Name: isolation and adoptive transfer of high salt treated antigen-presenting dendritic cells
Uploaded: 2019-03-05T13:30:00
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Este trabajo fue apoyado por American Heart Association otorga POST290900 N.R.B., 17SDG33670829 L.X. y institutos nacionales de salud otorgar K01HL130497 a A.K.

De la Universidad de Vanderbilt institucional Animal Care y uso Comité han aprobado los procedimientos descritos en este documento. Ratones se ocupa y cuidadas según la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio (prensa de Academias nacionales. Revisado 2010).
1. aislamiento de bazos de ratones
<ol><li>Preparar el RPMI 1640: 10% FBS, 0,10 mM HEPES, piruvato de sodio 1 m m, 50 μm β-mercaptoetanol y 1% de penicilina/estreptomicina.</li>
	<li>Eutanasia a 10 – 12 semanas-viejos...

<ol>
	<li>Kearney, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+burden+of+hypertension:+analysis+of+worldwide+data.">Global burden of hypertension: analysis of worldwide data.</a> Lancet. 365, 217-223 (2005).</li><li>Murray, C. J., Lopez, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+global+burden+of+disease.">Measuring the global burden of disease.</a> N Engl J Med. 369, 448-457 (2013).</li><li>Lev-Ran, A., Porta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salt+and+hypertension:+a+phylogenetic+perspective.">Salt and hypertension: a phylogenetic perspective.</a> Diabetes/metabolism research and reviews. 21, 118-131 (2005).</li><li>Frisoli, T. M., Schmieder, R. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+lymphocyte+responses+by+angiotensin+II+promotes+kidney+injury+in+hypertension.">Stimulation of lymphocyte responses by angiotensin II promotes kidney injury in hypertension.</a> American journal of physiology. Renal physiology. 295, 515-524 (2008).</li><li>Zhang, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+type+1+angiotensin+receptors+on+T+lymphocytes+to+limit+target+organ+damage+in+hypertension.">A novel role for type 1 angiotensin receptors on T lymphocytes to limit target organ damage in hypertension.</a> Circ Res. 110, 1604-1617 (2012).</li></ol>

En el protocolo actual, hemos optimizado los procedimientos para aislar CD11c+ DCs de bazos de ratones y eventualmente transferirlos en ingenuos animales para estudiar el papel de la DCs en la hipertensión inducida por la sal. Este protocolo puede ser adaptada para aislar y eventualmente transferir otros subconjuntos de células inmunes como macrófagos, monocitos y células inmunitarias adaptativas incluyendo los linfocitos T y B. Hemos optimizado el proceso de digestión esplénico para lograr la superviven...

