Name: isolation and adoptive transfer of high salt treated antigen-presenting dendritic cells
Uploaded: 2019-03-05T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato da American Heart Association concede POST290900 al N.R.B., 17SDG33670829 a L.X. e National Institutes of Health concedere K01HL130497 A.K.

Vanderbilt University istituzionale Animal Care e uso Comitato hanno approvato le procedure descritte nel presente documento. Topi sono alloggiati e curati secondo la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio (National Academies Press. Riveduta 2010).
1. isolamento della milza dai topi
<ol><li>Preparare RPMI 1640: 10% FBS, 0,10 mM HEPES, piruvato di sodio di 1 mM, 50 µM β-mercaptoetanolo e 1% di penicillina/streptomicina.</li>
	<li>Eutanasia: 10 – 12 settimana-vecchi topi masch...

<ol>
	<li>Kearney, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+burden+of+hypertension:+analysis+of+worldwide+data.">Global burden of hypertension: analysis of worldwide data.</a> Lancet. 365, 217-223 (2005).</li><li>Murray, C. J., Lopez, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+global+burden+of+disease.">Measuring the global burden of disease.</a> N Engl J Med. 369, 448-457 (2013).</li><li>Lev-Ran, A., Porta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salt+and+hypertension:+a+phylogenetic+perspective.">Salt and hypertension: a phylogenetic perspective.</a> Diabetes/metabolism research and reviews. 21, 118-131 (2005).</li><li>Frisoli, T. M., Schmieder, R. E., Grodzicki, T., Messerli, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salt+and+hypertension:+is+salt+dietary+reduction+worth+the+effort.">Salt and hypertension: is salt dietary reduction worth the effort.</a> The American journal of medicine. 125, 433-439 (2012).</li><li>He, F. J., Li, J., Macgregor, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+longer-term+modest+salt+reduction+on+blood+pressure.">Effect of longer-term modest salt reduction on blood pressure.</a> Cochrane Database Syst Rev. 4, 004937 (2013).</li><li>Weinberger, M. H., Miller, J. Z., Luft, F. C., Grim, C. E., Fineberg, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definitions+and+characteristics+of+sodium+sensitivity+and+blood+pressure+resistance.">Definitions and characteristics of sodium sensitivity and blood pressure resistance.</a> Hypertension. 8, 127-134 (1986).</li><li>Morimoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+sensitivity+and+cardiovascular+events+in+patients+with+essential+hypertension.">Sodium sensitivity and cardiovascular events in patients with essential hypertension.</a> Lancet. 350, 1734-1737 (1997).</li><li>Weinberger, M. H., Fineberg, N. S., Fineberg, S. E., Weinberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salt+sensitivity,+pulse+pressure,+and+death+in+normal+and+hypertensive+humans.">Salt sensitivity, pulse pressure, and death in normal and hypertensive humans.</a> Hypertension. 37, 429-432 (2001).</li><li>Barbaro, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Cell+Amiloride-Sensitive+Channels+Mediate+Sodium-Induced+Inflammation+and+Hypertension.">Dendritic Cell Amiloride-Sensitive Channels Mediate Sodium-Induced Inflammation and Hypertension.</a> Cell Rep. 21, 1009-1020 (2017).</li><li>Kirabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+paradigm+of+sodium+regulation+in+inflammation+and+hypertension.">A new paradigm of sodium regulation in inflammation and hypertension.</a> American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 313, 706-710 (2017).</li><li>Machnik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+regulate+salt-dependent+volume+and+blood+pressure+by+a+vascular+endothelial+growth+factor-C-dependent+buffering+mechanism.">Macrophages regulate salt-dependent volume and blood pressure by a vascular endothelial growth factor-C-dependent buffering mechanism.</a> Nat Med. 15, 545-552 (2009).</li><li>Kopp, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=23Na+magnetic+resonance+imaging-determined+tissue+sodium+in+healthy+subjects+and+hypertensive+patients.">23Na magnetic resonance imaging-determined tissue sodium in healthy subjects and hypertensive patients.</a> Hypertension. 61, 635-640 (2013).</li><li>Dixon, K. B., Davies, S. S., Kirabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+isolevuglandins+in+immunity,+inflammation,+and+hypertension.">Dendritic cells and isolevuglandins in immunity, inflammation, and hypertension.</a> American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 312, 368-374 (2017).</li><li>Kirabo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DC+isoketal-modified+proteins+activate+T+cells+and+promote+hypertension.">DC isoketal-modified proteins activate T cells and promote hypertension.</a> J Clin Invest. 124, 4642-4656 (2014).</li><li>McMaster, W. G., Kirabo, A., Madhur, M. S., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation,+immunity,+and+hypertensive+end-organ+damage.">Inflammation, immunity, and hypertensive end-organ damage.</a> Circ Res. 116, 1022-1033 (2015).</li><li>Harrison, D. G., Vinh, A., Lob, H., Madhur, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+adaptive+immune+system+in+hypertension.">Role of the adaptive immune system in hypertension.</a> Curr Opin Pharmacol. 10, 203-207 (2010).</li><li>Madhur, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+17+promotes+angiotensin+II-induced+hypertension+and+vascular+dysfunction.">Interleukin 17 promotes angiotensin II-induced hypertension and vascular dysfunction.</a> Hypertension. 55, 500-507 (2010).</li><li>Harrison, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation,+immunity,+and+hypertension.">Inflammation, immunity, and hypertension.</a> Hypertension. 57, 132-140 (2011).</li><li>Crowley, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+lymphocyte+responses+by+angiotensin+II+promotes+kidney+injury+in+hypertension.">Stimulation of lymphocyte responses by angiotensin II promotes kidney injury in hypertension.</a> American journal of physiology. Renal physiology. 295, 515-524 (2008).</li><li>Zhang, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+type+1+angiotensin+receptors+on+T+lymphocytes+to+limit+target+organ+damage+in+hypertension.">A novel role for type 1 angiotensin receptors on T lymphocytes to limit target organ damage in hypertension.</a> Circ Res. 110, 1604-1617 (2012).</li></ol>

