Name: isolation and adoptive transfer of high salt treated antigen-presenting dendritic cells
Uploaded: 2019-03-05T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av American Heart Association gir POST290900 N.R.B., 17SDG33670829 L.X. og National Institutes of Health gir K01HL130497 til AK

Vanderbilt Universitys institusjonelle Animal Care og bruk komiteen har godkjent prosedyrene som er beskrevet her. Mus er plassert og stelt i henhold til guiden og bruk av forsøksdyr (National Academies trykk. Revidert 2010).
1. isolering av Spleens fra mus
<ol><li>Forbered 1640 RPMI: 10% FBS, 0,10 mM HEPES, 1 mM natrium pyruvate, 50 µM β-mercaptoethanol og 1% penicillin/streptomycin.</li>
	<li>Euthanize 10-12 uke-gamle C57bl/6 mannlige mus ved CO2 innånding. Spray brystet og ...

<ol>
	<li>Kearney, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+burden+of+hypertension:+analysis+of+worldwide+data.">Global burden of hypertension: analysis of worldwide data.</a> Lancet. 365, 217-223 (2005).</li><li>Murray, C. J., Lopez, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+global+burden+of+disease.">Measuring the global burden of disease.</a> N Engl J Med. 369, 448-457 (2013).</li><li>Lev-Ran, A., Porta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salt+and+hypertension:+a+phylogenetic+perspective.">Salt and hypertension: a phylogenetic perspective.</a> Diabetes/metabolism research and reviews. 21, 118-131 (2005).</li><li>Frisoli, T. M., Schmieder, R. E., Grodzicki, T., Messerli, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salt+and+hypertension:+is+salt+dietary+reduction+worth+the+effort.">Salt and hypertension: is salt dietary reduction worth the effort.</a> The American journal of medicine. 125, 433-439 (2012).</li><li>He, F. J., Li, J., Macgregor, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+longer-term+modest+salt+reduction+on+blood+pressure.">Effect of longer-term modest salt reduction on blood pressure.</a> Cochrane Database Syst Rev. 4, 004937 (2013).</li><li>Weinberger, M. H., Miller, J. Z., Luft, F. C., Grim, C. E., Fineberg, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definitions+and+characteristics+of+sodium+sensitivity+and+blood+pressure+resistance.">Definitions and characteristics of sodium sensitivity and blood pressure resistance.</a> Hypertension. 8, 127-134 (1986).</li><li>Morimoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+sensitivity+and+cardiovascular+events+in+patients+with+essential+hypertension.">Sodium sensitivity and cardiovascular events in patients with essential hypertension.</a> Lancet. 350, 1734-1737 (1997).</li><li>Weinberger, M. H., Fineberg, N. S., Fineberg, S. E., Weinberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salt+sensitivity,+pulse+pressure,+and+death+in+normal+and+hypertensive+humans.">Salt sensitivity, pulse pressure, and death in normal and hypertensive humans.</a> Hypertension. 37, 429-432 (2001).</li><li>Barbaro, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Cell+Amiloride-Sensitive+Channels+Mediate+Sodium-Induced+Inflammation+and+Hypertension.">Dendritic Cell Amiloride-Sensitive Channels Mediate Sodium-Induced Inflammation and Hypertension.</a> Cell Rep. 21, 1009-1020 (2017).</li><li>Kirabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+paradigm+of+sodium+regulation+in+inflammation+and+hypertension.">A new paradigm of sodium regulation in inflammation and hypertension.</a> American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 313, 706-710 (2017).</li><li>Machnik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+regulate+salt-dependent+volume+and+blood+pressure+by+a+vascular+endothelial+growth+factor-C-dependent+buffering+mechanism.">Macrophages regulate salt-dependent volume and blood pressure by a vascular endothelial growth factor-C-dependent buffering mechanism.</a> Nat Med. 15, 545-552 (2009).</li><li>Kopp, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=23Na+magnetic+resonance+imaging-determined+tissue+sodium+in+healthy+subjects+and+hypertensive+patients.">23Na magnetic resonance imaging-determined tissue sodium in healthy subjects and hypertensive patients.</a> Hypertension. 61, 635-640 (2013).</li><li>Dixon, K. B., Davies, S. S., Kirabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+isolevuglandins+in+immunity,+inflammation,+and+hypertension.">Dendritic cells and isolevuglandins in immunity, inflammation, and hypertension.</a> American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 312, 368-374 (2017).</li><li>Kirabo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DC+isoketal-modified+proteins+activate+T+cells+and+promote+hypertension.">DC isoketal-modified proteins activate T cells and promote hypertension.</a> J Clin Invest. 124, 4642-4656 (2014).</li><li>McMaster, W. G., Kirabo, A., Madhur, M. S., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation,+immunity,+and+hypertensive+end-organ+damage.">Inflammation, immunity, and hypertensive end-organ damage.</a> Circ Res. 116, 1022-1033 (2015).</li><li>Harrison, D. G., Vinh, A., Lob, H., Madhur, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+adaptive+immune+system+in+hypertension.">Role of the adaptive immune system in hypertension.</a> Curr Opin Pharmacol. 10, 203-207 (2010).</li><li>Madhur, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+17+promotes+angiotensin+II-induced+hypertension+and+vascular+dysfunction.">Interleukin 17 promotes angiotensin II-induced hypertension and vascular dysfunction.</a> Hypertension. 55, 500-507 (2010).</li><li>Harrison, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation,+immunity,+and+hypertension.">Inflammation, immunity, and hypertension.</a> Hypertension. 57, 132-140 (2011).</li><li>Crowley, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+lymphocyte+responses+by+angiotensin+II+promotes+kidney+injury+in+hypertension.">Stimulation of lymphocyte responses by angiotensin II promotes kidney injury in hypertension.</a> American journal of physiology. Renal physiology. 295, 515-524 (2008).</li><li>Zhang, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+type+1+angiotensin+receptors+on+T+lymphocytes+to+limit+target+organ+damage+in+hypertension.">A novel role for type 1 angiotensin receptors on T lymphocytes to limit target organ damage in hypertension.</a> Circ Res. 110, 1604-1617 (2012).</li></ol>

