Name: isolation and adoptive transfer of high salt treated antigen-presenting dendritic cells
Uploaded: 2019-03-05T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pela American Heart Association concede POST290900 a N.R.B., 17SDG33670829, L.X. e National Institutes of Health conceder K01HL130497 a A.K.

Da Universidade de Vanderbilt institucional Cuidado Animal e Comitê de uso aprovado os procedimentos aqui descritos. Os ratos são alojados e cuidados de acordo com o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório (imprensa nacional de academias. Revista 2010).
1. isolamento de baços de ratos
<ol><li>Preparar RPMI 1640: 10% FBS, 0,10 mM HEPES, piruvato de sódio 1 mM, 50 µM β-Mercaptoetanol e 1% penicilina/estreptomicina.</li>
	<li>Eutanásia em 10 – 12 semana-velhos camundongo...

<ol>
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No actual protocolo, otimizamos os procedimentos para isolar CD11c+ DCs de baços de ratos e enviaram transferi-los para animais ingênuo para estudar o papel da DCs na hipertensão induzida por sal. Este protocolo pode ser adaptado para isolar e enviaram transferir outros subconjuntos de células imunes, incluindo macrófagos, monócitos e células do sistema imunológico adaptativas incluindo linfócitos T e B. Otimizamos o processo de digestão esplênica para alcançar a sobrevivência celular adequada e e...

Excesso de sal dietético é um importante factor de risco para hipertensão. 1 , 2 the American Heart Association recomenda um máximo de 2.300 miligramas (mg) da ingestão de sódio (Na+) por dia, no entanto; menos de 10% da população dos EUA observa esta recomendação. 3 , 4 modestas reduções na ingestão de at+ baixar a pressão sanguínea e reduzem os anual de novos casos de doença coronariana e acidente vascular cerebral nos Estados Unidos em 20%. 5 um grande problema com o consumo de sal em excesso é que 50% da população de hipertensos apresenta sensibilidade ao sal, definida como um aumento de 10 mmHg na pressão de sangue após carregamento at+ ou uma queda semelhante na pressão arterial após at+ restrição e diurese. 6 sal-sensibilidade também ocorre em 25% dos indivíduos normotensos e é um preditor independente de eventos cardiovasculares e morte. 7 , 8 mecanismos de detecção sal na hipertensão, envolvendo o rim têm sido bem estudados; no entanto, estudos recentes sugerem que células do sistema imunológico podem sentir nd+. 9 , 10
Recentes sugerem que as alterações em extra renal at+ manipulação podem causar acúmulo de at+ no interstício e promover inflamação. 11 , 12 nosso laboratório e outros têm mostrado que as células do sistema imune inato e adaptativo contribuem para a exacerbação da hipertensão. 9 , 13 , 14 , 15 vários estímulos de hipertensos, incluindo angiotensina II e norepinefrina causa sal macrófagos, monócitos e linfócitos T para infiltrar o rim e a vasculatura e promover retenção Na+ , vasoconstrição, pressão arterial elevação e envolvimento visceral. 9 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 em estudos anteriores, verificou-se que o DCs acumulam isolevuglandin (IsoLG)-proteína adutos em resposta aos vários estímulos de hipertensos, incluindo angiotensina II e DOCA-sal hipertensão. 14 IsoLGs são altamente reativos produtos de peroxidação lipídica que rapidamente e covalentemente aduto de lisinas sobre proteínas e sua acumulação é associada com a ativação de DC. 14 recentemente estabelecemos que elevado at+ é um potente estímulo para IsoLG-proteína aduto formação em murino DCs.9 entrada de at+ em DCs é mediada através de transportadores sensíveis amilorida. At+ é então trocado por cálcio (Ca2 +) através da /nome da CA2 + trocador de at+. CA2 + ativa a proteína quinase C (PKC), que ativa a oxidase de NADPH, levando ao aumento superóxido (O2· -) e IsoLG-proteína aduto de formação. 9 transferência adotiva de sal-expostos a DCs hipertensão de números primos em resposta a uma dose de sub pressor da angiotensina II. 9
Identificação de CD11c + DCs dos tecidos tem sido anteriormente limitada a imunohistoquímica e RT-PCR e isolamento de DCs tem sido limitado a célula Classificar por citometria de fluxo. Embora a classificação de célula do citometria de fluxo é um método poderoso para o isolamento de células do sistema imunológico, é caro, demorado e leva a um baixo rendimento de células viáveis. Portanto, otimizamos um protocolo passo a passo para a digestão do tecido, estimulação in vitro e transferência adotiva de CD11c+ DCs para estudar a hipertensão.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:824px;" width="823">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">APC/Cy7 anti-mouse CD11c</td>
			<td style="width:160px;">Biolegend</td>
			<td align="right" style="width:140px;">117324</td>
			<td style="width:183px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">autoMACS Running Buffer&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD11c MicroBeads Ultrapure&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-108-338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">11088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS without calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FcR Blocking Reagent</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>&#160;130-092-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">FITC anti-mouse CD45</td>
			<td style="width:160px;">Biolegend</td>
			<td align="right" style="width:140px;">103108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GentleMACS C tube</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GentleMACS dissociator device</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>Use protocol: Spleen 04.01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L34964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QuadroMACs Seperator&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium&#160;</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:140px;">11835-030</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and adoptive transfer of high salt treated antigen-presenting dendritic cells