Nel protocollo attuale, abbiamo ottimizzato le procedure per isolare CD11c+ DCs dalle milze di topi e passivamente trasferirli in animali per studiare il ruolo di controller di dominio nell'ipertensione indotta da sale. Questo protocollo può essere adattato per isolare e trasferire passivamente altri sottoinsiemi delle cellule immuni, compreso i macrofagi, monociti e cellule immunitarie adattive, compreso i linfociti T e B. Abbiamo ottimizzato il processo di digestione splenica per ottenere la sopravvivenza d...

L'eccesso di sale dietetico è un importante fattore di rischio per ipertensione. 1 , 2 the American Heart Association raccomanda un massimo di 2.300 milligrammi (mg) di apporto di sodio (Na+) al giorno, tuttavia; meno del 10% della popolazione statunitense osserva questa raccomandazione. 3 , 4 riduzioni modeste nell'assunzione di Na+ abbassano la pressione sanguigna e riducono l'annuali nuovi casi di malattia coronarica e ictus negli Stati Uniti del 20%. 5 un grosso problema con il consumo di sale in eccesso è che il 50% della popolazione ipertesa esibisce sale-sensibilità, definita come un aumento di 10 mmHg della pressione arteriosa dopo caricamento Na+ o un simile calo della pressione sanguigna dopo Na+ restrizione e la diuresi. 6 sale-sensibilità si verifica nel 25% degli individui normotesi ed è un preannunciatore indipendente della morte e di eventi cardiovascolari. 7 , 8 sale-sensing meccanismi nell'ipertensione che coinvolgono il rene sono stati ben studiati; Tuttavia, gli studi recenti suggeriscono che le cellule immuni possono percepire Na+. 9 , 10
La prova recente suggerisce che i cambiamenti in extra-renale Na+ manipolazione possono causare accumulo di Na+ nell'interstizio e promuovono l'infiammazione. 11 , 12 il nostro laboratorio ed altri hanno indicato che le cellule del sistema immunitario innato e adattivo contribuiscano all'esacerbazione dell'ipertensione. 9 , 13 , 14 , Vari stimoli ipertesi 15 , tra cui l'angiotensina II, noradrenalina e macrofagi causa sale, monociti e linfociti di T per infiltrarsi il rene ed il sistema vascolare e promuovere la ritenzione di Na+ , vasocostrizione, pressione sanguigna elevazione e danno d'organo fine. 9 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 in studi precedenti, abbiamo trovato che DCs si accumulano isolevuglandin (IsoLG)-proteina addotti in risposta a vari stimoli di ipertesi compreso ipertensione di angiotensina II e DOCA-sale. 14 IsoLGs sono altamente reattivi prodotti di perossidazione lipidica che rapidamente e in modo covalente del complesso di Lisine sulle proteine e il loro accumulo è associato con l'attivazione delle DC. Formazione in murino DCs.9 entrata Na+ in DCs è mediata con amiloride sensibile trasportatori del complesso 14 recentemente abbiamo stabilito che elevato Na+ è un potente stimolo per IsoLG-proteina. Na+ viene poi scambiato per calcio (Ca2 +) tramite lo scambiatore di Na+/ca2 + . CA2 + attiva la protein chinasi C (PKC) che attiva la NADPH ossidasi che porta maggiore superossido (O2· -) e la formazione del complesso IsoLG-proteina. 9 trasferimento adottivo di sale-esposti di ipertensione numeri primi DCs in risposta ad una dose sub-pressoria di angiotensina II. 9
Identificazione di CD11c+ DCs dai tessuti è stata precedentemente limitata a immunoistochimica e RT-PCR, e isolamento di DCs è stata limitata a cella ordinamento tramite flusso cytometry. Anche se l'ordinamento delle cellule di flusso cytometry è un metodo efficace per l'isolamento delle cellule del sistema immunitario, è costoso, richiede tempo e conduce ad un rendimento basso di cellule vitali. Di conseguenza, abbiamo ottimizzato un protocollo passo dopo passo per la digestione del tessuto, stimolazione in vitro e trasferimento adottivo di CD11c+ DCs per studiare l'ipertensione.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:824px;" width="823">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">APC/Cy7 anti-mouse CD11c</td>
			<td style="width:160px;">Biolegend</td>
			<td align="right" style="width:140px;">117324</td>
			<td style="width:183px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">autoMACS Running Buffer&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD11c MicroBeads Ultrapure&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-108-338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">11088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS without calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FcR Blocking Reagent</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>&#160;130-092-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">FITC anti-mouse CD45</td>
			<td style="width:160px;">Biolegend</td>
			<td align="right" style="width:140px;">103108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GentleMACS C tube</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GentleMACS dissociator device</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>Use protocol: Spleen 04.01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L34964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QuadroMACs Seperator&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium&#160;</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:140px;">11835-030</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and adoptive transfer of high salt treated antigen-presenting dendritic cells

