の読み出し、細胞播種密度に比例します。1 つ出来る分解蛍光基質でアッセイをここで発揮、間分析と方法論はさまざまなハイドロゲル システムや他の蛍光センサーの適応かもしれません。このようなアッセイは、さまざまなアプリケーションのための実用的で効率的かつ簡単にアクセスできる 3 D 培養プラットフォームを提供します。

現在のアッセイは、修飾と蛍光の MMP 分解センサー8以前開発と特徴づけられる三次元ハイドロゲル培養系から適応されました。ここで使用される蛍光の MMP センサーは GPLAC (pMeOBzl) ↓WARKDDK (AdOO) C ペプチッド シーケンスで構成されています (↓ は、胸の谷間のサイトを示す) ことは以前 MMP 14 と MMP 1119で胸の谷間を最適化しました。?...

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Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

カプセル化、poly(ethylene glycol) (PEG) ゲル修飾と蛍光マトリックスメタロプロテアーゼ (MMP) の細胞を培養するためのプロトコルを提示するここでは、-分解性ペプチド。携帯電話の MMP と代謝活性は、標準的なマイクロ プレート リーダーを使用したハイドロゲルの文化から直接測定されます。

世界的な細胞のマトリックスメタロプロテアーゼと 3 D ゲルの代謝活性を測定

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

3D培養は、標準的な生物学的アッセイを使用して、細胞機能を測定することがより困難になります。このプロトコルは、蛍光センサと標準的なマイクロプレートリーダーを使用して、さらなるサンプル処理なしで細胞および体細胞活動の測定を可能にする。このプロトコルは、高スループットの薬物スクリーニングを含む多くの新しいアプリケーションを可能にします。さらに、蛍光センサは、他のプロテアーゼまたは細胞機能を測定するために、別のセンサーと交換することができます。事前に実験を慎重に計画し、ヒドロゲル調製のためのすべての計算を完了し、細胞が懸濁する時間を最小限に抑えるためにすべての機器と試薬を設定することが重要です。まず、牛胎児血清を1%木炭除去し、2つのmM L-グルタミン、ペニシリン1mLあたり10単位、ストレプトマイシン1mLあたり10マイクログラムを取り除き、アッセイ培地を調製します。蛍光干渉性が高いフェノールレッドメディアは使用しないでください。陽性のコントロールを行うために、細菌コラゲレーター酵素タイプ1をmLあたり10マイクログラムと1000マイクログラムの濃度でアッセイ培地に加えます。次に、1.5 mLチューブに試薬を加えてヒドロゲル前駆体溶液を調製する。各成分を追加した後に必ず渦を出してください。その後、異なる条件のために複数の1.5 mLチューブに溶液を分割します。ヒドロゲル中の細胞をカプセル化するために、まず10mLのPBSでA375黒色腫細胞の10cm皿を洗浄して単一細胞懸濁液を調製する。その後、0.05%トリプシンを皿に加え、細胞をトリプシン化する。37°Cと5%の二酸化炭素で3分間、皿をインキュベートします。インキュベーション後、ヘモサイトメーターで細胞を数える。次に、細胞溶液を314倍Gで3分間遠心する。培養培地を吸引し、最終的に封入された密度の約3倍でPBSバッファー中の細胞を再懸濁させた。細胞をもう一度数え、細胞濃度を正確に保つ。次いで、必要な播種密度に従ってヒドロゲル前駆体溶液の各チューブにPBS中の懸濁細胞を加え、上下にピペット処理して混合する。制御条件の場合は、PBSと渦のみを追加します。次に、ヒドロゲル前駆体溶液のピペット10マイクロリットルを、滅菌、黒色、丸底96ウェルプレートの各ウェルの中央に入れた。ウェル内のヒドロゲルの配置を視覚的に検査します。非中心ヒドロゲルは、重合前にピペットチップを使用して再配置することができます。ヒドロゲル前駆体溶液を重合するために、プレートを1平方センチメートル当たり4ミリワットでUV光に3分間照射する。次に、カプセル化された細胞を含むすべてのウェルにアッセイ培地150マイクロリットルを加え、150マイクロリットルのコラゲターゼ酵素溶液を陽性制御のウェルに加える。プレートの外側ウェルに150マイクロリットルのPBSバッファーを加え、インキュベーション中の蒸発を減らします。マイクロプレートリーダーを使用して、プレートの蛍光強度をゼロ時間で測定し、封入直後にポストします。494ナノメートル励起、および521ナノメートルの発光波長を有する不透明な96ウェルプレートプロトコルを選択します。次に、プレートを摂氏37度で5%の二酸化炭素で18時間インキュベートします。その後、すべての条件とコントロールについて、ウェル当たり1〜10体積比で代謝活性試薬を追加します。プレートを摂氏37度、5%の二酸化炭素で6時間インキュベートします。最後に、プレートの蛍光強度を24時間で測定し、封入後に行う。MMP活性のために不透明な96ウェルプレートプロトコル、494ナノメートル励起、および521ナノメートルの発光波長を選択します。代謝活性を測定するには、560ナノメートル励起、および590ナノメートルの発光波長を選択します。本研究では、適切なプロテアーゼに蛍光センサを曝露すると、クエンチャーとフルオロフォアが分離され、蛍光が増加する。細菌性コラゲラーゼ酵素タイプ1を用いたインキュベートヒドロゲルの蛍光測定は、最も低い検出シグナルが、コラゲラーゼを伴う陰性対照によって生成されたことを示す。検出された信号はコラゲターゼのmL当たり1000マイクログラム以上で生成されたが、信号が高原に始まると。計算された働き範囲はコラゲナーゼのmL当たり約0.16から474マイクログラムであった。A375メラノーマ細胞株の蛍光測定値は、カプセル化直後の密度の範囲にカプセル化され、播種密度全体にわたって低く、期待通りに細胞のない対照ゲルと同様であった。カプセル化の24時間後、MMP活性は、播種密度に直接比例し、かつ1mL当たり100万個以上の細胞での播種密度は、働く範囲の限界内に収まる。A375細胞株の代謝活性測定は、細胞の播種密度にも直接比例した。MMP活性を代謝活性に正常化することにより、1mL当たり200万個を超える播種密度における細胞当たりのMMP活性に有意な差はなかった。適切なピペット技術が重要です。これには、粘性ソリューションの正確なボリュームを達成するための事前湿潤のヒントが含まれます。また、ウェル内のヒドロゲル前駆体溶液の中心化は、プレートリーダーによる正確な測定を達成するために重要です。ここで測定したMMP活性に寄与する特定のMMPを同定するために、ウェスタンブロットやPCRなどの発現アッセイを使用することができます。生細胞の使用は、適切なバイオセーフティ手順、無菌技術、および生物学的安全キャビネットを必要とします。紫外線は危険であり、シールドを使用してユーザーを保護し、光を直接見ないようにします。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

生物工学

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