Name: isolation and adoptive transfer of high salt treated antigen-presenting dendritic cells
Uploaded: 2019-03-05T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells at JoVE.com

Detta arbete stöds av American Heart Association beviljar POST290900 N.R.B., 17SDG33670829 L.X. och National Institutes of Health bevilja K01HL130497 Arvidsson

Vanderbilt Universitys institutionella djur vård och användning kommittén har godkänt de förfaranden som beskrivs häri. Möss är inrymt och vårdas enligt guiden för skötsel och användning av försöksdjur (nationella akademier tryck. Reviderad 2010).
1. isolering av mjälte från möss
<ol><li>Förbereda 1640 RPMI: 10% FBS, 0,10 mM HEPES, 1 mM natrium Pyruvat, 50 µM β-merkaptoetanol och 1% penicillin/streptomycin.</li>
	<li>Avliva 10 – 12 veckors-gamla C57bl/6 hanmöss av CO<s...

<ol>
	<li>Kearney, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+burden+of+hypertension:+analysis+of+worldwide+data.">Global burden of hypertension: analysis of worldwide data.</a> Lancet. 365, 217-223 (2005).</li><li>Murray, C. J., Lopez, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+global+burden+of+disease.">Measuring the global burden of disease.</a> N Engl J Med. 369, 448-457 (2013).</li><li>Lev-Ran, A., Porta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salt+and+hypertension:+a+phylogenetic+perspective.">Salt and hypertension: a phylogenetic perspective.</a> Diabetes/metabolism research and reviews. 21, 118-131 (2005).</li><li>Frisoli, T. M., Schmieder, R. E., Grodzicki, T., Messerli, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salt+and+hypertension:+is+salt+dietary+reduction+worth+the+effort.">Salt and hypertension: is salt dietary reduction worth the effort.</a> The American journal of medicine. 125, 433-439 (2012).</li><li>He, F. J., Li, J., Macgregor, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+longer-term+modest+salt+reduction+on+blood+pressure.">Effect of longer-term modest salt reduction on blood pressure.</a> Cochrane Database Syst Rev. 4, 004937 (2013).</li><li>Weinberger, M. H., Miller, J. Z., Luft, F. C., Grim, C. E., Fineberg, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definitions+and+characteristics+of+sodium+sensitivity+and+blood+pressure+resistance.">Definitions and characteristics of sodium sensitivity and blood pressure resistance.</a> Hypertension. 8, 127-134 (1986).</li><li>Morimoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+sensitivity+and+cardiovascular+events+in+patients+with+essential+hypertension.">Sodium sensitivity and cardiovascular events in patients with essential hypertension.</a> Lancet. 350, 1734-1737 (1997).</li><li>Weinberger, M. H., Fineberg, N. S., Fineberg, S. E., Weinberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salt+sensitivity,+pulse+pressure,+and+death+in+normal+and+hypertensive+humans.">Salt sensitivity, pulse pressure, and death in normal and hypertensive humans.</a> Hypertension. 37, 429-432 (2001).</li><li>Barbaro, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Cell+Amiloride-Sensitive+Channels+Mediate+Sodium-Induced+Inflammation+and+Hypertension.">Dendritic Cell Amiloride-Sensitive Channels Mediate Sodium-Induced Inflammation and Hypertension.</a> Cell Rep. 21, 1009-1020 (2017).</li><li>Kirabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+paradigm+of+sodium+regulation+in+inflammation+and+hypertension.">A new paradigm of sodium regulation in inflammation and hypertension.</a> American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 313, 706-710 (2017).</li><li>Machnik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+regulate+salt-dependent+volume+and+blood+pressure+by+a+vascular+endothelial+growth+factor-C-dependent+buffering+mechanism.">Macrophages regulate salt-dependent volume and blood pressure by a vascular endothelial growth factor-C-dependent buffering mechanism.</a> Nat Med. 15, 545-552 (2009).</li><li>Kopp, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=23Na+magnetic+resonance+imaging-determined+tissue+sodium+in+healthy+subjects+and+hypertensive+patients.">23Na magnetic resonance imaging-determined tissue sodium in healthy subjects and hypertensive patients.</a> Hypertension. 61, 635-640 (2013).</li><li>Dixon, K. B., Davies, S. S., Kirabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+isolevuglandins+in+immunity,+inflammation,+and+hypertension.">Dendritic cells and isolevuglandins in immunity, inflammation, and hypertension.</a> American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 312, 368-374 (2017).</li><li>Kirabo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DC+isoketal-modified+proteins+activate+T+cells+and+promote+hypertension.">DC isoketal-modified proteins activate T cells and promote hypertension.</a> J Clin Invest. 124, 4642-4656 (2014).</li><li>McMaster, W. G., Kirabo, A., Madhur, M. S., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation,+immunity,+and+hypertensive+end-organ+damage.">Inflammation, immunity, and hypertensive end-organ damage.</a> Circ Res. 116, 1022-1033 (2015).</li><li>Harrison, D. G., Vinh, A., Lob, H., Madhur, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+adaptive+immune+system+in+hypertension.">Role of the adaptive immune system in hypertension.</a> Curr Opin Pharmacol. 10, 203-207 (2010).</li><li>Madhur, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+17+promotes+angiotensin+II-induced+hypertension+and+vascular+dysfunction.">Interleukin 17 promotes angiotensin II-induced hypertension and vascular dysfunction.</a> Hypertension. 55, 500-507 (2010).</li><li>Harrison, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation,+immunity,+and+hypertension.">Inflammation, immunity, and hypertension.</a> Hypertension. 57, 132-140 (2011).</li><li>Crowley, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+lymphocyte+responses+by+angiotensin+II+promotes+kidney+injury+in+hypertension.">Stimulation of lymphocyte responses by angiotensin II promotes kidney injury in hypertension.</a> American journal of physiology. Renal physiology. 295, 515-524 (2008).</li><li>Zhang, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+type+1+angiotensin+receptors+on+T+lymphocytes+to+limit+target+organ+damage+in+hypertension.">A novel role for type 1 angiotensin receptors on T lymphocytes to limit target organ damage in hypertension.</a> Circ Res. 110, 1604-1617 (2012).</li></ol>

