Name: isolation and adoptive transfer of high salt treated antigen-presenting dendritic cells
Uploaded: 2019-03-05T13:30:00
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この作業によって支えられたアメリカ心臓協会は、N.R.B. に POST290900 を付与、L.X.、国立衛生研究所の 17SDG33670829 A.K. に K01HL130497 を付与

ヴァンダービルト大学の制度的動物ケアおよび使用委員会は、本明細書に記載されている手順を承認しました。マウスが建物し、の世話をガイドに従ってケアおよび実験動物の使用 (国民アカデミーの出版物。改訂 2010 年)。
1. マウスから脾臓の単離
<ol><li>RPMI 1640 の準備: 10 %fbs、0.10 mM HEPES 1 mM ピルビン酸ナトリウム 50 μ M β-メルカプトエタノール、1% ペニシリン/ストレ...

<ol>
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CD11c を分離する手順を最適化プロトコルでは、現在、+の Dc に対してマウスの脾臓から塩高血圧で Dc の役割を研究する素朴な動物にそれらを転送します。このプロトコルは、分離し、マクロファージ、単球、T および B リンパ球を含む適応免疫細胞など他の免疫細胞のサブセットを転送利用に適応できます。我々 は十分な細胞生存率と DC 表面発現マーカーの安定性を達成するために?...

塩分は、高血圧のための主要な危険因子です。1,2米国心臓協会推奨 2,300 ミリグラム (mg) 1 日あたりのナトリウム (Na+) 摂取量の最大値。米国の人口の 10% 未満の場合は、この勧告を遵守します。3,4 + Na 摂取量の適度な削減血圧を下げるし、冠動脈心疾患と米国で脳卒中の年次の新しいケースを 20% 削減します。5余分な塩の消費の主な問題は、高血圧の人口の 50% が塩感受性を表わすこと後ナナ+ロードや血圧のような低下血圧で 10 mmHg 増加として定義されている +制限と利尿。6塩感度は、また、正常血圧の個人の 25% で発生し、死と心血管イベントの独立した予測因子は。7,8高血圧腎臓を含む塩センシング機構がよく研究されて;ただし、最近の研究は、免疫細胞が Na+を感じることができることをお勧めします。9,10
最近の証拠は、外腎 Na+で変更処理が間に Na+の蓄積を引き起こすでき、炎症を促進するを示唆しています。11,12当研究室および他示されている自然免疫と適応免疫システムの両方の細胞が高血圧の悪化に貢献します。9,13,14,15さまざまな高血圧の刺激は、アンジオテンシン II、ノルエピネフリンおよび原因になる食塩マクロファージ、単球、腎臓と血管系に潜入し、Na+保存、血管収縮、血圧を促進する T リンパ球を含む標高と終末器官損傷。9,16,17,18,19,20は先行研究で我々 は isolevuglandin (IsoLG) を Dc に蓄積を発見-アンジオテンシン II、DOCA-塩高血圧症を含む様々 な高血圧性刺激に対する応答における付加体のタンパク質。14 IsoLGs 蛋白質のリジン付加物と急速に脂質過酸化反応の反応性の高い製品、その蓄積が DC の活性化に関連付けられています。14高 Na+は IsoLG 蛋白質のための強力な刺激を設けて最近は Dc に dc9ナ+エントリはアミロライド敏感なトランスポーターを介したマウスにおける付加物します。Na+は、カルシウム (Ca2 +) Na+/Ca2 +交換器を介して交換されます。Ca2 +活性化プロテインキナーゼ C (PKC) 増加した活性酸素 (O2· -) につながる NADPH オキシダーゼの活性化し、IsoLG 蛋白質付加物生成。9養子伝アンギオテンシン II のサブ昇圧線量への応答での Dc 素数の高血圧の塩公開します。9
CD11c の識別+ Dc 組織からは免疫組織および RT-PCR に以前制限されています、Dc の分離は、細胞のフローサイトメトリーによる並べ替えに制限されています。流れ cytometry セルソートは免疫細胞の隔離のための強力な方法が、それはコストがかかり、時間がかかりと実行可能なセルの低収量に 。したがって、我々 は組織の消化、体外刺激 CD11c の養子の転送のためのステップ バイ ステップ プロトコルを最適化してきました+ Dc 高血圧を研究します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:824px;" width="823">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">APC/Cy7 anti-mouse CD11c</td>
			<td style="width:160px;">Biolegend</td>
			<td align="right" style="width:140px;">117324</td>
			<td style="width:183px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">autoMACS Running Buffer&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD11c MicroBeads Ultrapure&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-108-338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">11088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS without calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FcR Blocking Reagent</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>&#160;130-092-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">FITC anti-mouse CD45</td>
			<td style="width:160px;">Biolegend</td>
			<td align="right" style="width:140px;">103108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GentleMACS C tube</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GentleMACS dissociator device</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>Use protocol: Spleen 04.01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L34964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QuadroMACs Seperator&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium&#160;</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:140px;">11835-030</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and adoptive transfer of high salt treated antigen-presenting dendritic cells

