Name: isolation and adoptive transfer of high salt treated antigen-presenting dendritic cells
Uploaded: 2019-03-05T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells at JoVE.com

Bu eser tarafından desteklenen Amerikan Kalp Derneği için N.R.B. POST290900 verir, 17SDG33670829 L.X. ve ulusal sağlık Enstitüleri vermek K01HL130497 için A.K.

Vanderbilt Üniversitesi'nin kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi burada açıklanan yordamları onayladı. Fareler yer alan ve uygun olarak Kılavuzu bakım ve laboratuvar hayvanlarının kullanımı (Ulusal akademiler Press. için bakım Yeniden düzenlenen 2010).
1. yalıtım dalağı fare dan
<ol><li>1640 RPMI hazırlayın: %10 FBS, 0.10 mM HEPES, 1 mM sodyum pyruvate, 50 µM β-mercaptoethanol ve % 1 penisilin/streptomisin.</li>
	<li>10-12 hafta ötenazi-CO2 Solunduğ...

<ol>
	<li>Kearney, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+burden+of+hypertension:+analysis+of+worldwide+data.">Global burden of hypertension: analysis of worldwide data.</a> Lancet. 365, 217-223 (2005).</li><li>Murray, C. J., Lopez, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+global+burden+of+disease.">Measuring the global burden of disease.</a> N Engl J Med. 369, 448-457 (2013).</li><li>Lev-Ran, A., Porta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salt+and+hypertension:+a+phylogenetic+perspective.">Salt and hypertension: a phylogenetic perspective.</a> Diabetes/metabolism research and reviews. 21, 118-131 (2005).</li><li>Frisoli, T. M., Schmieder, R. E., Grodzicki, T., Messerli, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salt+and+hypertension:+is+salt+dietary+reduction+worth+the+effort.">Salt and hypertension: is salt dietary reduction worth the effort.</a> The American journal of medicine. 125, 433-439 (2012).</li><li>He, F. J., Li, J., Macgregor, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+longer-term+modest+salt+reduction+on+blood+pressure.">Effect of longer-term modest salt reduction on blood pressure.</a> Cochrane Database Syst Rev. 4, 004937 (2013).</li><li>Weinberger, M. H., Miller, J. Z., Luft, F. C., Grim, C. E., Fineberg, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definitions+and+characteristics+of+sodium+sensitivity+and+blood+pressure+resistance.">Definitions and characteristics of sodium sensitivity and blood pressure resistance.</a> Hypertension. 8, 127-134 (1986).</li><li>Morimoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+sensitivity+and+cardiovascular+events+in+patients+with+essential+hypertension.">Sodium sensitivity and cardiovascular events in patients with essential hypertension.</a> Lancet. 350, 1734-1737 (1997).</li><li>Weinberger, M. H., Fineberg, N. S., Fineberg, S. E., Weinberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salt+sensitivity,+pulse+pressure,+and+death+in+normal+and+hypertensive+humans.">Salt sensitivity, pulse pressure, and death in normal and hypertensive humans.</a> Hypertension. 37, 429-432 (2001).</li><li>Barbaro, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Cell+Amiloride-Sensitive+Channels+Mediate+Sodium-Induced+Inflammation+and+Hypertension.">Dendritic Cell Amiloride-Sensitive Channels Mediate Sodium-Induced Inflammation and Hypertension.