I det nuvarande protokollet, vi har optimerat förfaranden för att isolera CD11c+ DCs från mjälte möss och adoptively överföra dem till naiva djur att studera DCs roll i salt-inducerad hypertoni. Detta protokoll kan anpassas att isolera och adoptively överföra andra immunceller undergrupper bland annat makrofager och monocyter adaptiv immunceller inklusive T- och B-lymfocyter. Vi har optimerat mjälten rötningsprocessen för att uppnå tillräcklig cellöverlevnad och stabilitet av DC ytan uttryck mar...

Överflödig kost salt är en stor riskfaktor för hypertoni. 1 , 2 the American Heart Association rekommenderar högst 2 300 milligram (mg) natrium (Na+) intag per dag, dock; mindre än 10% av den amerikanska befolkningen har påpekat denna rekommendation. 3 , 4 blygsamma minskningar i Na+ intag sänker blodtrycket och minska de årliga nya fall av hjärt-kärlsjukdomar och stroke i USA med 20%. 5 stora problem med överflödig saltkonsumtion är att 50% av hypertonipopulationen utställningar salt-känslighet, definierades som en ökning av blodtrycket efter NaNa+ lastning eller en liknande blodtrycksfall med 10 mmHg + begränsning och Diures. 6 salt-känslighet också förekommer i 25% av normotensiva individer och är en oberoende prediktor av död och kardiovaskulära händelser. 7 , 8 salt-sensing mekanismer vid hypertoni som involverar njuren har också studerats; Nyare studier antyder dock att immunceller kan känna Na+. 9 , 10
Nyligen tyder på att förändringar i extra nedsatt Na+ hantering kan orsaka ansamling av Na+ i interstitium och främja inflammation. 11 , 12 vårt laboratorium och andra har visat att celler både medfödd och adaptiv immunsystemet bidrar till Förvärrande av hypertoni. 9 , 13 , 14 , 15 olika hypertensiva stimuli, inklusive angiotensin II, noradrenalin och salt orsak makrofager, monocyter och T-lymfocyter att infiltrera njurarna och blodkärlen och främja Na+ lagring, vasokonstriktion, blodtryck höjd och organskada. 9 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 i tidigare studier fann vi att DCs ackumulerar isolevuglandin (IsoLG)-protein addukter som svar på olika hypertensiva stimuli inklusive angiotensin II och DOCA-salt hypertoni. 14 IsoLGs är mycket reaktiva produkter av lipidperoxidation som snabbt och kovalent addukt till lysines på proteiner och deras anhopning är associerad med DC aktivering. 14 vi har nyligen fastställt att förhöjda Na+ är en potent stimulans för IsoLG-protein addukt bildandet i murin DCs.9 Na+ trätt i DCs medieras genom amilorid känsliga transportörer. Na+ växlas sedan kalcium (Ca2 +) via Na+/ca2 + värmeväxlaren. Ca2 + aktiverar proteinkinas C (PKC) som aktiverar den NADPH-oxidas som leder till ökad superoxid (O2· -) och IsoLG-protein addukt bildandet. 9 överföring av salt-exponerade DCs primtal hypertoni som svar på en sub Blodtryckshöjande dos av angiotensin II. 9
Identifiering av CD11c+ DCs från vävnader har tidigare begränsats till immunhistokemi och RT-PCR och isolering av DCs har begränsats till cellen sortera av flödescytometri. Även om flödet flödescytometri cell sortering är en kraftfull metod för isolering av immunceller, det är dyrt, tidskrävande, och leder till en låg avkastning av viabla celler. Därför vi har optimerat ett steg protokoll för vävnad matsmältningen, in vitro-stimulering och överföring av CD11c+ DCs att studera hypertoni.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:824px;" width="823">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">APC/Cy7 anti-mouse CD11c</td>