I gjeldende protokollen, vi har optimalisert prosedyrer for å isolere CD11c+ DCs fra spleens av mus og adoptively overføre dem i naiv dyr å studere rollen til DCs salt-indusert hypertensjon. Denne protokollen kan tilpasses å isolere og adoptively overføre andre immun celle undergrupper inkludert makrofager, monocytter og adaptive immunceller inkludert T- og B-lymfocytter. Vi har optimalisert splenic fordøyelsen prosessen for å oppnå tilstrekkelig celle overlevelse og stabilitet for DC overflaten uttryk...

Overflødig fôr salt er en stor risikofaktor for hypertensjon. 1 , 2 the American Heart Association anbefaler maksimalt 2300 milligram (mg) av natrium (Na+) per dag. mindre enn 10% av den amerikanske befolkningen observerer denne anbefalingen. 3 , 4 beskjeden reduksjoner i Na+ inntak senke blodtrykket og redusere de årlige nye tilfellene av koronar hjertesykdom og hjerneslag i USA med 20%. 5 et stort problem med overflødig salt forbruk er at 50% av befolkningen Hypertensiv viser salt-følsomhet, definert som en 10 mmHg økning i blodtrykket etter Na+ lasting eller et lignende fall i blodtrykket etter Na+ begrensning og diurese. 6 salt følsomhet også skjer i 25% av normotensive individer, og er en uavhengig prediktor for død og hjerte hendelser. 7 , 8 salt-sensing mekanismer i hypertensjon med nyrene har vært godt undersøkt. men tyder nyere studier på at immunceller kan forstand Na+. 9 , 10
Nyere bevis antyder at endringer i ekstra nyre Na+ håndtering kan føre til opphopning av Na+ i interstitium og fremme betennelse. 11 , 12 vårt laboratorium og andre har vist at celler av både medfødte og adaptive immunsystemet bidra til forverring av hypertensjon. 9 , 13 , 14 , 15 ulike Hypertensiv stimuli, inkludert angiotensin II, noradrenalin og salt årsaken makrofager, monocytter og T-lymfocytter å infiltrere nyrene og blodkar og fremme Na+ oppbevaring, vasokonstriksjon, blodtrykk høyde og end-orgel skade. 9 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 i tidligere studier, fant vi at DCs samle isolevuglandin (IsoLG)-protein addukter svar på ulike Hypertensiv stimuli inkludert angiotensin II og DOCA-salt hypertensjon. 14 IsoLGs er svært reaktive produkter av lipid peroxidation som raskt og covalently adduct å lysines på proteiner og deres akkumulering er knyttet til DC aktivisering. 14 vi har nylig etablert at opphøyet Na+ er en potent stimulans for IsoLG-protein adduct formasjon i Trouble DCs.9 Na+ inn i DCs er formidlet gjennom amilorid følsom transportører. Na+ deretter utvekslet for kalsium (Ca2 +) via den Na+/ca2 + exchanger. Ca2 + aktiverer protein kinase C (PKC) som aktiverer NADPH oksidase fører til økt superoxide (O2· -) og IsoLG-protein adduct formasjon. 9 adoptivforeldre overføring av salt-eksponerte DCs primtall hypertensjon svar på en sub eksplisitte eller dose av angiotensin II. 9
Identifikasjon av CD11c+ DCs fra vev er tidligere begrenset immunohistochemistry og RT PCR og isolering av DCs er begrenset til cellen sortering av flowcytometri. Selv om flyt cytometri celle sortering er en kraftig metode for isolering av immunceller, det er kostbar, tidkrevende, og fører til en lav avkastning på levedyktige cellers. Derfor vi har optimalisert en trinnvis protokoll for vev fordøyelsen, i vitro stimulering og adopsjon overføring av CD11c+ DCs å studere hypertensjon.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:824px;" width="823">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">APC/Cy7 anti-mouse CD11c</td>