Exceso de sal dietético es un factor de riesgo para la hipertensión. 1 , 2 la Asociación Americana del corazón recomienda un máximo de 2.300 miligramos (mg) de ingesta de sodio (Na+) por día, sin embargo; menos del 10% de la población de Estados Unidos observa esta recomendación. 3 , 4 reducciones moderadas en la ingesta de Na+ bajan la presión arterial y reducen los nuevos casos anuales de enfermedad coronaria y accidente cerebrovascular en los Estados Unidos en un 20%. 5 un gran problema con el consumo excesivo de sal es que 50% de la población hipertensa presenta sensibilidad a la sal, definida como un aumento de 10 mmHg en la presión arterial tras NaNa+ carga o una caída similar en la presión arterial + la diuresis y restricción. 6 sensibilidad a la sal también se produce en el 25% de los individuos normotensos y es un predictor independiente de muerte y eventos cardiovasculares. 7 , 8 mecanismos de detección de sal en la hipertensión con el riñón han sido bien estudiados; sin embargo, estudios recientes sugieren que las células inmunes pueden sentir Na+. 9 , 10
La evidencia reciente sugiere que cambios en extra renal Na+ manipulación pueden causar acumulación de Na+ en el intersticio y promover la inflamación. 11 , 12 nuestro laboratorio y otros han demostrado que las células del sistema inmunitario tanto innato y adaptativo contribuyen a la exacerbación de la hipertensión arterial. 9 , 13 , 14 , 15 varios estímulos de hipertensos, como la angiotensina II, norepinefrina y causa sal macrófagos, monocitos y linfocitos T que infiltran el riñón y vasculatura y promover la retención de Na+ , vasoconstricción, hipertensión elevación y daño de órganos. 9 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 en estudios anteriores, encontramos que los DCs acumulan isolevuglandin (IsoLG)-proteína aductos en respuesta a diversos estímulos de hipertensos incluyendo angiotensina II e DOCA sal hipertensión. 14 IsoLGs son altamente reactivos productos de peroxidación lipídica que rápidamente y covalente aducción a lisinas en proteínas y su acumulación se asocia con la activación de la DC. 14 recientemente hemos establecido que elevado Na+ es un estímulo potente para la proteína IsoLG aducción formación murine DCs.9 Na+ entrar DCs es mediada por transportadores sensible amilorida. Na+ entonces se intercambia para el calcio (Ca2 +) vía el /Ca2 + intercambiador de Na+. CA2 + activa la proteína quinasa C (PKC) que activa la NADPH oxidasa lleva a mayor superóxido (O2· -) y proteína IsoLG aducción formación. 9 transferencia adoptiva de hipertensión de primos de DCs sal expuestos en respuesta a una dosis sub-presor de la angiotensina II. 9
Identificación de CD11c+ DCs de tejidos ha sido previamente limitada a la inmunohistoquímica y RT-PCR y aislamiento de DCs se ha limitado a ordenar por citometría de flujo de la célula. Aunque flujo citometría celular clasificación es un método eficaz para el aislamiento de las células inmunes, es costoso, desperdiciador de tiempo y conduce a una baja producción de células viables. Por lo tanto, nos hemos optimizado un protocolo paso a paso para la digestión de tejido, estimulación in vitro y transferencia adoptiva de CD11c+ DCs para el estudio de la hipertensión.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:824px;" width="823">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">APC/Cy7 anti-mouse CD11c</td>
			<td style="width:160px;">Biolegend</td>
			<td align="right" style="width:140px;">117324</td>
			<td style="width:183px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">autoMACS Running Buffer&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD11c MicroBeads Ultrapure&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-108-338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">11088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS without calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FcR Blocking Reagent</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>&#160;130-092-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">FITC anti-mouse CD45</td>
			<td style="width:160px;">Biolegend</td>
			<td align="right" style="width:140px;">103108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GentleMACS C tube</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GentleMACS dissociator device</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>Use protocol: Spleen 04.01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L34964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QuadroMACs Seperator&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium&#160;</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:140px;">11835-030</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and adoptive transfer of high salt treated antigen-presenting dendritic cells

La ingesta de sal excesiva contribuye a la inflamación y desempeña un papel vital en el desarrollo de la hipertensión arterial. Hemos encontrado que presentadoras de antígeno células dendríticas (DCs) pueden detectar sodio extracelular elevado conduce a la activación de la NADPH oxidasa y la formación de isolevuglandin (IsoLG)-aductos de proteínas. Estas proteínas IsoLG aductos reaccionan con proteínas de uno mismo y promover un estado autoinmune y la hipertensión. Hemos desarrollado y optimizado métodos de vanguardia para estudiar la función de DC en la hipertensión arterial. Presentamos un protocolo detallado para el aislamiento, en vitro tratamiento con sodio elevado y transferencia adoptiva de CD11c esplénicos murinos+ células en ratones receptores para estudiar su papel en la hipertensión arterial.

La figura 1 representa un esquema de los pasos descritos arriba. Bazos de ratón aislados se ordenan para CD11c+ DCs por célula magnética clasificación y plateado en los medios de sal normales (NS; 150 mmol de NaCl) o alta media sal (capítulo; 190 mmol NaCl) para 48 h. CD11c+ DCs se transfieren eventualmente por retro-orbital inyección a los ratones receptores ingenuos. Diez días más tarde, se implantan ratones con osmótico minip...

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Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells

Aquí, presentamos un protocolo para aislar las células dendríticas de bazos murinos por clasificación magnética celular y posterior transferencia adoptiva en ratones ingenuos. El modelo de células dendríticas activadas de sal fue elegido para explicar los procedimientos paso a paso de transferencia adoptiva y citometría de flujo.

Aislamiento y la transferencia adoptiva de sal alta tratan células dendríticas presentadoras de antígenos

Excess dietary salt intake contributes to inflammation and plays a vital role in the development of hypertension. We previously found that ...