</a> Cell Rep. 21, 1009-1020 (2017).</li><li>Kirabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+paradigm+of+sodium+regulation+in+inflammation+and+hypertension.">A new paradigm of sodium regulation in inflammation and hypertension.</a> American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 313, 706-710 (2017).</li><li>Machnik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+regulate+salt-dependent+volume+and+blood+pressure+by+a+vascular+endothelial+growth+factor-C-dependent+buffering+mechanism.">Macrophages regulate salt-dependent volume and blood pressure by a vascular endothelial growth factor-C-dependent buffering mechanism.</a> Nat Med. 15, 545-552 (2009).</li><li>Kopp, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=23Na+magnetic+resonance+imaging-determined+tissue+sodium+in+healthy+subjects+and+hypertensive+patients.">23Na magnetic resonance imaging-determined tissue sodium in healthy subjects and hypertensive patients.</a> Hypertension. 61, 635-640 (2013).</li><li>Dixon, K. B., Davies, S. S., Kirabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+isolevuglandins+in+immunity,+inflammation,+and+hypertension.">Dendritic cells and isolevuglandins in immunity, inflammation, and hypertension.</a> American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 312, 368-374 (2017).</li><li>Kirabo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DC+isoketal-modified+proteins+activate+T+cells+and+promote+hypertension.">DC isoketal-modified proteins activate T cells and promote hypertension.</a> J Clin Invest. 124, 4642-4656 (2014).</li><li>McMaster, W. G., Kirabo, A., Madhur, M. S., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation,+immunity,+and+hypertensive+end-organ+damage.">Inflammation, immunity, and hypertensive end-organ damage.</a> Circ Res. 116, 1022-1033 (2015).</li><li>Harrison, D. G., Vinh, A., Lob, H., Madhur, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+adaptive+immune+system+in+hypertension.">Role of the adaptive immune system in hypertension.</a> Curr Opin Pharmacol. 10, 203-207 (2010).</li><li>Madhur, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+17+promotes+angiotensin+II-induced+hypertension+and+vascular+dysfunction.">Interleukin 17 promotes angiotensin II-induced hypertension and vascular dysfunction.</a> Hypertension. 55, 500-507 (2010).</li><li>Harrison, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation,+immunity,+and+hypertension.">Inflammation, immunity, and hypertension.</a> Hypertension. 57, 132-140 (2011).</li><li>Crowley, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+lymphocyte+responses+by+angiotensin+II+promotes+kidney+injury+in+hypertension.">Stimulation of lymphocyte responses by angiotensin II promotes kidney injury in hypertension.</a> American journal of physiology. Renal physiology. 295, 515-524 (2008).</li><li>Zhang, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+type+1+angiotensin+receptors+on+T+lymphocytes+to+limit+target+organ+damage+in+hypertension.">A novel role for type 1 angiotensin receptors on T lymphocytes to limit target organ damage in hypertension.</a> Circ Res. 110, 1604-1617 (2012).</li></ol>