			<td style="width:160px;">Biolegend</td>
			<td align="right" style="width:140px;">117324</td>
			<td style="width:183px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">autoMACS Running Buffer&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD11c MicroBeads Ultrapure&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-108-338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">11088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS without calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FcR Blocking Reagent</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>&#160;130-092-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">FITC anti-mouse CD45</td>
			<td style="width:160px;">Biolegend</td>
			<td align="right" style="width:140px;">103108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GentleMACS C tube</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GentleMACS dissociator device</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>Use protocol: Spleen 04.01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L34964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QuadroMACs Seperator&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium&#160;</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:140px;">11835-030</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and adoptive transfer of high salt treated antigen-presenting dendritic cells

Överflödigt salt intaget bidrar till inflammation och spelar en viktig roll i utvecklingen av hypertoni. Vi hittade tidigare att antigen-presenterande dendritiska celler (DCs) kan känna förhöjda extracellulära natrium leder till aktivering av den NADPH-oxidasen och bildandet av isolevuglandin (IsoLG)-protein addukter. Dessa IsoLG-protein addukter reagera med self-proteiner och främja en autoimmun-liknande tillstånd och hypertoni. Vi har utvecklat och optimerat state-of-the-art metoder för att studera DC funktion vid hypertoni. Här, vi ger ett detaljerat protokoll för isolering, i vitro behandling med förhöjda natrium, och överföring av murina mjälten CD11c+ celler i mottagarens möss att studera deras roll vid hypertoni.

Figur 1 representerar en schematisk av beskrivs stegen ovan. Isolerade murina mjälte sorteras för CD11c+ DCs av magnetiska cell sortering och klädd i normala salt media (NS; 150 mmol NaCl) eller hög salt media (HS; 190 mmol NaCl) för 48 h. CD11c+ DCs överförs därefter adoptively av retro-orbital injektion till naiva mottagarens möss. Tio dagar senare, implanteras möss med osmotisk men framförallt minipumpar precis vid infusion...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells at JoVE.com

Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells

Här presenterar vi ett protokoll för att isolera dendritiska celler från murina mjälte av magnetiska cell sortering och efterföljande överföring i naiva möss. Modell av hög salthalt aktiverade dendritiska celler valdes för att förklara de stegvisa procedurerna för överföring och flödescytometri.

Isolering och överföring av hög salthalt behandlas Antigen-presenterande dendritiska celler

Excess dietary salt intake contributes to inflammation and plays a vital role in the development of hypertension. We previously found that ...

