Name: use of single chain mhc technology to investigate co-agonism in human cd8+ t cell activation
Uploaded: 2019-02-28T15:00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Single Chain MHC Technology to Investigate Co-agonism in Human CD8+ T Cell Activation at JoVE.com

Denne forskning blev støttet af Singapore Ministry of Healths nationale medicinske Forskningsråd under sin CBRG/0064/2014 til N.R.J.G., ved Opret under sin R571-002-012-592 til P.A.M., National Research Foundation Investigatorship R571-000-272-281 til P.A.M ., og af en Singapore Translationel forskning (STaR) Investigator Award (NMRC-STaR-013/2012) til A.B. Vi er taknemmelige for Dr. Paul Hutchinson og Mr. Teo Guo Hui fra NUS immunologi programmet Flow Core facilitet ved ekspert celle sortering. Vi er taknemmelige for Elijah Chen kritisk læsning af manuskriptet.

Bemærk: Alle skridt involverer brug af levende, ikke-fast celler bør udføres i en biosikkerhed hætte, og enhver biologisk affald skal kasseres lokale sundheds- og forordninger.
1. CHO celle Transfektion og Generation af stabil CHO cellelinjer
<ol><li>
CHO celle Transfektion Bemærk: dette afsnit beskriver CHO celle Transfektion ved hjælp af polyethylenimine (PEI). Men alternative metoder kan bruges, som CHO celler er forholdsvis let at transfect ved hjælp af kommercielt tilgængelige lipid Transfektion reagenser.<ol>
<li>Kultur CHO celler i komplet F12 (cF12, F12 suppleret med 5% FBS, 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin og 10 µg/mL blasticidin at opretholde udtryk for tetracyclin repressor). Passage cellerne hver 3-4 dage på en 1:10 ratio.</li>
		<li>En dag før Transfektion, forberede cellesuspension CHO. Vaske CHO celler i kolben ved hjælp af PBS (10 mL til PBS for en T75 kolbe, 5 mL PBS for en T25 kolbe). Tilføje 0,05% Trypsin/0.02% EDTA i PBS (2 mL til en T75 kolbe, 1 mL til en T25 kolbe) kolben og der inkuberes i 5-10 min. ved stuetemperatur (RT). Du bruger et lysmikroskop, kontrollere at cellerne er skilt, og stop trypsinization ved at tilføje cF12 til kolbe (8 mL for en T75 kolbe, 4 mL til en T25 kolbe).</li>
		<li>Overføre CHO cellesuspension til en 15 mL tube, og der centrifugeres ved 300-400 x g i 5 min. ved 4 ° C, eller RT. Fjern supernatanten, genopslæmmes i cF12 (10 mL til en T75 kolbe, 5 mL til en T25 kolbe) og tæller ved hjælp af en hemocytometer.</li>
		<li>Justere celle koncentration til 60.000-100.000 CHO celler/mL. Der tilsættes 5 mL af CHO cellesuspension (300.000-500.000 CHO celler) pr. brønd i en 6 godt plade. Der inkuberes natten over ved 37 ° C, 5% CO2.</li>
		<li>På dagen for Transfektion, tilføje 400 μL serum-fri F12 medier eller lavt serum medier til en 1,5 mL tube. Tilføje 3 μg af plasmid til 400 μL af medier. Mix af pipettering. Tilføj 6 μg af PEI (6 μL af 1 mg/mL PEI løsning) til media/DNA mix og vortex straks for 10 s.</li>
		<li>Inkuber DNA-media-PEI mix på RT for 10-15 min. Under denne inkubering erstatte CHO celle medier i 6 godt pladen med 5 mL frisk cF12 medier.</li>
		<li>Tilføje medier/DNA/PEI løsning til CHO celler. Tilføje løsningen dråbevis og jævnt over godt. Der inkuberes natten over ved 37 ° C, 5% CO2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Generation af stabil CHO cellelinjer
	<ol>
<li>En dag efter Transfektion, fjerne medier fra brøndene og tilsættes 5 mL af cF12 indeholdende de passende udvalg antibiotika til hver brønd. Bruge 0,3 mg/mL hygromycin til pcDNA5TO-baseret plasmider, og 1 mg/mL geneticin til pcDNA3-baseret plasmider.</li>
		<li>Hvis celler reach mere end 90% confluency på 24 h bogfører Transfektion, trypsinize cellerne.</li>
		<li>Vaske brønde med 1 mL PBS pr. brønd, tilsættes 1 mL 0,05% trypsin/0.02% EDTA i PBS og inkuberes i 5-10 min. ved RT. Brug et lysmikroskop, kontrollere, at cellerne er skilt, og stop trypsinization ved at tilføje 3-4 mL af cF12 pr. brønd.</li>
