非刺激性肽MHC复合物不激活T细胞，但可以增强T细胞对激动肽MHC的反应。该协议描述了一个实验系统，用于研究人类CD8T细胞激活过程中的共同对抗。我们用共价链接重链、β-2-微球蛋白和肽将MHC分子表达为单链复合物。
这允许将突变引入MHC分子，呈现预先确定的肽。该协议使用人类CTN克隆，这是乙型肝炎病毒的特异性表皮。了解T细胞对肝炎反应过程中共性机制有助于这种病毒感染的免疫药物的发展。
提出的方法可用于研究T细胞活化的其他基本方面，在人类T细胞系统中具有已知的肽MHC特异性。该协议使用单链人类MHC类MHC分子，包括信号序列、感兴趣的肽、链接器、人类β-2-微球蛋白链接器和MHC重链。乙型肝炎的E1A3肽用作激动肽。
来自艾滋病毒的Gag被用作非刺激性肽。单链人类MHC分子在含有四环素抑制器的仓鼠细胞系中表达。Agonist 单链 MHC 使用四环素致电质质表达，在没有四环素的情况下导致表达水平非常低，在四环素存在时表达水平高。
表达低水平激动肽MHC的CHO细胞与组织表达的非刺激性肽MHC进行转染。使用该实验系统可以比较T细胞反应与激动肽MHC在是否存在非刺激肽MHC。要开始此过程，在T-75烧瓶中培养CHO细胞，如文本协议中所述。
在T细胞激活实验的第一天，用PBS清洗烧瓶中的细胞。在PBS中加入含有05%三辛和2%EDTA的溶液，在室温下孵育5至10分钟。使用光学显微镜观察细胞，以确保它们分离。
然后将完整的 F12 添加到烧瓶中，以停止尝试。将细胞悬浮液转移到 15 毫升管中。在400G下离心5分钟，通过移液或脱液去除上流水。
将细胞颗粒重新悬浮在完整的 F12 的五毫升中。使用血细胞计计算细胞，并在CF12中将细胞浓度调整为每毫升20万个细胞。每毫升四环素加入50至60毫微克至仅激动剂样品中，以诱导大量激动剂pMHC类我表达为阳性对照。
在此之后，通过涡流或移液混合CHO细胞。在 U 型 96 井板的每个井中加入 100 微升的电池悬浮液。在37摄氏度下孵育，二氧化碳含量为5%。
实验前一天，将CTLS细胞在400倍G和4摄氏度下离心5分钟。使用血细胞计计算细胞，并在没有细胞因子或PHA的完整人类T细胞介质中以每毫升100万个细胞的密度重新悬浮细胞。在37摄氏度下孵育CTL，用5%的二氧化碳孵育。
第二天，将T细胞在400倍G和4摄氏度下离心5分钟。丢弃上一提液，并在2毫升完整的无血清介质中重新悬浮细胞。使用血细胞计计算T细胞，并在完整的人类T细胞培养中调整其密度为每毫升100万活细胞。
在1至100稀释时加入抗人CD107a抗体，在1至1000稀释时加入布雷费尔丁A抗体。接下来，检索包含CHO细胞的96井板。使用玻璃巴斯德移液器，从CHO细胞中吸出介质。
在每个井中加入200微升T细胞悬浮液。在37摄氏度下用5%的二氧化碳与CHO细胞共同培养T细胞，三到四个小时。在联合培养结束时，将96井板在400倍G和4摄氏度下离心5分钟。
通过吸气或轻拂去除上一液。然后在每个井中加入2.5微升CD3抗体和2.5微升CD8抗体，用于细胞表面抗原染色，并通过移液混合。在黑暗中和冰上孵育样品30分钟。
在此之后，在每个井中加入150微升的洗涤缓冲液以清洗样品。将样品在400倍G和4摄氏度下离心5分钟。通过吸气或轻拂去除上一液。
设置固定/渗透套件，并在每一个井中添加 100 微升固定/渗透溶液，并混合移液器。在冰上孵育20分钟。然后，在4摄氏度下将板在400倍G下离心5分钟。
丢弃上流水，向每井添加 200 微升 1X perm/洗涤缓冲液。从离心重复此过程，通过添加一次看率/洗涤缓冲液。在此之后，重新悬浮在50微升的施法/洗涤缓冲液中，其浓度为每毫升3微克。
在黑暗中冰上孵育30分钟。接下来，添加 150 微升 1X perm/洗涤缓冲液。在400G，4摄氏度的离心机，5分钟。
拆下上流液并添加 200 微升 1X perm/洗涤缓冲液。在 400 倍 G、4 摄氏度下再次离心板，5 分钟，然后通过吸气或轻拂去除上看液。将样品重新悬浮在200微升洗涤缓冲液中，然后进行细胞测量分析。
在实验前一天，通过涡流或移液混合CHO细胞。接下来，在12井板的每个井中加入一毫升的细胞悬浮液。在37摄氏度下孵育，二氧化碳含量为5%。
在实验当天，使用细胞刮刀将CHO细胞从每一个井的底部分离。将含有细胞的一毫升介质从每一井转移到 FACS 管中。在400倍G和4摄氏度的离心机5分钟。
在洗涤缓冲液中稀释的100微升抗HLA抗体中重新悬浮。在冰上孵育30分钟。然后向每个 CHO 样品添加一毫升洗涤缓冲液。
在400倍G和4摄氏度下离心5分钟，然后丢弃上一代。将每个样品重新悬浮在3毫升的洗涤缓冲液中，然后进行流式细胞测量分析。本研究提出了一种强大的工具，用于研究人类CD8阳性T细胞活化期间的分子相互作用。
生成一种工程异源系统，在存在或不存在共激动剂 pMHC 时，可呈现低水平的激动性 pMHC。然后，这些工程中的 APC 用于刺激 E183 特异性人类 CD8 阳性 T 细胞克隆。未转染的CHO细胞和表达非刺激性单链Gag-MHC复合物的CHO细胞不会诱导激活。
正对照的对子单链E183-MHC复合物的高水平表达，被认为能诱导非常有效的干扰素-伽马生产和去气，表明单链E183结构可以由特定的TCR来激活T细胞效应器功能。低水平的单链E183-MHC复合物的表达诱导低浓度的干扰素-伽马生产和降气，这通过非刺激性Gag-MHC复合物的存在而得到加强。请注意，即使对低水平抗原性 pMHC 做出响应，也观察到非常高的 CD107a+T 细胞百分比，这与先前的研究一致。
然而，非刺激性Gag-MHC复合物的存在增加了CD107a MFI。在这个程序中，控制激动肽MHC表达对于确保无刺激肽的激动剂表达至关重要。在每个实验中使用TCR样抗体量化激动剂肽MHC表达至关重要。
另一种方法是使用支持的脂质双层，或珠子，呈现固定量的激动肽MHC在非刺激肽MHC的存在。这些实验系统应允许测试多个非刺激肽序列的共对抗。单链MHC技术可用于研究CD4 T细胞活化中的分子相互作用，以及研究非经典MHC分子。
该协议使用人类血液和人类细胞。使用人类血液时，请遵循所有必要的预防措施，以降低血液传播疾病的风险。