			<td style="width:160px;">Biolegend</td>
			<td align="right" style="width:140px;">117324</td>
			<td style="width:183px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">autoMACS Running Buffer&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD11c MicroBeads Ultrapure&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-108-338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">11088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS without calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FcR Blocking Reagent</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>&#160;130-092-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">FITC anti-mouse CD45</td>
			<td style="width:160px;">Biolegend</td>
			<td align="right" style="width:140px;">103108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GentleMACS C tube</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GentleMACS dissociator device</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>Use protocol: Spleen 04.01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L34964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QuadroMACs Seperator&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium&#160;</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:140px;">11835-030</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and adoptive transfer of high salt treated antigen-presenting dendritic cells

Overflødig salt inntak bidrar til betennelse og spiller en viktig rolle i utviklingen av hypertensjon. Vi fant tidligere at antigen-presentasjon dendrittiske celler (DCs) kan forstand opphøyet ekstracellulære natrium fører til aktivering av NADPH oksidase og dannelsen av isolevuglandin (IsoLG)-protein addukter. Disse IsoLG-protein addukter reagerer med selv-proteiner og fremme en autoimmun-lignende tilstand og hypertensjon. Vi har utviklet og optimalisert state-of-the-art metoder for å studere DC funksjonen hypertensjon. Her gir vi en detaljert protokoll for isolering, i vitro behandling med forhøyet natrium og adopsjon overføring av murine splenic CD11c+ celler i mottakerens mus å studere deres rolle i hypertensjon.

Figur 1 representerer en skjematisk av beskrevet trinnene ovenfor. Isolert murine spleens sorteres for CD11c+ DCs magnetiske celle sortering og belagt i vanlig salt media (NS, 150 mmol NaCl) eller høy salt medier (HS, 190 mmol NaCl) for 48 h. CD11c+ DCs overføres deretter adoptively av retro-orbital injeksjon til naiv mottaker mus. Ti dager senere, er mus implantert med osmotisk minipumps for lav dose angiotensin II (140 ng/kg/min) inf...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells at JoVE.com

Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells

Her presenterer vi en protokoll for å isolere dendrittiske celler fra murine spleens av magnetiske celle sortering og påfølgende adopsjon overføring til naiv mus. Modell av høy-salt aktivert dendrittiske celler ble valgt til å forklare de trinnvise fremgangsmåtene adoptivforeldre overføring og flowcytometri.

Isolasjon og adopsjon overføring av høyt saltinnhold behandlet Antigen-presentasjon dendrittiske celler

Excess dietary salt intake contributes to inflammation and plays a vital role in the development of hypertension. We previously found that ...

