Name: isolation and adoptive transfer of high salt treated antigen-presenting dendritic cells
Uploaded: 2019-03-05T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells at JoVE.com

أيد هذا العمل منح "جمعية القلب الأمريكية" POST290900 إلى N.R.B.، 17SDG33670829 L.X. و "المعاهد الوطنية للصحة" منح K01HL130497 لحزب العدالة والتنمية

وافقت جامعة فاندربيلت رعاية الحيوان المؤسسية واللجنة استخدام الإجراءات الموضحة هنا. يسكن الفئران ورعايتهم وفقا للدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (الصحافة الأكاديميات الوطنية. 2010 المنقحة).
1-عزل الطحال من الفئران
<ol><li>إعداد 1640 RPMI: 10% FBS، 0.10 مم حبيس، بيروفات صوديوم 1...

<ol>
	<li>Kearney, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+burden+of+hypertension:+analysis+of+worldwide+data.">Global burden of hypertension: analysis of worldwide data.</a> Lancet. 365, 217-223 (2005).</li><li>Murray, C. J., Lopez, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+global+burden+of+disease.">Measuring the global burden of disease.</a> N Engl J Med. 369, 448-457 (2013).</li><li>Lev-Ran, A., Porta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salt+and+hypertension:+a+phylogenetic+perspective.">Salt and hypertension: a phylogenetic perspective.</a> Diabetes/metabolism research and reviews. 21, 118-131 (2005).</li><li>Frisoli, T. M., Schmieder, R. E., Grodzicki, T., Messerli, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salt+and+hypertension:+is+salt+dietary+reduction+worth+the+effort.">Salt and hypertension: is salt dietary reduction worth the effort.</a> The American journal of medicine. 125, 433-439 (2012).</li><li>He, F. J., Li, J., Macgregor, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+longer-term+modest+salt+reduction+on+blood+pressure.">Effect of longer-term modest salt reduction on blood pressure.</a> Cochrane Database Syst Rev. 4, 004937 (2013).</li><li>Weinberger, M. H., Miller, J. Z., Luft, F. C., Grim, C. E., Fineberg, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definitions+and+characteristics+of+sodium+sensitivity+and+blood+pressure+resistance.">Definitions and characteristics of sodium sensitivity and blood pressure resistance.</a> Hypertension. 8, 127-134 (1986).</li><li>Morimoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+sensitivity+and+cardiovascular+events+in+patients+with+essential+hypertension.">Sodium sensitivity and cardiovascular events in patients with essential hypertension.</a> Lancet. 350, 1734-1737 (1997).</li><li>Weinberger, M. H., Fineberg, N. S., Fineberg, S. E., Weinberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salt+sensitivity,+pulse+pressure,+and+death+in+normal+and+hypertensive+humans.">Salt sensitivity, pulse pressure, and death in normal and hypertensive humans.</a> Hypertension. 37, 429-432 (2001).</li><li>Barbaro, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Cell+Amiloride-Sensitive+Channels+Mediate+Sodium-Induced+Inflammation+and+Hypertension.">Dendritic Cell Amiloride-Sensitive Channels Mediate Sodium-Induced Inflammation and Hypertension.</a> Cell Rep. 21, 1009-1020 (2017).</li><li>Kirabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+paradigm+of+sodium+regulation+in+inflammation+and+hypertension.">A new paradigm of sodium regulation in inflammation and hypertension.</a> American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 313, 706-710 (2017).</li><li>Machnik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+regulate+salt-dependent+volume+and+blood+pressure+by+a+vascular+endothelial+growth+factor-C-dependent+buffering+mechanism.">Macrophages regulate salt-dependent volume and blood pressure by a vascular endothelial growth factor-C-dependent buffering mechanism.</a> Nat Med. 15, 545-552 (2009).</li><li>Kopp, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=23Na+magnetic+resonance+imaging-determined+tissue+sodium+in+healthy+subjects+and+hypertensive+patients.">23Na magnetic resonance imaging-determined tissue sodium in healthy subjects and hypertensive patients.</a> Hypertension. 61, 635-640 (2013).</li><li>Dixon, K. B., Davies, S. S., Kirabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+isolevuglandins+in+immunity,+inflammation,+and+hypertension.">Dendritic cells and isolevuglandins in immunity, inflammation, and hypertension.</a> American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 312, 368-374 (2017).</li><li>Kirabo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DC+isoketal-modified+proteins+activate+T+cells+and+promote+hypertension.">DC isoketal-modified proteins activate T cells and promote hypertension.</a> J Clin Invest. 124, 4642-4656 (2014).</li><li>McMaster, W. G., Kirabo, A., Madhur, M. S., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation,+immunity,+and+hypertensive+end-organ+damage.">Inflammation, immunity, and hypertensive end-organ damage.</a> Circ Res. 116, 1022-1033 (2015).</li><li>Harrison, D. G., Vinh, A., Lob, H., Madhur, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+adaptive+immune+system+in+hypertension.">Role of the adaptive immune system in hypertension.</a> Curr Opin Pharmacol. 10, 203-207 (2010).</li><li>Madhur, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+17+promotes+angiotensin+II-induced+hypertension+and+vascular+dysfunction.">Interleukin 17 promotes angiotensin II-induced hypertension and vascular dysfunction.</a> Hypertension. 55, 500-507 (2010).</li><li>Harrison, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation,+immunity,+and+hypertension.">Inflammation, immunity, and hypertension.</a> Hypertension. 57, 132-140 (2011).</li><li>Crowley, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+lymphocyte+responses+by+angiotensin+II+promotes+kidney+injury+in+hypertension.">Stimulation of lymphocyte responses by angiotensin II promotes kidney injury in hypertension.</a> American journal of physiology. Renal physiology. 295, 515-524 (2008).</li><li>Zhang, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+type+1+angiotensin+receptors+on+T+lymphocytes+to+limit+target+organ+damage+in+hypertension.">A novel role for type 1 angiotensin receptors on T lymphocytes to limit target organ damage in hypertension.</a> Circ Res. 110, 1604-1617 (2012).</li></ol>