Excesso de ingestão sal contribui para a inflamação e desempenha um papel vital no desenvolvimento da hipertensão. Encontramos anteriormente que apresentadoras de células dendríticas (DCs) podem sentido elevado de sódio extracelular, levando a formação de isolevuglandin (IsoLG) e a ativação da oxidase NADPH-proteína adutos. Estes IsoLG-proteína adutos reagem com autoproteínas e promover um estado de doença auto-imune e hipertensão. Temos desenvolvido e otimizado o estado-da-arte métodos para estudar a função DC na hipertensão. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para o isolamento, em vitro tratamento com elevada de sódio e transferência adotiva de murino CD11c esplênica+ células em camundongos destinatários para estudar o seu papel na hipertensão.

A Figura 1 representa um esquema dos passos descritos acima. Baços murino isolados são classificados para CD11c+ DCs por célula magnético classificação e banhado em mídia sal normal (NS; 150 mmol de NaCl) ou alta mídia sal (HS; 190 mmol de NaCl), por 48 h. CD11c+ DCs enviaram então são transferidos por retrô-orbital injeção de destinatário ratos ingênuos. Dez dias depois, os ratos são implantados com minipumps osmótica p...

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Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar as células dendríticas de murino baços célula magnética classificando e subsequente transferência adotiva em ratos ingênuos. O modelo de células dendríticas ativadas de elevado-sal foi escolhido para explicar os procedimentos passo a passo de transferência adotiva e citometria de fluxo.

Isolamento e transferência adotiva de sal alta trataram apresentadoras de células dendríticas

Excess dietary salt intake contributes to inflammation and plays a vital role in the development of hypertension. We previously found that ...