Denne metoden kan svare på viktige spørsmål innen hypertensjon og kardiovaskulær sykdom, inkludert studiet av CD11c positive dendrittiske celler og hvordan de forsterker rollen som hypertensiv skade. Den største fordelen med denne teknikken er isolering av CD11c positive dendrittiske celler fra faste organer og studiet av deres fysiologiske rolle i ulike sykdomsstater. Så denne prosessen kan brukes på flere immuncelletyper, inkludert B-lymfocytter, T-lymfocytter, monocytter og makrofager.Visualisering av teknikken er avgjørende for å forstå dendrittisk celleisolasjon, spesielt adoptivoverføringsprosessen til mottakermus. For å begynne, spray brystet og sidene av den eutaniserte musen med 70% etanol. På venstre side, åpne forsiktig huden og bukhulen for å eksponere milten.Ved hjelp av små tang, forsiktig flytte tarmene og leveren til venstre side av musen. Bruk deretter liten saks til å forsiktig avgiftsdirektoratet milten. Plasser hver ekskisede milt i et merket C-rør som inneholder tre milliliter RPMI 1640 medium.Tilsett først kollagen D og DNase til forberedt RPMI 1640 medium for å forberede milten fordøyelsesløsning. Plasser C-røret på en halvautomatisk homogenisator og sørg for at røret er tett plassert på den roterende armen. Trykk på startknappen på homogenisatoren for å kjøre milten 04.01-protokollen i 60 sekunder.Etter dette, koble røret fra homogenisatoren og inkuber prøvene ved 37 grader Celsius under kontinuerlig ved 20 rpm i 15 minutter. Deretter bruker du en pipette til å overføre løsningen til et 50 milliliter konisk rør etter filtrering gjennom en 40 mikrometersil. Vask silen med 10 milliliter dPBS.Sentrifuger cellene ved 300 ganger g og ved fire grader Celsius i 10 minutter. Deretter aspirerer du supernatanten helt og vask pelleten ved å suspendere den på nytt i 10 milliliter dPBS. Sentrifuger suspensjonen ved 300 ganger g og ved fire grader Celsius i 10 minutter.Re-suspendere cellepellet i fem milliliter dPBS. Bruk et hemocytometer og Trypan blå eksklusjon for å telle antall celler. Neste sentrifuge på 300 ganger g og ved fire grader Celsius i 10 minutter for å pellet cellene.Aspirer overnaturanten helt og re-suspendere pellet i 400 milliliter magnetisk aktivert celle-sortering buffer. Deretter legger du til 100 milliliter CD11c mikroperler per 100 millioner celler. Vortex celle suspensjon og inkubere i 10 minutter i kjøleskap på fire grader Celsius.Etter dette legger du til 10 milliliter MACs buffer for å vaske cellene og sentrifuge ved 300 ganger g og ved fire grader Celsius i 10 minutter. Aspirer supernatanten helt og re-suspendere cellene i 500 milliliter macs buffer. Plasser LS-kolonnen i magnetfeltet på mag separatoren og plasser et konisk rør på 15 milliliter under hver kolonne for å samle gjennom strømmen.Skyll deretter kolonnene med tre milliliter buffer. Plasser cellesuspensjonen på hver kolonne og samle flyten gjennom som inneholder umerkede celler. Vask kolonnene med tre milliliter macs buffer og samle de umerkede cellene som passerer gjennom.Vask LS-kolonnene to ekstra ganger ved hjelp av tre milliliter MACs buffer per vask. Deretter fjerner du LS-kolonnene fra magnetskilletegnet. Legg til fem milliliter MACs buffer til hver kolonne og stup umiddelbart hver kolonne inn i et klart konisk rør på 15 milliliter for å skylle ut de magnetisk merkede cellene.Bruk et hemocytometer og Trypan blå eksklusjon til å bestemme CD11c positivt DC-nummer som beskrevet i tekstprotokollen. Deretter fortynner celleprøven ved en til en fortynning i 0,4% Trypan blå oppløsning. Først forberede cellepellets i DC kultur medier som beskrevet i tekstprotokollen.Pipette 900 mikroliter av DC suspensjon i 24-godt flat bunn falk plate. Tilsett 100 mikroliter av det høye salt DC kulturmediet til hver brønn, for en endelig natriumkonsentrasjon på 190 millimolar. Merk platen og legg den i en fuktet karbondioksidinkubator ved 37 grader Celsius i 48 timer.Etter 48 timer fjerner du platen fra inkubatoren. Pipette cellekulturmediene i en enkelt brønn opp og ned for å suspendere CD11c-positive DCer. Overfør all denne suspensjonen i et tilsvarende merket 1,6 milliliter rør.Gjenta dette for hver enkelt brønn som ble