في البروتوكول الحالي، أننا قد تحسين إجراءات لعزل CD11c+ وحدات تحكم المجال Dc من الطحال من الفئران وأدوبتيفيلي تحويلها إلى الحيوانات ساذجة لدراسة دور وحدات تحكم المجال Dc في ارتفاع ضغط الدم الناجم عن الملح. هذا البروتوكول يمكن تكييفها لعزل ونقل مجموعات فرعية الخلايا المناعية الأخرى بما ?...

الملح الغذائية الزائدة عامل خطر رئيسي لارتفاع ضغط الدم. 1 , 2 "جمعية القلب الأمريكية" توصي كحد أقصى 2,300 مليغرام (ملغم) من تناول الصوديوم (Na+) في اليوم الواحد، ومع ذلك؛ أقل من 10% سكان الولايات المتحدة تلاحظ هذه التوصية. 3 , 4 تخفيضات متواضعة في المدخول نا+ انخفاض ضغط الدم، وتقليل حالات جديدة سنوياً من مرض القلب التاجي والسكتة الدماغية في الولايات المتحدة بنسبة 20%. 5 مشكلة رئيسية مع الزيادة في استهلاك الملح هو أن 50 في المائة من السكان ارتفاع ضغط الدم والمعارض الملح-حساسية، ويعرف بزيادة 10 مم زئبق في ضغط الدم بعد نانا+ تحميل أو حدوث انخفاض مماثل في ضغط الدم + القيد وإدرار البول. 6 الملح حساسية كما يحدث في 25% أفراد نورموتينسيفي، وهو توقع مستقلة من الموت وأحداث القلب والأوعية الدموية. 7 , 8 آليات الاستشعار عن الملح في ارتفاع ضغط الدم التي تنطوي على الكلي درست؛ بيد أن الدراسات الحديثة تشير إلى أن الخلايا المناعية يمكن الشعور نا+. 9 , 10
تشير الدلائل الأخيرة إلى أن التغييرات في خارج الكلوية نا+ التعامل مع يمكن أن تسبب تراكم نا+ في إينتيرستيتيوم وتشجيع التهاب. 11 , 12 مختبرنا وغيرها قد أظهرت أن خلايا نظام المناعة الفطرية والتكيف تسهم في تفاقم ارتفاع ضغط الدم. 9 , 13 , 14 , 15 المحفزات فرط ضغط الدم المختلفة، بما في ذلك وحيدات انجيوتنسين الثاني وإفراز والسبب الملح الضامة، والخلايا الليمفاوية T التسلل في الكلي والمفرج وتشجيع استبقاء نا+ ، تضيق الأوعية، وضغط الدم الارتفاع، وتلف الجهاز نهاية. 9 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 وفي الدراسات السابقة، وجدنا أن وحدات تحكم المجال Dc تتراكم إيسوليفوجلاندين (إيسولج)-أدوكتس البروتين في الاستجابة للمحفزات فرط ضغط الدم المختلفة بما في ذلك انجيوتنسين الثاني والملح دوكا ارتفاع ضغط الدم. 14 إيسولجس منتجات وبيروكسيد شدة رد الفعل بسرعة وتساهمي أدوكت إلى ليسينيس على البروتينات وتراكمها ويرتبط مع التنشيط DC. 14 وقد أنشأنا مؤخرا أن نا مرتفعة+ حافز قوي للبروتين إيسولج أدوكت تشكيل في الفئران وساطة وحدات تحكم المجال Dc-9 غ+ الدخول إلى وحدات تحكم المجال Dc عن طريق ناقلي amiloride الحساسة. ثم يتم تبادل نا+ للكالسيوم (Ca2 +) عن طريق+Na/Ca2 + المبادل. Ca2 + تنشيط بروتين كيناز ج (PKC) الذي ينشط أوكسيديز نادف مما أدى إلى زيادة أكسيد فائق (س2·-) والبروتين إيسولج أدوكت تشكيل. 9 نقل التبني المعرضة للملح ضغط الدم يعبي وحدات تحكم المجال Dc استجابة لجرعة موترة الفرعي من انجيوتنسين الثاني. 9