Este método pode responder a perguntas-chave nos campos da hipertensão arterial e doenças cardiovasculares, incluindo o estudo de células dendríticas positivas cd11c e como elas potencializam o papel da lesão hipertensiva. A principal vantagem dessa técnica é o isolamento de células dendríticas positivas cd11c de órgãos sólidos e o estudo de seu papel fisiológico em vários estados da doença. Assim, esse processo pode ser aplicado a vários tipos de células imunes, incluindo linfócitos B, linfócitos T, monócitos e macrófagos.A visualização da técnica é fundamental para entender o isolamento das células dendríticas, especificamente o processo de transferência adotiva em camundongos receptores. Para começar, pulverize o peito e as laterais do rato eutanizado com 70% de etanol. No lado esquerdo, abra cuidadosamente a pele e a cavidade peritoneal para expor o baço.Usando pequenas fórceps, mova cautelosamente os intestinos e fígado para o lado esquerdo do rato. Em seguida, use uma tesoura pequena para extirpar suavemente o baço. Coloque cada baço excisado em um tubo C rotulado contendo três mililitros de meio RPMI 1640.Primeiro adicione colagenase D e DNase para preparar o meio RPMI 1640 para preparar a solução de digestão do baço. Coloque o tubo C sobre um homogeneizador semi-automatizado e certifique-se de que o tubo esteja bem colocado no braço rotativo. Pressione o botão de partida no homogeneizador para executar o protocolo de baço 04.01 por 60 segundos.Depois disso, retire o tubo do homogeneizador e incubar as amostras a 37 graus Celsius em contínua a 20 rpm por 15 minutos. Em seguida, use uma pipeta para transferir a solução para um tubo cônico de 50 mililitros depois de filtrar através de um filtro de 40 micrômetros. Lave o coador com 10 mililitros de dPBS.Centrifugar as células a 300 vezes g e a 4 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, aspire completamente o supernatante e lave a pelota re-suspendendo-a em 10 mililitros de dPBS. Centrifugar a suspensão a 300 vezes g e a 4 graus Celsius por 10 minutos.Suspenda a cápsula de celular em cinco mililitros de dPBS. Use um hemótmetro e a exclusão azul trypan para contar o número de células. Próxima centrífuga a 300 vezes g e a 4 graus Celsius por 10 minutos para pelotar as células.Aspire completamente o supernaente e suspenda a pelota em 400 mililitros de buffer de classificação celular ativado magneticamente. Em seguida, adicione 100 mililitros de microesferas CD11c por 100 milhões de células. Vórtice a suspensão celular e incubar por 10 minutos em uma geladeira a quatro graus Celsius.Depois disso, adicione 10 mililitros de tampão de MACs para lavar as células e centrífugas a 300 vezes g e a quatro graus Celsius por 10 minutos. Aspire completamente o supernaente e suspenda as células em 500 mililitros de buffer de MACs. Coloque a coluna LS no campo magnético do separador mag e coloque um tubo cônico de 15 mililitros sob cada coluna para coletar o fluxo através.Em seguida, enxágue as colunas com três mililitros de tampão. Coloque a suspensão da célula em cada coluna e colete o fluxo através do qual contém células sem rótulo. Lave as colunas com três mililitros de tampão de MACs e colete as células sem rótulo que passam.Lave as colunas LS duas vezes adicionais usando três mililitros de buffer DE MACs por lavagem. Depois disso, remova as colunas LS do separador magnético. Adicione cinco mililitros de buffer de MACs a cada coluna e mergulhe imediatamente cada coluna em um tubo cônico claro de 15 mililitros para liberar as células rotuladas magneticamente.Use uma exclusão azul hemótmetro e trypan para determinar o número DC positivo cd11c conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, dilui a amostra celular em uma diluição de um para um em solução azul trypan de 0,4%. Primeiro, prepare as pelotas de células nos meios de cultura dc, como descrito no protocolo de texto.Pipeta 900 microliters da suspensão DC em placa de falcão fundo plano de 24 poços. Adicione 100 microliters da alta mídia de cultura DC sal a cada poço, para uma concentração final de sódio de 190 milimôlares. Rotule a placa e coloque-a em uma incubadora de dióxido de carbono umidificada a 37 graus Celsius por 48 horas.Após 48 horas, retire a placa da incubadora. Pipeta a mídia de cultura celular em um único poço para cima e para baixo para suspender os DCs positivos CD11c. Transfira toda essa suspensão em um tubo correspondente rotulado de 1,6 mililitro.Repita isso para cada poço individual que foi banhado. Centrifugar todos os tubos a 300 vezes g e a 4 graus Celsius por 10 minutos. Aspire o supernascer e suspenda a pelota DC com 100 microliters de dPBS estéreis.Em seguida, desenhe a solução DC de um dos tubos em uma seringa de um mililitro, equipada com uma agulha de meia polegada calibre 27. Coloque o ingênuo macho de 10 semanas de idade C57-black-6 mouse sob 2% de isoflurane para alcançar um plano cirúrgico estável. Verifique o nível da anestesia com a falta de reflexo do pedal.Uma vez alcançado um plano cirúrgico estável, introduza lentamente e cuidadosamente a agulha no espaço retro-orbital em um ângulo de aproximadamente 30 graus. Injete lentamente e suavemente a suspensão DC positiva CD11c. Uma vez que a injeção esteja completa, remova cuidadosamente a agulha para o espaço retro-orbital, certificando-se de não danificar o olho.Em seguida, remova os ratos do cone do nariz e monitore-os por aproximadamente 30 minutos durante a recuperação da anestesia. Uma análise típica da pressão arterial é mostrada aqui após a transferência adotiva de DCs e minibombas osmóticas que foram implantadas para infusão de angiotensina II de baixa dose. Deve-se notar que esta baixa dose de Angiotensin II é uma dose supressora que não aumenta a pressão arterial em um rato normal.Camundongos que recebem DCs positivos cd11c tratados com sal normal mantêm uma pressão arterial normal durante a infusão, enquanto os camundongos que recebem DCs positivos CD11c de alto sal apresentam um aumento na pressão arterial sistólica. A análise da citometria de fluxo é então realizada utilizando a estratégia de gating mostrada aqui para determinar a pureza das células positivas cd11c isoladas. Um maior enriquecimento das células positivas CD11c é visto em comparação com o total de esplenócitos.Diferentes concentrações de microesferas CD11c são utilizadas para solucionar problemas no protocolo do fabricante. A separação magnética de esplenócitos usando 100 microliters de Microesferas produz cerca de 65% das células positivas cd11c, enquanto o uso de 200 microliters rende 55% e o uso de 300 microliters produz 50% Um bloqueador de FcR está incluído junto com 100 microliters de Microesferas. Após a separação magnética, o bloqueio da RSC produz aproximadamente 65% de células positivas CD11c.Alguns esplenócitos são então incubados com 100 microliters de Microesferas e separados magneticamente através de uma coluna LS. As células separadas são incubadas com mais 100 microliters de CD11c e separadas novamente através de uma coluna LS. Este processo de duplo isolamento rendeu células positivas de 92%CD11c.Ao tentar este procedimento, é importante confirmar a pureza das células isoladas por citometria de fluxo. Após o isolamento magnético das células dendríticas, elas podem ser cultivadas para determinar seu status de ativação por técnicas moleculares, incluindo proteômica e sequenciamento unicelular. Desde o seu desenvolvimento, agora é possível estudar a função e o papel específico das células dendríticas na hipertensão.Pesquisadores estão agora explorando os antígenos específicos na hipertensão.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