過剰な塩分摂取は炎症に寄与し、高血圧の開発に重要な役割を果たしています。以前抗原提示樹状細胞 (Dc) が NADPH オキシダーゼの活性化と isolevuglandin (IsoLG) の形成につながる高架の細胞外ナトリウムを感じることができることがわかった-付加体のタンパク質。これらの IsoLG 蛋白質は自己蛋白質と反応を内転、自己免疫のような状態と高血圧を促進します。我々 は開発し、最適化方法高血圧症における DC 機能を勉強します。ここでは、我々 はの分離、詳細なプロトコルを提供体外照射高ナトリウムとマウスの脾 CD11c の養子転送受信者マウス高血圧におけるそれらの役割を研究するために細胞の+ 。

図 1は、上記説明の手順の概略を表します。CD11c の孤立したマウス脾臓を並べ+磁気細胞 48 h. CD11c の通常の塩メディア (NS; 150 モル塩化ナトリウム) または高い塩メディア (HS; 190 ミリ モル塩化ナトリウム) でメッキを並び替えで Dc+の Dc に対してレトロ軌道によって転送されるし、素朴な受信者マウスに注入。10 日後、マウスは 14 ?...

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Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells

ここでは、磁気細胞選別と素朴なマウスにそれに続く養子転送によるマウス脾臓から樹状細胞を分離するためのプロトコルを提案する.高食塩活性化樹状細胞のモデルは、養子の転送とフローサイトメトリーのステップバイ ステップの手順を説明するのに選ばれました。

分離と養子伝高塩処理樹状細胞の抗原提示

Excess dietary salt intake contributes to inflammation and plays a vital role in the development of hypertension. We previously found that ...