تحديد CD11c+ وحدات تحكم المجال Dc من الأنسجة قد اقتصر سابقا على إيمونوهيستوتشيميستري و RT-PCR، والعزلة من وحدات تحكم المجال Dc قد اقتصر على الخلية الفرز حسب التدفق الخلوي. على الرغم من أن التدفق الخلوي الخلية الفرز وسيلة قوية لعزل الخلايا المناعية، مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً، ويؤدي إلى انخفاض عائد من خلايا قابلة للحياة. ولذلك، نحن الأمثل بروتوكول خطوة بخطوة لهضم الأنسجة والتحفيز في المختبر، والتبني نقل CD11c+ وحدات تحكم المجال Dc لدراسة ارتفاع ضغط الدم.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:824px;" width="823">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">APC/Cy7 anti-mouse CD11c</td>
			<td style="width:160px;">Biolegend</td>
			<td align="right" style="width:140px;">117324</td>
			<td style="width:183px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">autoMACS Running Buffer&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD11c MicroBeads Ultrapure&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-108-338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">11088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS without calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FcR Blocking Reagent</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>&#160;130-092-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">FITC anti-mouse CD45</td>
			<td style="width:160px;">Biolegend</td>
			<td align="right" style="width:140px;">103108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GentleMACS C tube</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GentleMACS dissociator device</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>Use protocol: Spleen 04.01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L34964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QuadroMACs Seperator&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium&#160;</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:140px;">11835-030</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and adoptive transfer of high salt treated antigen-presenting dendritic cells

يسهم في التهاب الزائدة المدخول الغذائي الملح وتلعب دوراً حيويا في تطوير ارتفاع ضغط الدم. وجدنا سابقا أن عرض مستضد الخلايا الجذعية (DCs) بمعنى مرتفعة الصوديوم خارج الخلية، مما يؤدي إلى تفعيل أوكسيديز نادف وتشكيل إيسوليفوجلاندين (إيسولج)-أدوكتس البروتين. هذه إيسولج البروتين adducts تتفاعل مع البروتينات المتمتعة بالحكم الذاتي، وتعزيز المناعة الذاتية مثل الدولة وارتفاع ضغط الدم. لدينا تطوير وتحسين أساليب الدولة للفنون لدراسة وظيفة DC في ارتفاع ضغط الدم. هنا، نحن نقدم بروتوكول مفصل للعزلة، في معاملة المختبر مع الصوديوم مرتفعة، والتبني نقل مورين CD11c الطحال+ الخلايا في الفئران المستفيدة لدراسة دورها في ارتفاع ضغط الدم.