Geçerli protokol yordamlar CD11c yalıtmak için optimize edilmiş+ DCs dalağı fareler ve adoptively onları DCs rol tuz kaynaklı hipertansiyonda çalışmaya naif hayvanlar içine transfer. Bu iletişim kuralı yalıtmak ve adoptively makrofajlar, monosit ve T ve B lenfositleri de dahil olmak üzere edinilmiş bağışıklık hücreleri de dahil olmak üzere diğer bağışıklık hücre alt kümeleri aktarmak için adapte edilebilir. Biz yeterli hücre hayatta kalma ve istikrar DC yüzey ifade işaretley...

Aşırı diyet tuz hipertansiyon için önemli bir risk faktörüdür. 1 , 2 Amerikan Kalp Derneği en fazla 2,300 miligram (mg) sodyum (Na+) alımı günlük, ancak önerir; ABD nüfusunun % 10'dan daha az bu öneriye gözlemler. 3 , 4 mütevazı indirimleri Na+ alımı düşük kan basıncı ve Koroner kalp hastalığı ve inme ABD'de yıllık yeni olgu % 20 oranında azaltmak. 5 hipertansif nüfusunun % 50 tuz-duyarlılık, sergiler aşırı tuz tüketimi ile önemli bir sorun olduğunu Na+ yükleme veya benzer bir damla kan basıncında Nasonra aşağıdaki tansiyon 10 mmHg artış olarak tanımlanan + kısıtlama ve diyürez. 6 tuz-hassasiyet Ayrıca normotansif kişilerin % 25 oluşur ve ölüm ve kardiyovasküler olaylar bağımsız bir tahmin. 7 , 8 tuz algılama mekanizmaları böbrek içeren hipertansiyonda de incelenmiştir; Ancak son yıllarda yapılan çalışmalarda bağışıklık hücreleri Na+hissi olabilir düşündürmektedir. 9 , 10
Son kanıtlar işleme değişiklikleri ekstra renal Na+ iltihabı teşvik ve interstitium Na+ birikimi neden olabilir gösteriyor. 11 , 12 bizim laboratuvar ve diğerleri doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık sistemi hücrelerinin hipertansiyon alevlenmesi için katkıda göstermiştir. 9 , 13 , 14 , 15 Anjiyotensin II, norepinefrin ve tuz neden makrofajlar, monosit ve T lenfositleri böbrek ve damarlara sızmak ve teşvik Na+ saklama, vazokonstriksiyona, kan basıncı da dahil olmak üzere çeşitli hipertansif bir çekim gücü, bakış açısını ve uç-organ hasarı. 9 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 önceki çalışmalarda, DCs isolevuglandin (IsoLG) birikir bulduk-protein adducts Anjiyotensin II ve DOCA-tuz hipertansiyon da dahil olmak üzere çeşitli hipertansif uyaranlara yanıt olarak. 14 IsoLGs lysines üzerinde proteinler için hızla ve kovalent adduct büyük ölçüde reaktif lipid peroksidasyon ürünleri vardır ve onların birikimi DC harekete geçirmek ile ilişkilidir. Biz son zamanlarda yükseltilmiş Na+ IsoLG-protein için güçlü bir uyarıcı olduğunu kurduk 14 adduct DCs.9 Na+ girmesinden DCs amiloride hassas taşıyıcıları aracılık ettiği antikorundan oluşumu. Na+ sonra kalsiyum (Ca2 +) Na+/Ca2 + Eşanjör üzerinden için değiştirilir. CA2 + protein kinaz C (PKC) artan süperoksit için (O2· -) önde gelen NADPH oksidaz etkinleştirir etkinleştirir ve IsoLG-protein adduct oluşumu. 9 yanıt olarak Anjiyotensin II alt pressor bir doz DCs asal hipertansiyon tuz maruz evlat edinen transferi. 9
CD11c tanımlaması+ DCs dan doku immünhistokimya ve RT-PCR ile daha önce sınırlı olmuştur, ve yalıtım DC'lerin Akış Sitometresi tarafından sıralama hücreye sınırlı olmuştur. Akış Sitometresi hücre sıralama bağışıklık hücreleri yalıtım için güçlü bir yöntem olsa da, pahalı, zaman alıcı ve hücrelerin bir düşük verim için yol açar. Bu nedenle, biz bir adım adım protokol doku sindirim, tüp bebek stimülasyon ve evlat edinen transferi CD11c için optimize+ hipertansiyon çalışmaya DCs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:824px;" width="823">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">APC/Cy7 anti-mouse CD11c</td>
			<td style="width:160px;">Biolegend</td>
			<td align="right" style="width:140px;">117324</td>
			<td style="width:183px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">autoMACS Running Buffer&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD11c MicroBeads Ultrapure&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-108-338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">11088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS without calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FcR Blocking Reagent</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>&#160;130-092-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:341px;">FITC anti-mouse CD45</td>
			<td style="width:160px;">Biolegend</td>
			<td align="right" style="width:140px;">103108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GentleMACS C tube</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GentleMACS dissociator device</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>Use protocol: Spleen 04.01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L34964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QuadroMACs Seperator&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium&#160;</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:140px;">11835-030</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and adoptive transfer of high salt treated antigen-presenting dendritic cells

Aşırı diyet tuz tüketiminizi iltihap için katkıda bulunur ve hipertansiyon gelişiminde önemli bir rol oynar. Daha önce dendritik hücreler (DC) antijen sunan lider NADPH oksidaz aktivasyonu ve isolevuglandin (IsoLG) oluşumu için yükseltilmiş ekstraselüler sodyum hissedebiliyorum bulduk-protein adducts. Bu IsoLG protein tepki öz-proteinler ile adducts ve bir devlet gibi otoimmün ve hipertansiyon tanıtmak. Biz geliştirdik ve hipertansiyon işlevinde DC incelemek için state-of--art yöntemleri en iyi duruma getirilmiş. Burada, detaylı bir protokol yalıtımı için içinde sağlamak yüksek sodyum ve fare dalak CD11c evlat edinen transferi ile in vitro tedavi+ hücreleri hipertansiyon içindeki rollerine çalışmaya alıcı fareler içine.