Assunzione di sale dietetico in eccesso contribuisce ad infiammazione e svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo di ipertensione. Precedentemente abbiamo trovato che cellule dendritiche presentanti l'antigene (DCs) possono percepire elevato sodio extracellulare che conduce alla formazione di isolevuglandin (IsoLG) e l'attivazione della NADPH ossidasi-proteina addotti. Questi IsoLG-proteina addotti reagiscono con self-proteine e promuovere una autoimmune-come stato e ipertensione. Abbiamo sviluppato e ottimizzato state-of-the-art metodi per studiare la funzione delle DC nell'ipertensione. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per l'isolamento, in vitro trattamento con sodio elevato e il trasferimento adottivo di murino CD11c splenica+ cellule nei topi destinatari per studiare il loro ruolo nell'ipertensione.

Figura 1 rappresenta uno schema dei passaggi descritti sopra. Milze murine isolate sono ordinate per CD11c+ DCs da magnetico cella ordinamento e placcato in media sale normale (NS; 150 mmol NaCl) o media sale alta (HS; 190 mmol NaCl) per 48 h. CD11c+ DCs vengono poi trasferiti passivamente da retro-orbitale iniezione di ingenuo destinatario topi. Dieci giorni dopo, i topi sono impiantati con minipompe osmotiche per infusione di basso-dos...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells at JoVE.com

Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells

Qui, presentiamo un protocollo per isolare le cellule dendritiche da murine milze di ordinamento magnetico delle cellule e successivo trasferimento adottivo in topi ingenuo. Il modello delle cellule dendritiche attivate di alto-sale è stato scelto per spiegare le procedure dettagliate di trasferimento adottivo e citometria a flusso.

Isolamento e trasferimento adottivo di sale alta trattati cellule dendritiche presentanti l'antigene

Excess dietary salt intake contributes to inflammation and plays a vital role in the development of hypertension. We previously found that ...