ويمثل الشكل 1 تخطيطي الخطوات الموصوفة أعلاه. يتم فرز الطحال مورين معزولة عن CD11c+ وحدات تحكم المجال Dc بالخلية المغناطيسية الفرز ومطلي في وسائل الإعلام الملح العادي (NS؛ 150 ميللي مول كلوريد الصوديوم) أو الوسائط الملح العالية (HS؛ ملمول 190 كلوريد الصوديوم) ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells at JoVE.com

Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells

نقدم هنا، بروتوكولا لعزل الخلايا الجذعية من الطحال مورين بفرز الخلايا المغناطيسية ونقل التبني اللاحقة في الفئران ساذجة. تم اختيار نموذج لتنشيط الخلايا الجذعية الملح عالية شرح إجراءات خطوة بخطوة لنقل التبني والتدفق الخلوي.

العزلة والتبني نقل الملح عالية يعامل عرض مستضد الخلايا الجذعية

Excess dietary salt intake contributes to inflammation and plays a vital role in the development of hypertension. We previously found that ...

هذه الطريقة يمكن الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات ارتفاع ضغط الدم وأمراض القلب والأوعية الدموية بما في ذلك دراسة الخلايا الجذعية 11c التشعب إيجابية وكيف أنها قوة دور إصابة ارتفاع ضغط الدم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي عزل الخلايا الجذعية 11c التشعب إيجابية من الأجهزة الصلبة ودراسة دورها الفسيولوجي في مختلف الدول المرض. لذلك يمكن تطبيق هذه العملية على أنواع متعددة من الخلايا المناعية، بما في ذلك الخلايا الليمفاوية B، الخلايا الليمفاوية T، أحادية الخلايا، وال الضامة.التصور لهذه التقنية أمر بالغ الأهمية لفهم عزل الخلايا التشعبية ، وتحديدا عملية النقل بالتبني إلى الفئران المتلقية. للبدء، رش الصدر والجانبين من الماوس القتل الرحيم مع 70٪ الإيثانول. على الجانب الأيسر، فتح بعناية الجلد والتجويف البريتوني لفضح الطحال.باستخدام ملقط صغيرة، بحذر نقل الأمعاء والكبد إلى الجانب الأيسر من الماوس. ثم استخدام مقص صغير لمعالجة بلطف الطحال. ضع كل طحال مُخَطَّط في أنبوب C المسمى يحتوي على ثلاثة ملليلترات من 1640 1640 من الـ RPMI.أولا إضافة الكولاجين D وDNase لإعداد RPMI 1640 المتوسطة لإعداد حل هضم الطحال. ضع أنبوب C على المهيج شبه الآلي وتأكد من وضع الأنبوب بإحكام على الذراع الدوارة. اضغط على زر البدء على المُجنّد لتشغيل بروتوكول الطحال 04.01 لمدة 60 ثانية.بعد ذلك، قم بفصل الأنبوب عن المُجنّد واحتضان العينات عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في ظلّ درجة حرارة 20 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، استخدم ماصة لنقل المحلل إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر بعد تصفيته من خلال مصفاة 40 ميكرومتر. غسل مصفاة مع 10 ملليلتر من dPBS.أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 300 مرة ز و4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. ثم pirate اكبر تماما وغسل بيليه عن طريق إعادة تعليق ذلك في 10 ملليلتر من dPBS. جهاز طرد مركزي تعليق في 300 مرة ز و4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.إعادة تعليق بيليه الخلية في خمسة ملليلتر من dPBS. استخدام مقياس الهيموسيت وجرب الأزرق استبعاد لحساب عدد الخلايا. الطاردة المركزية المقبلة في 300 مرة ز وعلى أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق ل بيليه الخلايا.التعرق عظمى تماما وإعادة تعليق بيليه في 400 ملليلتر من الخلايا تنشيط مغناطيسيا الفرز العازلة. ثم إضافة 100 ملليلتر من الميكروبات CD11c لكل 100 مليون خلية. دوامة تعليق الخلية واحتضان لمدة 10 دقائق في الثلاجة في أربع درجات مئوية.بعد ذلك، إضافة 10 ملليلترات من العازلة MACs لغسل الخلايا والطرد المركزي في 300 مرة ز و 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. استلهمت عظمى تماما وإعادة تعليق الخلايا في 500 ملليلتر من المخزن المؤقت MACs. ضع عمود LS في المجال المغناطيسي للفاصل mag ووضع أنبوب مخروطي 15 ملليلتر تحت كل عمود لجمع التدفق من خلال.بعد ذلك ، شطف الأعمدة مع ثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت. ضع تعليق الخلية على كل عمود ثم قم بتجميع التدفق الذي يحتوي على خلايا غير مُلصقة. اغسل الأعمدة بثلاثة ملليلترات من المخزن المؤقت لـ MACs واجمع الخلايا غير التي تم تصنيفها التي تمر عبرها.