Şekil 1 bir şematik yukarıda açıklanan adımları temsil eder. İzole fare dalağı CD11c için sıralanır+ DCs sıralama ve normal tuz ortamları (NS; 150 mmol NaCl) veya yüksek tuz medya (HS; 190 mmol NaCl) 48 h. CD11c kaplama manyetik hücre+ DCs sonra adoptively retro-orbital tarafından aktarılır enjeksiyon saf alıcı fareler için. On gün sonra 14 gün boyunca düşük doz Anjiyotensin II (140 ng/kg/dk) infüzyon için o...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells at JoVE.com

Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells

Burada, manyetik hücre sıralama ve içine saf fareler sonraki evlat edinen transfer tarafından fare dalağı dendritik hücreleri izole etmek için bir iletişim kuralı mevcut. Yüksek tuz aktif dendritik hücre modeli evlat edinen transfer ve Akış Sitometresi adım adım yordamlar açıklamak için seçildi.

Yalıtım ve yüksek tuz evlat edinen Transfer dendritik hücreler antijen sunan tedavi

Excess dietary salt intake contributes to inflammation and plays a vital role in the development of hypertension. We previously found that ...

Bu yöntem, CD11c pozitif dendritik hücrelerin incelenmesi ve hipertansif yaralanmanın rolünü nasıl güçlü hale getirebilirler dahil olmak üzere hipertansiyon ve kardiyovasküler hastalık alanlarındaki temel soruları yanıtlayabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı CD11c pozitif dendritik hücrelerin katı organlardan izole edilmesi ve çeşitli hastalık durumlarında fizyolojik rollerinin incelenmesidir. Yani bu süreç birden fazla bağışıklık hücresi tipleri uygulanabilir, B lenfositler de dahil olmak üzere, T lenfositler, monositler, ve makrofajlar.Tekniğin görselleştirilmesi dendritik hücre izolasyonunu, özellikle alıcı farelere evlat edinme transfer sürecini anlamak için önemlidir. Başlamak için, göğüs ve ötanazi farenin yan% 70 etanol ile sprey. Sol tarafta, dikkatle dalak ortaya çıkarmak için deri ve periton boşluğu açın.Küçük forceps kullanarak, dikkatli farenin sol tarafına bağırsak ve karaciğer hareket ettirin. Sonra yavaşça dalak çıkarmak için küçük makas kullanın. Her eksinti dalağını üç mililitre RPMI 1640 orta içeren etiketli bir C tüpüne yerleştirin.İlk dalak sindirim çözeltisi hazırlamak için hazırlanan RPMI 1640 orta kollajenaz D ve DNase ekleyin. C tüpünü yarı otomatik bir homogenizer üzerine yerleştirin ve tüpün dönen kola sıkıca yerleştirildiğinden emin olun. Dalak 04.01 protokolünü 60 saniye çalıştırmak için homogenizer'ın başlangıç düğmesine basın.Bundan sonra tüpü homogenizer'den ayırın ve numuneleri 37 derecede 20 rpm'de 15 dakika boyunca sürekli olarak kuluçkaya yatırın. Daha sonra, 40 mikrometrelik bir süzgeçten filtreledikten sonra çözeltiyi 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için bir pipet kullanın. Süzgeci 10 mililitre dPBS ile yıkayın.Hücreleri 300 kez g ve 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüj edin. Daha sonra supernatant'ı tamamen aspire edin ve 10 mililitre dPBS'de yeniden askıya alarak peleti yıkayın. Süspansiyonu 300 kez g ve 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüj edin.Hücre peletini beş mililitre dPBS'de yeniden askıya alın. Hücre sayısını saymak için hemositometre ve Trypan mavisi dışlama kullanın. Sonraki santrifüj 300 kez g ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca hücreleri pelet.Süpernatant'ı tamamen aspire edin ve manyetik olarak aktive edilmiş hücre sıralama tamponunun 400 mililitresinde peleti yeniden askıya alın. Sonra 100 milyon hücre başına 100 mililitre CD11c mikroboncukekleyin. Hücre süspansiyonu girdap ve dört santigrat derece bir buzdolabında 10 dakika kuluçka.Bundan sonra, hücreleri yıkamak için 10 mililitre MACs tampon ekleyin ve santrifüj 300 kez g ve 10 dakika boyunca dört derece santigrat. Süpernatant'ı tamamen aspire edin ve 500 mililitre LIK MAC tamponundaki hücreleri yeniden askıya alın. LS sütunu mag ayırıcının manyetik alanına yerleştirin ve akışı toplamak için her sütunun altına 15 mililitrelik konik bir tüp yerleştirin.Ardından, sütunları üç mililitre arabellekle durula. Hücre süspansiyonunu her sütuna yerleştirin ve etiketlenmemiş hücreler içeren