Questo metodo può rispondere a domande chiave nei campi dell'ipertensione e delle malattie cardiovascolari, incluso lo studio delle cellule dendritiche positive CD11c e come potenziano il ruolo della lesione ipertensiva. Il principale vantaggio di questa tecnica è l'isolamento delle cellule dendritiche positive CD11c dagli organi solidi e lo studio del loro ruolo fisiologico in vari stati di malattia. Quindi questo processo può essere applicato a più tipi di cellule immunitarie, inclusi linfociti B, linfociti T, monociti e macrofagi.La visualizzazione della tecnica è fondamentale per comprendere l'isolamento delle cellule dendritiche, in particolare il processo di trasferimento adottivo nei topi riceventi. Per iniziare, spruzzare il torace e i lati del topo eutanasiato con il 70% di etanolo. Sul lato sinistro, aprire con cura la pelle e la cavità peritoneale per esporre la milza.Usando piccole forcep, spostare cautamente l'intestino e il fegato sul lato sinistro del mouse. Quindi utilizzare piccole forbici per asportare delicatamente la milza. Mettere ogni milza asportata in un tubo C etichettato contenente tre millilitri di mezzo RPMI 1640.Aggiungere innanzitutto la collagenasi D e la DNasi al mezzo RPMI 1640 preparato per preparare la soluzione di digestione della milza. Posizionare il tubo C su un omogeneizzatore semi-automatizzato e assicurarsi che il tubo sia strettamente posizionato sul braccio rotante. Premere il pulsante start sull'omogeneizzatore per eseguire il protocollo spleen 04.01 per 60 secondi.Successivamente, staccare il tubo dall'omogeneizzatore e incubare i campioni a 37 gradi Celsius sotto continuo a 20 giri/min per 15 minuti. Successivamente, utilizzare una pipetta per trasferire la soluzione in un tubo conico da 50 millilitri dopo filtrarla attraverso un filtro da 40 micrometri. Lavare il colino con 10 millilitri di dPBS.Centrifugare le cellule a 300 volte g e a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Quindi aspirare completamente il supernatante e lavare il pellet sospendendolo in 10 millilitri di dPBS. Centrifugare la sospensione a 300 volte g e a quattro gradi Celsius per 10 minuti.Sospendere di nuovo il pellet di cella in cinque millilitri di dPBS. Utilizzare un emocitometro e l'esclusione blu di Trypan per contare il numero di celle. Prossima centrifuga a 300 volte g e a quattro gradi Celsius per 10 minuti per pellettare le cellule.Aspirare completamente il supernatante e sospendere di nuovo il pellet in 400 millilitri di tampone di smistamento cellulare attivato magneticamente. Quindi aggiungere 100 millilitri di microperline CD11c per 100 milioni di cellule. Vortice la sospensione cellulare e incubare per 10 minuti in frigorifero a quattro gradi Celsius.Successivamente, aggiungere 10 millilitri di TAMPONE HC per lavare le cellule e centrifugare a 300 volte g e a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Aspirare completamente il supernatante e sospendere di nuovo le cellule in 500 millilitri di tampone MAC. Posizionare la colonna LS nel campo magnetico del separatore di mag e posizionare un tubo conico da 15 millilitri sotto ogni colonna per raccogliere il flusso attraverso.Quindi, sciacquare le colonne con tre millilitri di tampone. Posizionare la sospensione della cella su ogni colonna e raccogliere il flusso attraverso il quale contiene celle senza etichetta. Lavare le colonne con tre millilitri di MAC buffer e raccogliere le celle senza etichetta che passano.Lavare le colonne LS due volte in più utilizzando tre millilitri di tampone MAC per lavaggio. Successivamente, rimuovere le colonne LS dal separatore magnetico. Aggiungere cinque millilitri di buffer MAC a ogni colonna e immergere immediatamente ogni colonna in un tubo conico trasparente da 15 millilitri per sciacquare le celle etichettate magneticamente.Utilizzare un emocitometro e l'esclusione blu di Trypan per determinare il numero CC positivo CD11c come descritto nel protocollo di testo. Quindi diluire il campione di cella con una diluizione uno a uno nella soluzione blu 0,4%Trypan. In primo luogo, preparare i pellet di cella nei supporti di coltura CC come descritto nel protocollo di testo.Pipetta 900 microlitri della sospensione CC in piastra falcon bottom piatta da 24 pozzi. Aggiungere 100 microlitri del supporto di coltura CC ad alto sale ad ogni pozzo, per una concentrazione finale di sodio di 190 millimolare. Etichettare il piatto e posizionarlo in un incubatore di anidride carbonica umidificato a 37 gradi Celsius per 48 ore.Dopo 48 ore rimuovere la piastra dall'incubatore. Pipettare il supporto di coltura cellulare in un unico pozzo su e giù per sospendere di nuovo i CD11c positivi. Trasferire tutta questa sospensione in un corrispondente tubo etichettato da 1,6 millilitri.Ripeti questo per ogni singolo pozzo che è stato placcato. Centrifuga tutti i tubi a 300 volte g e a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Aspirare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet DC con 100 microlitri di dPBS sterile.Successivamente, disegnare la soluzione CC da uno dei tubi in una siringa millilitro, dotata di un ago da mezzo pollice calibro 27. Posizionare l'ingenuo topo C57-black-6 di 10 settimane di maschio sotto il 2% di isoflurane per ottenere un piano chirurgico stabile. Controllare il livello di anestesia con una mancanza di riflesso del pedale.Una volta raggiunto un piano chirurgico stabile, introdurre lentamente e con attenzione l'ago nello spazio retro-orbitale con un angolo di circa 30 gradi. Iniettare lentamente e senza intoppi la sospensione CC positiva CD11c. Una volta completata l'iniezione, rimuovere con cura l'ago per lo spazio retro-orbitale, assicurandosi di non danneggiare l'occhio.Quindi rimuovere i topi dal cono del naso e monitorarli per circa 30 minuti durante il recupero dall'anestesia. Una tipica analisi della pressione sanguigna è mostrata qui a seguito del trasferimento adottivo di DC e mini pompe osmotiche che sono state impiantate per infusione di Angiotensina II a bassa dose. Va notato che questa bassa dose di Angiotensina II è una dose soppressore che non aumenta la pressione sanguigna in un normale topo.I topi che ricevono normali CD11c positivi trattati con sale mantengono una pressione sanguigna normale durante l'infusione, mentre i topi che ricevono CD11c positivi trattati con sale elevato mostrano un aumento della pressione sanguigna sistolica. L'analisi della citometria del flusso viene quindi eseguita utilizzando la strategia di gating mostrata qui per determinare la purezza delle cellule positive CD11c isolate. Si nota un maggiore arricchimento delle cellule positive del CD11c rispetto agli splenociti totali.Diverse concentrazioni di microperline CD11c vengono utilizzate per risolvere i problemi relativi al protocollo del produttore. La separata magnetica degli splenociti che utilizzano 100 microlitri di microperline produce circa il 65% delle cellule positive cd11c, mentre l'utilizzo di 200 microlitri produce il 55% e l'utilizzo di 300 microlitri produce il 50%Un bloccante FcR è incluso insieme a 100 microlitri di microperline. A seguito della separazione magnetica, il blocco di FcR produce circa il 65%cd11c di cellule positive.Alcuni splenociti vengono quindi incubati con 100 microlitri di microperline e separati magneticamente attraverso una colonna LS. Le cellule separate vengono incubate con altri 100 microlitri di CD11c e separate di nuovo attraverso una colonna LS. Questo doppio processo di isolamento ha prodotto celle positive CD11c al 92%.Quando si tenta questa procedura, è importante confermare la purezza delle cellule isolate mediante citometria a flusso. Dopo l'isolamento magnetico delle cellule dendritiche possono essere coltivate per determinare il loro stato di attivazione con tecniche molecolari tra cui la proteomica e il sequenziamento a singola cellula. Dal suo sviluppo, è ora possibile studiare la funzione e il ruolo specifico delle cellule dendritiche nell'ipertensione.I ricercatori stanno ora esplorando gli antigeni specifici nell'ipertensione.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