		<li>Overføre CHO cellesuspension til en 15 mL tube, og der centrifugeres ved 300-400 x g i 5 min. ved 4 ° C, eller RT. Fjern supernatanten og genopslæmmes i 10 mL af cF12. Tilsættes 5 mL cellesuspension pr. brønd i 6 godt plade. Bruge to brønde til at maksimere udbyttet af de transfected celler.</li>
		<li>Inkuber 6 godt pladerne ved 37 ° C, 5% CO2. Overvåge celledød og vækst af resistente kolonier ved hjælp af et lysmikroskop. Fjerne medier og erstatte det med friske medier indeholdende de passende antibiotika efter 4-5 dage, eller når betydelig celledød er observeret.</li>
		<li>Når de modstandsdygtige celler reach mere end 70% sammenløb, trypsinize celler som beskrevet i trin 1.2.2 og overføres til en T25 kolbe til ekspansion. Den antibiotiske udvalg tager 1-2 uger.</li>
		<li>Når antibiotikaresistente CHO cellerne i T25 kolben nå 70-80% sammenløb, udføre antistoffarvning for at kontrollere celle overflade udtryk for konstruktioner af interesse. Én dag før antistoffarvning, trypsinize celler som beskrevet i trin 1.2.2 og justere den celle koncentration til 200.000 celler/mL og tilsættes 1 mL cellesuspension til 12 godt plade. Test af tetracyclin-inducerbar konstruktioner, tilføje 50-60 ng/mL tetracyclin. Der inkuberes natten over ved 37 ° C, 5% CO2.</li>
		<li>Brug celle skraber til at frigøre CHO celler fra bunden af brønden. Denne metode er at foretrække frem for trypsinization, da det reducerer risikoen for epitop skader forårsaget af proteolytiske kavalergang.</li>
		<li>Der overføres 1 mL af medier indeholdende CHO celler til et FACS rør. Spin ned på 300-400 x g, 4 ºC i 5 min. genopslæmmes i 100 μl anti-HLA antistof fortyndet i FWB. Inkubér 30 min. ved 4 ° C på is. Udføre denne farvning med anti-A2 antistof til at opdage samlede A2 celle overflade udtryk niveauer og TCR-lignende antistoffer specifikke for A2 i kompleks med E183 peptid at opdage agonist pMHC-jeg cellens overflade udtryk niveauer.</li>
		<li>Efter kontrol MHC udtryk, FACS-form de positive celler, og opretholde de sorterede celler i medier med antibiotika for at mindske transgen tab. For CHO celler udtrykker agonist pMHC, anbefales enkelt celle sortering, at sikre sammenlignelige agonist pMHC udtryk med og uden supertransfection med co agonist pMHC. 2-3 uger er nødvendige for CHO cellevækst efter enkelt celle sortering.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. HBV-specifikke CTL kultur
<ol><li>
Forberedelse af PBMC som foderautomater for HBV-specifikke humane Tillidsliste re stimulation Bemærk: For A2-E183-specifikke CTL klon, re stimulation med frisk isolerede PBMC i stedet optøede PBMC, giver de bedste resultater. Forsigtighed: Få alle de nødvendige etiske godkendelser før rekruttere frivillige til afgivelse af blod. Med henblik på dette arbejde, PBMC blev indsamlet fra sunde frivillige under protokollen godkendt af NUS IRB. Informeret samtykke blev opnået fra alle donorer. Følg alle de nødvendige forholdsregler når man arbejder med humant blod til at reducere risikoen for overførsel af blod bårne sygdomme.<ol>
<li>Før du starter, sat centrifuge temperatur på 19-20 ° C og pre varm tæthed farveforløb (f.eks. Ficoll) til RT.</li>
		<li>Tilsættes 15 mL stuetemperatur tæthed farveforløb til 50 mL tube. Der centrifugeres ved 400 x g i 5 min på 19-20 ° C. Dette er at sikre, at der ingen tæthed farveforløb på siden af røret.</li>
		<li>Indsamle 20 mL blod fra en sund frivillige donor gennem venepunktur. Tilsættes 15 mL PBS 20 mL blod i en 50 mL tube. Mix af pipettering op og ned.</li>
		<li>Tilsættes langsomt, 35 mL blod fortyndes i PBS oven i tæthed farveforløb fra trin 2.1.2 15 mL. Sørg for, at blodet og tæthed farveforløb ikke blandes. Der centrifugeres rør på 19 ° C, 1200 x g i 20 min. med bremserne ud.</li>