اغسل أعمدة LS مرتين إضافيتين باستخدام ثلاثة ملليلترات من المخزن المؤقت لـ MACs لكل غسل. بعد ذلك، قم بإزالة أعمدة LS من الفاصل المغناطيسي. إضافة خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت MACs إلى كل عمود ويغرق على الفور كل عمود في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر واضحة لطرد الخلايا المسمى مغناطيسيا.استخدام مقياس الهيموسيت و Trypan استبعاد الأزرق لتحديد رقم DC CD11c إيجابية كما هو مبين في بروتوكول النص. ثم تخفيف عينة الخلية في تخفيف واحد إلى واحد في 0.4٪ Trypan حل الأزرق. أولاً، إعداد الكريات الخلية في وسائل الإعلام الثقافة DC كما هو موضح في بروتوكول النص.Pipette 900 ميكرولترات من تعليق العاصمة في 24 شقة جيدا أسفل لوحة الصقر. إضافة 100 ميكرولترات من الملح عالية DC وسائل الإعلام ثقافة إلى كل بئر, لتركيز الصوديوم النهائي من 190 ميليمولار. ضع اللوحة في حاضنة لثاني أكسيد الكربون المرطبة عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.بعد 48 ساعة إزالة لوحة من الحاضنة. Pipette وسائل الإعلام ثقافة الخلية في بئر واحد صعودا وهبوطا لإعادة تعليق CD11c إيجابية DCs. نقل كل هذا التعليق في المقابلة وصفت 1.6 ملليلتر أنبوب.كرر هذا لكل فرد جيدا التي كانت مطلية. أجهزة الطرد المركزي جميع الأنابيب في 300 مرة ز و4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. التعرق و إعادة تعليق بيليه العاصمة مع 100 ميكرولترات من dPBS العقيمة.بعد ذلك ، ارسم حل DC من أحد الأنابيب إلى حقنة ملليلتر واحدة ، مجهزة بإبرة نصف بوصة قياس 27. وضع السذاجة الذكور 10 أسبوع من العمر C57-أسود-6 الماوس تحت isoflurane 2٪ لتحقيق استقرار الطائرة الجراحية. تحقق من مستوى التخدير مع عدم وجود رد فعل دواسة.بمجرد تحقيق طائرة جراحية مستقرة ، ببطء وبعناية إدخال الإبرة في الفضاء المداري الرجعية بزاوية 30 درجة تقريبًا. ببطء وسلس حقن CD11c تعليق DC إيجابية. بمجرد اكتمال الحقن ، قم بإزالة الإبرة بعناية للمساحة المدارية الرجعية ، مع التأكد من عدم تلف العين.ثم إزالة الفئران من مخروط الأنف ومراقبتها لمدة 30 دقيقة تقريبا أثناء الانتعاش من التخدير. يظهر تحليل نموذجي لضغط الدم هنا بعد النقل بالتبني من DCs ومضخات صغيرة التناضح التي تم زرعها للجرعة المنخفضة حقن أنجيوتنسين الثاني. تجدر الإشارة إلى أن هذه الجرعة المنخفضة من أنجيوتنسين الثاني هي جرعة القامع التي لا تزيد ضغط الدم في الماوس العادي.الفئران التي تتلقى العادي المعالج بالملح CD11c DCs إيجابية الحفاظ على ضغط الدم الطبيعي أثناء التسريب, في حين أن الفئران التي تتلقى عالية الملح المعالجة CD11c DCs إيجابية يحمل زيادة في ضغط الدم الانقباضي. ثم يتم تنفيذ تحليل تدفق قياس الخلايا باستخدام استراتيجية الغاتة هو مبين هنا لتحديد نقاء الخلايا الإيجابية CD11c معزولة. وينظر إلى زيادة إثراء الخلايا الإيجابية CD11c بالمقارنة مع الطحال الإجمالية.وتستخدم تركيزات ميكروباتية مختلفة CD11c لاستكشاف بروتوكول الشركة المصنعة. المغناطيسي منفصلة من الطحال باستخدام 100 ميكرولتردات من ميكروبات تنتج حوالي 65٪ من الخلايا الإيجابية CD11c، في حين أن استخدام 200 ميكرولترات تسفر عن 55٪، واستخدام 300 ميكرولترس الغلة 50٪ يتم تضمين مانع FcR جنبا إلى جنب مع 100 ميكرولتردات من الميكروبات. بعد الانفصال المغناطيسي، والحصار من FcR تسفر عن ما يقرب من 65٪ CD11c الخلايا الإيجابية.ثم يتم احتضان بعض الطحال مع 100 ميكرولترات من الميكروبات وفصلها مغناطيسيا من خلال عمود LS. يتم احتضان الخلايا المنفصلة بـ 100 ميكرولترات إضافية من CD11c ويتم فصلها مرة أخرى من خلال عمود LS. هذه العملية العزل المزدوجة أسفرت عن 92٪ خلايا إيجابية CD11c.عند محاولة هذا الإجراء، من المهم التأكد من نقاء الخلايا المعزولة عن طريق تدفق القياسات. بعد العزل المغناطيسي للخلايا التشعبية يمكن أن تكون مُزَوَّستة لتحديد حالتها التفعيلة بواسطة التقنيات الجزيئية بما في ذلك البروتيوميات وتسلسل الخلايا المفردة. منذ تطورها ، أصبح من الممكن الآن دراسة وظيفة ودور محدد للخلايا التشعبية في ارتفاع ضغط الدم.الباحثون الآن استكشاف مستضدات محددة في ارتفاع ضغط الدم.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