belagt. Sentrifuge alle rørene på 300 ganger g og ved fire grader Celsius i 10 minutter. Aspirer den overnaturlige og re-suspendere DC pellet med 100 mikroliter sterile dPBS.Deretter trekker du LIKESTRØM-løsningen fra det ene av rørene inn i en en en milliliter sprøyte, utstyrt med en 27 gauge halv tomme nål. Plasser den naive hannen 10 uker gamle C57-svart-6-musen under 2% isofluran for å oppnå et stabilt kirurgisk plan. Kontroller nivået av anestesi med mangel på pedalrefleks.Når et stabilt kirurgisk plan er oppnådd, sakte og forsiktig introdusere nålen i retro-orbital plass i en vinkel på ca 30 grader. Injiser CD11c positiv dc-suspensjon langsomt og jevnt. Når injeksjonen er fullført, fjern forsiktig nålen for retro-orbital plass, og pass på at du ikke skader øyet.Fjern deretter musene fra nesekjeglen og overvåk dem i ca. 30 minutter under gjenoppretting fra anestesi. En typisk blodtrykksanalyse er vist her etter adoptivoverføring av DCer og osmotiske minipumper som er implantert for lav dose Angiotensin II infusjon. Det bør bemerkes at denne lave dosen av Angiotensin II er en suppressor dose som ikke øker blodtrykket i en normal mus.Mus som mottar normale saltbehandlede CD11c-positive DCer opprettholder et normalt blodtrykk under infusjonen, mens musene som mottar høyt saltbehandlede CD11c-positive DCer viser en økning i systolisk blodtrykk. Flow cytometri analyse utføres deretter ved hjelp av gating strategi vist her for å bestemme renheten av isolerte CD11c positive celler. En økt berikelse av CD11c positive celler er sett i forhold til de totale miltytter.Ulike CD11c Microbead konsentrasjoner brukes til å feilsøke produsentens protokoll. Magnetisk separat av miltytter ved hjelp av 100 mikroliter mikroliter mikroperler gir ca 65% av CD11c positive celler, mens du bruker 200 mikroliter gir 55%, og ved hjelp av 300 mikroliter gir 50% En FcR-blokkering er inkludert sammen med 100 mikroliter mikroperler av mikroperler. Etter den magnetiske separasjonen gir blokaden av FcR ca. 65% CD11c positive celler.Noen miltytter inkuberes deretter med 100 mikroliter mikroliter mikroperler og magnetisk separert gjennom en LS-kolonne. De separerte cellene inkuberes med ytterligere 100 mikroliter CD11c og separert igjen gjennom en LS-kolonne. Denne doble isolasjonsprosessen ga 92%CD11c positive celler.Når du prøver denne prosedyren, er det viktig å bekrefte renheten av de isolerte cellene ved strømningscytometri. Etter magnetisk isolering av dendrittiske celler kan de dyrkes for å bestemme aktiveringsstatusen ved molekylære teknikker, inkludert proteomikk og encellesekvensering. Siden utviklingen er det nå mulig å studere funksjonen og dendrittiske cellenes spesifikke rolle i hypertensjon.Forskere utforsker nå de spesifikke antigenene i hypertensjon.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into ...

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Isolering av Mouse Lung dendrittiske celler

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Kunstig antigenpresenterende Cell (AAPC) mediert aktivering og utvidelse av Natural Killer T celler

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

Akselerert Type 1 Diabetes Induksjon i Mus ved Adoptive Overføring av diabetogenic CD4 + T celler

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Isolering, rensing og merking av benmarg fra mus Nøytrofiler for funksjonelle studier og adoptivforeldre Transfer Eksperimenter

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Isolering av myeloid dendrittiske celler og Epitelceller fra Menneskelig Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Vurdere utvikling av Murint Plasmacytoid dendrittiske celler i Peyer sin Patches Bruke Adoptive Overføring av Hematopoietic stamfedre

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Kunstig antigenpresenterende celler (KaAPC) for effektiv<em&gt; In Vitro</em&gt; Nedbryting av humant antigen-spesifikke T-celler

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induksjon av murine tarmbetennelse etter adoptiv overføring av Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Høy</sup&gt; T-celler i immundefekte mus

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...