		<li>Fjerne ca 70% af plasma lag. Omhyggeligt Aspirér laget med PBMC (det overskyede lag oven på den klare tæthed gradient layer) benytter en Pasteur afpipetteres og placere det i en ny 50 mL tube.</li>
		<li>Tilføje PBS til PBMC at opnå en 50 mL samlede volumen. Der centrifugeres rør ved 4 ° C, 300-400 x g i 10 min. Fjern forsigtigt supernatanten ved hjælp af vakuum indsugningsventil og sterilt glas Pasteur pipette, eller ved dekantering.</li>
		<li>Genopslæmmes celler i 50 mL PBS. Der centrifugeres rør ved 4 ° C, 300 x g i 10 min. Fjern forsigtigt supernatanten ved hjælp af vakuum indsugningsventil og sterilt glas Pasteur pipette, eller ved dekantering.</li>
		<li>Genopslæmmes celler i 2 mL af komplet human T-celle medier (serum frie medier suppleret med 2% human serum). Tælle celler ved hjælp af hemocytometer. Denne protokol giver i gennemsnit 1-2 x 106 PBMC pr. 1 mL blod anvendes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
CTL re stimulation ved hjælp af PBMC som feeder celler
	<ol>
<li>Bestråle PBMC på 30 Gy til at hæmme spredningen i svar til efterfølgende stimulation. Forsigtig: Sikre tilstrækkelige uddannelsen og overholdelse af laboratoriet sikkerhedskrav ved brug af irradiator.</li>
		<li>Re suspendere de bestrålede PBMC i komplet human T-celle medier på 2 x 106 celler/mL. Tilføje cytokiner og lektin fra Phaseolus vulgaris (PHA) for CTL re stimulation på 2 x koncentration i PBMC suspension. Den endelige cytokin og PHA koncentrationer er: 20 U/mL rekombinant humant IL-2, 10 ng/mL rekombinant IL-7, 10 ng/mL rekombinant humant IL-15 og 1,5 mg/mL PHA.</li>
		<li>Optø frosne CTL hætteglasset i et 37 ° C vandbad. Overføre de optøede celler ind i en 15 mL rør med 10 mL af komplet human T-celle medier. Spin ned på 300-400 x g ved 4 ° C for 5 min. Fjern forsigtigt supernatanten ved hjælp af vakuum indsugningsventil og sterilt glas Pasteur pipette, eller ved dekantering.</li>
		<li>Genopslæmmes CTLs i 2 mL af komplet human T-celle medier. Tælle celler ved hjælp af hemocytometer. Tilføje komplet human T-celle medier for at opnå celle koncentration af 106 celler/mL.</li>
		<li>I en 24 godt plade, tilsættes 0,5 mL af bestrålede PBMC (106 celler) med 2 x cytokines og PHA (trin 2.2.2) og 0,5 mL af CTLs (0,5 x 106 celler) pr. brønd. Antallet af brønde anvendes afhænger af det samlede antal CTLs eller PBMC tilgængelige. Der inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2.</li>
		<li>Efter 4-5 dage, når CTL Blaster er synlige og medierne bliver gul, overføres kulturerne til 6 godt plader, og supplere den oprindelige 1 mL volumen med 4 mL af komplet human T-celle medier med 20 U/mL IL-2, 10 ng/mL IL-7 og 10 ng/mL IL-15 (ingen PHA).</li>
		<li>Efter 2-3 dage, overføres kulturerne til en T75 målekolbe, der tilsættes 40 mL komplet human T-celle medier med cytokiner (trin 2.2.2, ingen PHA) og kultur i en oprejst position.</li>
		<li>Opretholde CTLs ved en koncentration på 1-2 x 106 celler/mL ved at tilføje friske medier suppleret med cytokiner (trin 2.2.2, ingen PHA) på et volumen svarende til den eksisterende kultur volumen på hver anden dag. Tillidslister kan bruges til forsøg 7-14 dage efter fornyet stimulation.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. T-celle aktivering eksperimenter
Bemærk: En typisk eksperiment kræver flere forskellige T-RExCHO linjer: untransfected T-REx CHO celler (negativ kontrol), T-REx CHO celler udtrykker ikke-stimulerende pMHC kun (scA2-GAG; negativ kontrol), T-REx CHO celler udtrykker lavt beløb af agonist pMHC-jeg () scA2-ENV uden tetracyklin, eksperimentel prøve), T-REx CHO celler udtrykker lavt beløb af agonist pMHC og store mængder af ikke-stimulerende Co agonist pMHC (scA2-ENV og scA2-GAG, uden tetracyklin, eksperimentel prøve), og T-REx CHO celler udtryk for store mængder af agonist pMHC-jeg scA2-ENV med tetracyclin, positiv kontrol), som vist på figur 1 cD.