Este método puede responder a preguntas clave en los campos de la hipertensión y las enfermedades cardiovasculares, incluido el estudio de las células dendríticas positivas CD11c y cómo potencian el papel de la lesión hipertensa. La principal ventaja de esta técnica es el aislamiento de células dendríticas positivas CD11c de órganos sólidos y el estudio de su papel fisiológico en varios estados de la enfermedad. Así que este proceso se puede aplicar a múltiples tipos de células inmunitarias, incluyendo linfocitos B, linfocitos T, monocitos y macrófagos.La visualización de la técnica es fundamental para comprender el aislamiento de células dendríticas, específicamente el proceso de transferencia adoptiva a ratones receptores. Para empezar, rocía el pecho y los lados del ratón eutanizado con 70%etanol. En el lado izquierdo, abra cuidadosamente la piel y la cavidad peritoneal para exponer el bazo.Usando pequeños fórceps, mueva con precaución los intestinos y el hígado al lado izquierdo del ratón. Luego usa tijeras pequeñas para extirpar suavemente el bazo. Coloque cada bazo extirpado en un tubo C etiquetado que contenga tres mililitros de RPMI 1640 medio.Primero agregue la colagenasa D y DNase al medio de RPMI 1640 preparado para preparar la solución de digestión del bazo. Coloque el tubo C en un homogeneizador semiautomático y asegúrese de que el tubo esté bien colocado en el brazo giratorio. Pulse el botón de inicio del homogeneizador para ejecutar el protocolo del bazo 04.01 durante 60 segundos.Después de esto, separar el tubo del homogeneizador e incubar las muestras a 37 grados Celsius bajo continua a 20 rpm durante 15 minutos. A continuación, utilice una pipeta para transferir la solución a un tubo cónico de 50 mililitros después de filtrarlo a través de un colador de 40 micrómetros. Lavar el colador con 10 mililitros de dPBS.Centrifugar las células a 300 veces g y a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. A continuación, aspirar el sobrenadante por completo y lavar el pellet volviendo a suspenderlo en 10 mililitros de dPBS. Centrifugar la suspensión a 300 veces g y a cuatro grados centígrados durante 10 minutos.Vuelva a suspender el pellet celular en cinco mililitros de dPBS. Utilice un hemocitociómetro y una exclusión azul de Trypan para contar el número de celdas. Siguiente centrifugadora a 300 veces g y a cuatro grados Celsius durante 10 minutos para peletizar las células.Aspirar el sobrenadante por completo y volver a suspender el pellet en 400 mililitros de búfer de clasificación de células activadas magnéticamente. Luego agregue 100 mililitros de microperlas CD11c por cada 100 millones de células. Vórtice la suspensión celular e incubar durante 10 minutos en un refrigerador a cuatro grados centígrados.Después de esto, agregue 10 mililitros de tampones de MAC para lavar las células y centrífuga a 300 veces g y a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Aspirar el sobrenadante por completo y volver a suspender las células en 500 mililitros de búfer de MAC. Coloque la columna LS en el campo magnético del separador de mag y coloque un tubo cónico de 15 mililitros debajo de cada columna para recoger el flujo a través.A continuación, enjuague las columnas con tres mililitros de tampón. Coloque la suspensión de celda en cada columna y recoja el flujo a través del cual contiene celdas sin etiquetar. Lave las columnas con tres mililitros de búfer de MAC y recoja las celdas sin etiquetar que pasan a través.Lave las columnas LS dos veces adicionales utilizando tres mililitros de tampón de MAC por lavado. Después de esto, quite las columnas LS del separador magnético. Agregue cinco mililitros de tampones de MAC a cada columna e sumerja inmediatamente cada columna en un tubo cónico claro de 15 mililitros para eliminar las células etiquetadas magnéticamente.Utilice un hemocicómetro y una exclusión azul de Trypan para determinar el número de CC positivo CD11c como se describe en el protocolo de texto. A continuación, diluya la muestra de célula a una dilución de uno a uno en una solución azul de Trippan 0,4%. En primer lugar, prepare los pellets de celda en medios de cultivo de CC como se describe en el protocolo de texto.Pipetear 900 microlitros de la suspensión DC en placa de halcón inferior plano de 24 pozos. Añadir 100 microlitros de los medios de cultivo de alta sal DC a cada pozo, para una concentración final de sodio de 190 mililitros. Etiquete la placa y colóquela en una incubadora de dióxido de carbono humidificado a 37 grados centígrados durante 48 horas.Después de 48 horas retire la placa de la incubadora. Pipetear el medio de cultivo celular en un solo pozo hacia arriba y hacia abajo para volver a suspender los DC positivos CD11c. Transfiera toda esta suspensión en un tubo correspondiente etiquetado de 1,6 mililitros.Repita esto para cada pozo individual que fue chapado. Centrifugar todos los tubos a 300 veces g y a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet de CC con 100 microlitros de dPBS estéril.A continuación, extraiga la solución de CC de uno de los tubos en una jeringa de un mililitro, equipada con una aguja de media pulgada de calibre 27. Coloque el macho ingenuo 10 semanas de edad ratón C57-negro-6 bajo 2%isoflurano para lograr un plano quirúrgico estable. Compruebe el nivel de anestesia con una falta de reflejo de pedal.Una vez que se logra un plano quirúrgico estable, introducir lentamente y cuidadosamente la aguja en el espacio retro-orbital en un ángulo de aproximadamente 30 grados. Inyecte lenta y suavemente la suspensión de CC positiva CD11c. Una vez completada la inyección, retire cuidadosamente la aguja para el espacio retro-orbital, asegurándose de no dañar el ojo.Luego retire los ratones del cono nasal y vigile durante aproximadamente 30 minutos durante la recuperación de la anestesia. Un análisis típico de la presión arterial se muestra aquí después de la transferencia adoptiva de DC y minibombas osmóticas que se han implantado para la perfusión de angiotensina II de dosis baja. Cabe señalar que esta dosis baja de angiotensina II es una dosis supresora que no aumenta la presión arterial en un ratón normal.Los ratones que reciben DC positivo CD11c normales tratados con sal mantienen una presión arterial normal durante la perfusión, mientras que los ratones que reciben DC positivo CD11c tratados con sal alta muestran un aumento en la presión arterial sistólica. A continuación, se realiza un análisis de citometría de flujo utilizando la estrategia de medición que se muestra aquí para determinar la pureza de las células positivas CD11c aisladas. Se observa un mayor enriquecimiento de las células positivas CD11c en comparación con el total de esplenocitos.Diferentes concentraciones de microbio CD11c se utilizan para solucionar problemas del protocolo del fabricante. La separación magnética de esplenocitos que utilizan 100 microlitros de microperlas produce alrededor del 65% de las células positivas CD11c, mientras que el uso de 200 microlitros produce un 55% y el uso de 300 microlitros produce un 50%An bloqueador FcR se incluye junto con 100 microlitros de Microbeads. Después de la separación magnética, el bloqueo de FcR produce aproximadamente 65%células positivas CD11c.Algunos esplenocitos se incuban con 100 microlitros de microperlas y se separan magnéticamente a través de una columna LS. Las células separadas se incuban con 100 microlitros adicionales de CD11c y se separan de nuevo a través de una columna LS. Este proceso de doble aislamiento produjo células positivas de 92%CD11c.Al intentar este procedimiento, es importante confirmar la pureza de las células aisladas por citometría de flujo. Después del aislamiento magnético de las células dendríticas se pueden cultivar para determinar su estado de activación mediante técnicas moleculares, incluida la proteómica y la secuenciación de una sola célula. Desde su desarrollo, ahora es posible estudiar la función y el papel específico de las células dendríticas en la hipertensión.Los investigadores están explorando los antígenos específicos en la hipertensión.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