akışı toplayın. Sütunları üç mililitre MAC arabelleğiyle yıkayın ve içinden geçen etiketlenmemiş hücreleri toplayın.Yıkama başına üç mililitre MAC tamponu kullanarak LS sütunlarını iki kez daha yıkayın. Bundan sonra, Manyetik ayırıcıdan LS sütunları çıkarın. Her sütuna beş mililitre MAC söyit arabelleği ekleyin ve manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri temizlemek için her sütunu hemen 15 mililitrelik konik bir tüpe daldırın.Metin protokolünde belirtildiği gibi CD11c pozitif DC numarasını belirlemek için hemositometre ve Trypan mavisi dışlama kullanın. Daha sonra hücre örneğini %0,4 Trypan mavi çözeltisinde bire bir seyreltme de seyreltin. İlk olarak, metin protokolünde belirtildiği gibi DC kültür medyasında hücre peletlerini hazırlayın.Pipet 900 dc süspansiyon mikrolitre 24-iyi düz alt şahin plaka içine. 190 milimolar son sodyum konsantrasyonu için, her iyi yüksek tuz DC kültür medya 100 mikrolitre ekleyin. Plakayı etiketle ve 48 saat boyunca 37 derecede nemlendirilmiş karbondioksit kuvöze yerleştirin.48 saat sonra tabağı kuvözden çıkarın. Pipet tek bir kuyuda hücre kültürü medya cd11c pozitif DC'leri yeniden askıya almak için yukarı ve aşağı.Kaplamalı her bir kuyu için bunu tekrarlayın. Tüm tüpleri 300 kez g ve 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüj edin. Supernatant aspire ve steril dPBS 100 mikrolitre ile DC pelet yeniden askıya.Daha sonra, 27 gauge yarım inç iğne ile donatılmış bir mililitreşile şırınga içine tüplerin birinden DC çözeltisi çizin. Naif erkek 10 haftalık C57-siyah-6 fareyi %2 izoflurane altına yerleştirin ve istikrarlı bir cerrahi düzlem elde edin. Pedal refleks eksikliği ile anestezi düzeyini kontrol edin.Kararlı bir cerrahi düzlem elde edildikten sonra, yavaş yavaş ve dikkatli bir şekilde yaklaşık 30 derecelik bir açıyla retro-orbital uzaya iğne tanıtmak. CD11c pozitif DC süspansiyonu yavaşça ve sorunsuz bir şekilde enjekte edin. Enjeksiyon tamamlandıktan sonra, dikkatle retro-orbital alan için iğne kaldırmak, göze zarar vermemek için emin olun.Daha sonra fareleri burun konisinden çıkarın ve anesteziden kurtarma sırasında yaklaşık 30 dakika boyunca izleyin. Düşük doz Anjiyotensin II infüzyonu için implante edilmiş DC'lerin ve ozmotik mini pompaların benimsenen transferi sonrasında tipik bir kan basıncı analizi burada gösterilmiştir. Bu Anjiyotensin II bu düşük doz normal bir fare de kan basıncını artırmaz bir bastırıcı doz olduğu unutulmamalıdır.Normal tuz ile tedavi edilen CD11c pozitif DC alan fareler infüzyon sırasında normal kan basıncını korurken, yüksek tuz tedavisi gören fareler CD11c pozitif DC'ler sistolik kan basıncında artış sergilerler. Akış sitometri analizi daha sonra izole CD11c pozitif hücrelerin saflığını belirlemek için burada gösterilen gating stratejisi kullanılarak gerçekleştirilir. CD11c pozitif hücrelerin toplam splenositlere göre daha fazla zenginleşmesi görülmektedir.Üreticinin protokolünü gidermek için farklı CD11c Microbead konsantrasyonları kullanılır. 100 mikrolitre Mikroboncuk kullanarak splenositlerin manyetik ayrı cd11c pozitif hücrelerin yaklaşık% 65 verimleri, 200 mikrolitre kullanarak% 55 verimleri ve 300 mikrolitre kullanarak% 50 Bir FcR bloker ile birlikte Mikroboncuklar 100 mikrolitre dahildir. Manyetik ayrıştırma sonrasında, FcR abluka yaklaşık% 65 CD11c pozitif hücreler verir.Bazı splenositler daha sonra 100 mikrolitre Mikroboncuk ile kuluçkaya yatırılır ve manyetik olarak bir LS sütunu ile ayrılır. Ayrılmış hücreler cd11c ek bir 100 mikrolitre ile kuluçka ve bir LS sütun ile tekrar ayrılır. Bu çift izolasyon işlemi% 92 CD11c pozitif hücreler verdi.Bu yordamı çalışırken, akış sitometri ile izole hücrelerin saflığını onaylamak önemlidir. Dendritik hücrelerin manyetik izolasyonunu takiben proteomik ve tek hücreli dizileme gibi moleküler tekniklerle aktivasyon durumlarını belirlemek için kültürlenebilirler. Gelişiminden bu yana, artık hipertansiyonda dendritik hücrelerin işlevini ve özel rolünü incelemek mümkündür.Araştırmacılar şimdi hipertansiyon belirli antijenler araştırıyoruz.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