Denna metod kan svara på viktiga frågor inom områdena hypertoni och hjärt-kärlsjukdom inklusive studiet av CD11c positiva dendritiska celler och hur de potentierar rollen av hypertensiv skada. Den största fördelen med denna teknik är isoleringen av CD11c positiva dendritiska celler från fasta organ och studiet av deras fysiologiska roll i olika sjukdomsstater. Så denna process kan tillämpas på flera immuncelltyper, inklusive B-lymfocyter, T-lymfocyter, monocyter, och makrofager.Visualisering av tekniken är avgörande för att förstå dendritisk cellisolering, särskilt den adoptivöverföringsprocess till mottagarmöss. Till att börja med spraya bröstet och sidorna av den avlivade musen med 70%etanol. På vänster sida, försiktigt öppna huden och peritoneal hålighet för att exponera mjälte.Med hjälp av små tlyn, försiktigt flytta tarmarna och levern till vänster sida av musen. Använd sedan små saxar för att försiktigt punktskatt mjälten. Placera varje struken mjälte i ett märkt C-rör som innehåller tre milliliter RPMI 1640 medium.Först lägga kollagenas D och DNase till beredda RPMI 1640 medium för att förbereda mjälten matsmältningen lösningen. Placera C-röret på en halvautomatisk homogenisator och se till att röret är tätt placerat på den roterande armen. Tryck på startknappen på homogenisatorn för att köra mjälten 04.01-protokollet i 60 sekunder.Efter detta, lossa röret från homogenisatorn och inkubera proverna i 37 grader Celsius under kontinuerlig vid 20 rpm i 15 minuter. Därefter använder en pipetter för att överföra lösningen till en 50 milliliter konisk slang efter filtrering det genom en 40 mikrometer sil. Tvätta silen med 10 milliliter dPBS.Centrifugera cellerna vid 300 gånger g och vid fyra grader Celsius i 10 minuter. Aspirera sedan supernatanten helt och tvätta pelleten genom att på nytt dra in den i 10 milliliter dPBS. Centrifugera upphängningen vid 300 gånger g och vid fyra grader Celsius i 10 minuter.Åter upphäva cell pelleten i fem milliliter dPBS. Använd en hemocytometer och Trypan blå uteslutning för att räkna antalet celler. Nästa centrifug vid 300 gånger g och vid fyra grader Celsius i 10 minuter för att pelleta cellerna.Aspirera supernatanten helt och åter upphäva pelleten i 400 milliliter av Magnetiskt Aktiverad Cellsorteringsbuffert. Tillsätt sedan 100 milliliter CD11c mikropärlor per 100 miljoner celler. Vortexa cellen suspension och inkubera i 10 minuter i ett kylskåp vid fyra grader Celsius.Efter detta, tillsätt 10 milliliter macs buffert för att tvätta cellerna och centrifug vid 300 gånger g och vid fyra grader Celsius i 10 minuter. Aspirera supernatanten helt och åter avbryta cellerna i 500 milliliter av MACs buffert. Placera LS-kolonnen i magnetfältet på mag-separatorn och placera ett koniskt rör på 15 milliliter under varje kolumn för att samla in flödet genom.Därefter sköljer du kolumnerna med tre milliliter buffert. Placera cellupphängningen på varje kolumn och samla in flödet genom vilken innehåller celler utan etikett. Tvätta kolumnerna med tre milliliter macs buffert och samla in de omärkta celler som passerar.Tvätta LS-kolumnerna ytterligare två gånger med hjälp av tre milliliter MACs buffert per tvätt. Efter detta tar du bort LS-kolumnerna från magnetseparatorn. Lägg till fem milliliter macs buffert till varje kolumn och omedelbart störta varje kolumn i en tydlig 15 milliliter koniska röret för att spola ut de magnetiskt märkta cellerna.Använd en hemocytometer och Trypan blå uteslutning för att bestämma CD11c positiva DC-nummer som beskrivs i textprotokollet. Späd sedan cellprovet vid en en till en spädning i 0,4%Trypan blå lösning. Först förbereda cellen pellets i DC kultur media som beskrivs i textprotokollet.Pipett 900 mikroliter av DC-fjädringen till 24-brunns platt bottenfalkplatta. Tillsätt 100 mikroliter av de höga salt DC-odlingsmedierna till varje brunn, för en slutlig natriumkoncentration på 190 millimolar. Märk plattan och placera den i en befuktad koldioxidinkubator på 37 grader Celsius i 48 timmar.Efter 48 timmar ta bort plattan från inkubatorn. Pipettera cellkulturmedierna i en enda brunn upp och ner för att åter upphäva CD11c positiva DCs. Överför all denna suspension i en motsvarande märkt 1,6 milliliter rör.Upprepa detta för varje enskild brunn som var pläterad. Centrifugera alla rören vid 300 gånger g och vid fyra grader Celsius i 10 