Metastasi sperimentale e CTL adottivi Immunoterapia modello di trasferimento del mouse

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig celle in base Antigen Presenting artificiale per Efficiente Ex vivo Estensione dei diritti dell&#39;uomo e CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Isolamento di cellule polmonari mouse dendritiche

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Antigen Presenting artificiale cellulare (AAPC) Attivazione mediata ed espansione delle cellule Natural Killer T

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Applicazione clinica della<em&gt; Bella Addormentata</em&gt; Artificiale e cellule presentanti l&#39;antigene per modificare geneticamente le cellule T da sangue del cordone ombelicale e periferico

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

Accelerated diabete di tipo 1 nei topi induzione trasferimento adottivo di cellule CD4 + T Cells diabetogenici

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Isolamento, la purificazione e della dicitura del mouse Bone Marrow neutrofili per studi funzionali ed Esperienze trasferimento adottivo

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Isolamento di cellule dendritiche mieloidi e cellule epiteliali di timo umano

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Valutare lo sviluppo delle cellule murine plasmocitoidi dendritiche in placche del Peyer Utilizzando trasferimento adottivo di ematopoietiche Progenitori

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer artificiale cellule presentanti l&#39;antigene (KaAPC) per una efficiente<em&gt; In Vitro</em&gt; L&#39;esaurimento delle Umana antigene-specifiche cellule T

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...