Deneysel metastaz ve CTL Kabul edilmiş Transfer İmmünoterapi Fare Modeli

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into ...

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

Verimli HLA-Ig Tabanlı Yapay antijen sunan hücrelerin Ex vivo</emİnsan CTL> Genleşme

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Fare Akciğer Dendritik Hücrelerinin İzolasyonu

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Yapay Antijen Hücre (AAPC) Aracılı Aktivasyon ve Doğal Öldürücü T hücreleri genişletilmesi Presenting

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

Diyabetojenik CD4 Kabul edilmiş Transfer ile Farelerde Hızlandırılmış Tip 1 Diyabet İndüksiyon + T Hücreleri

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

İzolasyon, Arıtma ve İşlevsel Araştırmalar ve Kabul edilmiş Transfer deneyler için Fare Kemik İliği Nötrofiller Etiketlenmesi

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

İnsan Thymus ile myeloid dendritik hücreleri ve epitel hücreleri İzolasyonu

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Hematopoetik progenitörlerin Evlatlık Transferi kullanarak Peter Parçacıklannda Murin plazmasitoid dendritik hücreleri Gelişimini değerlendirilmesi

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Etkin Killer yapay antijen sunan hücreler (KaAPC)<em&gt; İn Vitro</em&gt; İnsan Antijen-spesifik T hücrelerinin tükenmesi

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Efektör CD4 Evlatlık transferi ile Kemirgen Bağırsak Enflamasyon indüksiyonu<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Yüksek</sup&gt; Bağışık yetmezliği olan farelere içine T Hücreleri

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...