La metástasis experimentales y CTL Modelo inmunoterapia adoptiva de transferencia de ratón

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into ...

Investigación

Inmunología e Infección

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig celdas en función de antígeno artificiales presentación para mejorar la eficiencia Ex vivo Ampliación de los Derechos Humanos CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Aislamiento de células dendríticas del pulmón de ratón

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Antígeno Artificial célula presentadora (AAPC) La activación mediada y expansión de linfocitos T citolíticos naturales

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

Tipo 1 Diabetes inducción acelerada en ratones por transferencia adoptiva de células CD4 + células T diabetogénico

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Aislamiento, Purificación y Etiquetado de neutrófilos de médula ósea de ratón de Estudios funcionales y experimentos de transferencia adoptivos

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Aislamiento de células dendríticas mieloides y células epiteliales de timo humano

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Evaluar el desarrollo de las células murino plasmocitoide dendríticas en las placas de Peyer Usando la transferencia adoptiva de Progenitores Hematopoyéticas

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial células presentadoras de antígenos (KaAPC) para la utilización eficiente<em&gt; In Vitro</em&gt; El agotamiento de células T humanas específicas de antígeno

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

La inducción de la inflamación intestinal murino por transferencia adoptiva de Efector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alta</sup&gt; T células en ratones inmunodeficientes

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...