الإنبثاث التجريبية وCTL المناعي نقل بالتبني النموذجي ماوس

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into ...

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA - الإيج بناء خلايا مولدة الاصطناعي تقديم الكفء لل خارج الحي توسيع CTL الإنسان

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

عزل خلايا الرئة ماوس شجيرى

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

مستضد تقديم الاصطناعي تنشيط الخلية بوساطة (AAPC) والتوسع في الخلايا التائية القاتلة الطبيعية

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

المعجل نوع 1 الحث السكري في الفئران عن طريق نقل بالتبني من CD4 + T خلايا سكري

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

العزلة وتنقية وصفها من العظام بالنسبة للفئران العدلات نخاع للدراسات الفنية والتجارب نقل بالتبني

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

عزل الخلايا الجذعية متعلق بالنخاع الشوكي والخلايا الظهارية من الغدة الصعترية الإنسان

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

تقييم تطوير خلايا الفئران الجذعية بلازماوية في بقع باير طريق نقل بالتبني من أسلاف المكونة للدم

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

القاتل مستضد تقديم الخلايا الاصطناعي (KaAPC) للكفاءة<em&gt; في المختبر</em&gt; استنفاد خلايا T الإنسان مستضد محددة

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

تحريض الفئران المعوية التهاب عن طريق نقل بالتبني من المستجيب CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; عالية</sup&gt; خلايا T في الفئران العوز المناعي

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...