minuter. Aspirera supernatanten och åter upphäva LIKSTRÖMPELLETEN med 100 mikroliter av steril dPBS.Därefter drar dc-lösningen från en av rören i en milliliter spruta, utrustad med en 27 gauge halvtumnål. Placera den naiva hanen 10 veckor gamla C57-svart-6 mus under 2%isoflurane för att uppnå ett stabilt operationsplan. Kontrollera nivån av anestesi med en brist på pedalreflex.När ett stabilt operationsplan uppnås, långsamt och försiktigt införa nålen i retro-orbital rymden i en vinkel på cirka 30 grader. Injicera långsamt och smidigt CD11c-positiv DC-fjädring. När injektionen är klar, försiktigt bort nålen för retro-orbital rymden, se till att inte skada ögat.Ta sedan bort mössen från noskonen och övervaka dem i cirka 30 minuter under återhämtningen från anestesi. En typisk blodtrycksanalys visas här efter den adoptivöverföring av DCs och osmotiska minipumpar som har implanterats för låg dos Angiotensin II infusion. Det bör noteras att denna låga dos av Angiotensin II är en suppressordos som inte ökar blodtrycket i en normal mus.Möss som får normala saltbehandlade CD11c-positiva DC upprätthåller ett normalt blodtryck under infusionen, medan de möss som får högsaltbehandlade CD11c-positiva DC uppvisar en ökning av systoliskt blodtryck. Flödescytometrianalys utförs sedan utnyttja den gating strategi som visas här för att bestämma renhet av de isolerade CD11c positiva celler. En ökad anrikning av CD11c positiva celler ses jämfört med den totala splenocytes.Olika CD11c Microbead koncentrationer utnyttjas för att felsöka tillverkarens protokoll. Magnetisk separat av splenocyter med hjälp av 100 mikroliter av Microbeads ger cirka 65%av CD11c positiva celler, medan du använder 200 mikroliter ger 55%och använder 300 mikroliter ger 50%An FcR blockerare ingår tillsammans med 100 mikroliter microbeads. Efter den magnetiska separationen ger blockaden av FcR cirka 65%CD11c positiva celler.Vissa splenocyter inkuberas sedan med 100 mikroliter microbeader av Microbeads och magnetiskt separeras genom en LS-kolonn. De separerade cellerna inkuberas med ytterligare 100 mikroliter av CD11c och separeras igen genom en LS-kolonn. Denna dubbel isolering process gav 92%CD11c positiva celler.När du försöker detta förfarande, Är det viktigt att bekräfta renheten hos de isolerade cellerna genom flödescytometri. Efter magnetisk isolering av dendritiska celler de kan odlas för att bestämma deras aktiveringsstatus genom molekylära tekniker inklusive proteomik och encellig sekvensering. Sedan dess utveckling, är det nu möjligt att studera funktionen och specifika roll dendritiska celler i högt blodtryck.Forskare undersöker nu de specifika antigenerna i högt blodtryck.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

Experimentell Metastas och CTL adoptiv transfer Immunterapi musmodell

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into ...

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-IG Baserat Konstgjord antigenpresenterande celler för effektiv Ex vivo Utbyggnad av mänskliga CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Isolering av Dendritiska Mouse lungceller

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Konstgjord antigenpresenterande cell (AAPC) medierad aktivering och utbyggnad av naturliga mördarceller T

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

Accelerated Type 1 Diabetes induktion i möss genom adoptiv överföring av diabetogen CD4 + T-celler

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Isolering, rening och märkning av benmärg hos möss Neutrofiler för funktionella studier och adoptivföräldrar Experimentera Transfer

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Isolering av myeloida dendritiska celler och epitelceller från Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Bedöma utvecklingen av murina plasmacytoid dendritiska celler i Peyers Patches Använda adoptiv överföring av hematopoetiska stamfäder

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificiell antigenpresenterande celler (KaAPC) för effektiv<em&gt; In Vitro</em&gt; Utarmning av humant antigen-specifika T-celler

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induktion av murina tarminflammation med adoptiv överföring av Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hög</sup&gt; T-celler i möss med immunbrist

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...