この方法は、CD11c陽性樹状細胞の研究や高血圧傷害の役割を増強する方法を含む高血圧および心血管疾患の分野における重要な質問に答えることができる。この技術の主な利点は、固体器官からのCD11c陽性樹状細胞の単離および様々な疾患状態におけるそれらの生理学的役割の研究である。したがって、このプロセスは、Bリンパ球、Tリンパ球、単球、およびマクロファージを含む複数の免疫細胞タイプに適用することができる。この技術の可視化は、樹状細胞の単離、特にレシピエントマウスへの養子転移プロセスを理解するために重要である。始めに、70%エタノールで安楽死させたマウスの胸部および側面をスプレーする。左側で、皮膚と腹腔を慎重に開いて脾臓を露出させます。小さな鉗子を使用して、慎重にマウスの左側に腸と肝臓を移動します。その後、小さなはさみを使用して脾臓を優しく切除します。各切除脾臓を、RPMI 1640培地の3ミリリットルを含む標識されたCチューブに入れる。まず、コラーゲン酵素DおよびDNaseをRPMI 1640培地に加えて、脾臓消化液を調製した。Cチューブを半自動ホモジナイザーの上に置き、チューブが回転アームにしっかりと配置されていることを確認します。ホモジナイザの開始ボタンを押して、脾臓04.01プロトコルを60秒間実行します。この後、ホモジナイザーからチューブを取り外し、連続で20rpmで37°Cで15分間インキュベートします。次に、ピペットを使用して、40マイクロメートルのストレーナーを通して濾過した後、溶液を50ミリリットルの円錐管に移します。10ミリリットルのdPBSでストレーナーを洗います。細胞を300倍g、摂氏4度で10分間遠心分離する。その後、上清を完全に吸引し、10ミリリットルのdPBSで再懸濁してペレットを洗浄する。300 g で、摂氏 4 度で 10 分間、懸濁液を遠心分離します。5ミリリットルのdPBSで細胞ペレットを再懸濁する。ヘモサイトメーターとトリパンブルー除外を使用して、セル数をカウントします。次の遠心分離機は300倍gで、摂氏4度で10分間細胞をペレットする。上清を完全に吸引し、400ミリリットルの磁気活性細胞選別バッファーでペレットを再懸濁します。その後、1億個の細胞あたり100cマイクロビーズの100ミリリットルを追加します。セルの懸濁液をボルテックスし、摂氏4度の冷蔵庫で10分間インキュベートします。この後、10ミリリットルのMACバッファーを加えて、細胞と遠心分離機を300倍gで、摂氏4度で10分間洗浄します。上清を完全に吸引し、500ミリリットルのMACバッファーで細胞を再懸濁させる。マグセパレータの磁場にLSカラムを置き、各カラムの下に15ミリリットルの円錐チューブを置き、流れを集めます。次に、3ミリリットルのバッファーでカラムをすすいます。各列に細胞懸濁液を配置し、ラベルなしのセルを含むフローを収集します。3ミリリットルのMACsバッファでカラムを洗い、通過するラベルのない細胞を収集します。LSカラムを1回の3ミリリットルのMACsバッファを使用して2回洗浄します。その後、磁気セパレータから LS カラムを取り外します。各カラムに5ミリリットルのMACバッファを追加し、すぐに各カラムを明確な15ミリリットルの円錐管に突っ込んで、磁気標識された細胞を洗い流します。テキスト プロトコルで説明されているように、ヘモサイトメーターとトリパン ブルー除外を使用して、CD11c 正の DC 番号を決定します。その後、0.4%トリパンブルー溶液で1〜1希釈で細胞サンプルを希釈します。まず、テキストプロトコルで概説されているように、DC培養培地中の細胞ペレットを調製する。DC懸濁液のピペット900マイクロリットルを24ウェル平底ファルコンプレートに。190ミリモルの最終的なナトリウム濃度のために、各ウェルに高塩DC培養培地の100マイクロリットルを追加します。プレートにラベルを付け、加湿した二酸化炭素インキュベーターを摂氏37度で48時間置きます。48時間後、インキュベーターからプレートを取り出します。CD11c陽性DCを再中断するために、細胞培養培地を上下に1つのウェルでピペットします。メッキされた個々のウェルごとにこれを繰り返します。300回gでチューブのすべてを遠心分離し、摂氏4度で10分間。上清を吸引し、100マイクロリットルの無菌dPBSでDCペレットを再懸濁する。次に、チューブの1つからDC溶液を1ミリリットルのシリンジに引き込み、27ゲージの半インチ針を装備します。2%イゾフルランの下に10週齢のC57-黒-6マウスの素朴な男性を置き、安定した外科面を達成する。ペダル反射の欠如と麻酔のレベルを確認してください。安定した外科用平面が達成されたら、ゆっくりと慎重に約30度の角度でレトロ軌道空間に針を導入する。CD11c陽性DC懸濁液をゆっくりとスムーズに注入します。注射が完了したら、眼を傷つけないように、慎重にレトロ軌道空間の針を取り外します。次に、マウスを鼻コーンから取り出し、麻酔からの回復中に約30分間監視します。典型的な血圧分析は、低用量アンジオテンシンII注入のために移植されたDCおよび浸透性ミニポンプの採用移動に続いてここに示される。なお、この低用量のアンジオテンシンIIは、正常なマウスで血圧を上昇しないサプレッサー用量である。正常な塩処理CD11c陽性DCを受け取るマウスは注入中に正常な血圧を維持し、高塩処理CD11c陽性DCを受けるマウスは収縮期血圧の上昇を示す。フローサイトメトリー分析は、次に、ここで示す格紙戦略を利用して、単離されたCD11c陽性細胞の純度を決定するために行われる。CD11c陽性細胞の増加は、総脾細胞と比較して見られる。異なるCD11cマイクロビーズ濃度は、メーカーのプロトコルをトラブルシューティングするために利用されています。マイクロビーズの100マイクロリットルを使用する脾細胞の磁気分離は、CD11c陽性細胞の約65%を生み出し、200マイクロリットルを使用すると55%を生み出し、300マイクロリットルを使用すると50%のFcRブロッカーが100マイクロビーズと共に含まれる。磁気分離の後、FcRの遮断は約65%のCD11c陽性細胞を生み出す。その後、一部の脾細胞は100マイクロビーズでインキュベートされ、LSカラムを介して磁気的に分離されます。分離された細胞は、CD11cの追加100マイクロリットルでインキュベートされ、LSカラムを介して再び分離される。この二重分離プロセスは、92%CD11c陽性細胞を生み出した。この手順を試みる場合、細胞細胞量測定フローにより単離された細胞の純度を確認することが重要である。樹状細胞の磁気分離後、タンパク質および単一細胞シーケンシングを含む分子技術によって活性化状態を決定するために培養することができる。その発展以来、高血圧における樹状細胞の機能と特定の役割を研究することが可能になりました。研究者は現在、高血圧の特定抗原を探求しています。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

実験的転移とCTLの養子移入免疫療法のマウスモデル

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into ...

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA - Igは効率のためのベースの人工抗原提示細胞生体外で</emヒトCTLの>拡大

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

マウス肺樹状細胞の分離

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

ナチュラルキラーT細胞の細胞（AAPC）媒介活性化と増殖を提示する人工抗原

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

糖尿病CD4の養子移入+ T細胞によるマウスの加速された1型糖尿病の誘導

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

機能研究のためのマウス骨髄好中球と養子移入実験の分離、精製とラベリング

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

ヒト胸腺からの骨髄樹状細胞と上皮細胞の単離

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

造血前駆細胞の養子移入を使用して、パイエル板におけるマウス形質細胞様樹状細胞の開発を評価

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

効率的なためキラー人工抗原提示細胞（KaAPC）<em&gt;体外</em&gt;ヒト抗原特異的T細胞の枯渇

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

エフェクターCD4の養子移入によるマウス腸の炎症の誘導<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt;高い</sup&gt;免疫不全マウスへのT細胞

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...