Metástase experimental e CTL Adoptive Transferência Modelo rato Imunoterapia

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into ...

Imunologia e Infecção

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig Baseado Artificial células apresentadoras de antígenos para a eficiente Ex vivo Ampliação da CTL Humanos

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Isolamento de células dendríticas pulmonares do rato

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Antígeno Artificial célula apresentadora de ativação mediada (AAPC) e expansão de células T Natural Killer

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Aplicação Clínica de<em&gt; A Bela Adormecida</em&gt; Artificial e Antigen Presenting Cells para modificar geneticamente células T de Sangue do Cordão Umbilical e periférica

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

Accelerated Diabetes Tipo 1 Indução em Ratos por transferência adotiva de diabetogênicos TCD4 +

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Isolamento, purificação e Rotulagem de neutrófilos da medula óssea do rato de Estudos funcionais e Experimentos de transferência adotiva

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

O isolamento de células dendríticas mielóides e células epiteliais de timo humano

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Avaliando o Desenvolvimento da murino células dendríticas plasmocitóides em placas de Peyer Usando transferência adoptiva de Progenitores hematopoiéticos

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Assassino Artificial células apresentadoras de antígenos (KaAPC) para a eficiente<em&gt; In Vitro</em&gt; Depleção de células T humanas antígeno específico da

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...