<ol><li>
Plating CHO celler som antigen præsentere celler
	<ol>
<li>Kultur CHO celler i T75 kolbe, som beskrevet i trin 1.1.1. Bruge celler på 70-90% confluence for de bedste resultater. En dag før T-celle aktivering eksperiment, trypsinize celler som beskrevet i afsnit 1.1.2. Efter trypsinization, overføre cellesuspension i en 15 mL tube, centrifugeres ved 400 x g i 5 min. ved 4 ° C eller RT, Fjern supernatanten ved pipettering eller dekantering.</li>
		<li>Genopslæmmes celle pellet i 5 mL af cF12. Tælle CHO celler ved hjælp af en hemocytometer.</li>
		<li>Justere celle koncentration til 2 x 105/mL ved hjælp af cF12. Tilføje 50-60 ng/mL tetracyclin til agonist kun prøver for at fremkalde høje mængder af agonist pMHC-jeg udtryk som positiv kontrol (figur 1 c). CHO celler vil slå sig ned i 15 mL rør, så sørg for at blande dem af pipettering eller vortexing før plating.</li>
		<li>For T-celle aktivering assay, Tilsæt 100 μL af CHO cellesuspension pr. brønd til U-bunden 96 godt plade, og bruger tre pr. CHO cellelinie. CHO celle anti-MHC farvning, tilsættes 1 mL cellesuspension til 12 godt plade, og bruge tre pr. cellelinje. Der inkuberes natten over ved 37 ° C, 5% CO2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
T-celle aktivering assay Bemærk: denne T-celle aktivering assay tillader simultan kvantificering af T celle degranulering (CD107a farvning, en foranstaltning af T celle cytotoksicitet) og cytokin produktion.<ol>
<li>Dagen før eksperimentet, centrifugeres CTLs celler på 400 x g ved 4 ° C i 5 min, tælle, ved hjælp af hemocytometer og genopslæmmes celler på 106 celler/mL i komplet human T-celle medier uden cytokiner eller PHA. Der inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2. Formålet med denne resten trin er at reducere CTL følsomhed, som vi har observeret maksimal aktivering som reaktion på lavt beløb af antigen uden dette trin.</li>
		<li>På dagen af forsøget, centrifuge T celler på 400 x g ved 4 ° C i 5 min, Fjern supernatanten ved dekantering eller pipettering og genopslæmmes celler i 2 mL komplet serum-gratis medier (uden cytokiner eller PHA). Tælle live T celler ved hjælp af en hemocytometer, og justere T-celle koncentration til 106 levende celler/mL ved hjælp af komplet human T-celle medier (uden cytokiner eller PHA).</li>
		<li>Tilføje-anti-humant CD107a antistof ved 1: 100 (endelig koncentration af 2,5 μg/mL), tilføje brefeldin A ved 1:1000 (endelig koncentration på 1 μg/mL).</li>
		<li>Fjerne medier fra CHO celler i 96 godt pladen ved sugning med glas Pasteur pipette eller ved at bladre til pladen. Pr. brønd, tilføje 200 μl af T celle suspension (0,2 x 106 celler) indeholdende anti-CD107a og brefeldin A. co kultur T celler med CHO celler i 3-4 timer.</li>
		<li>I slutningen af fælles kultur, udføre T-celle overflade antigen farvning. Spin ned 96 godt plade på 300-400 x g, 5 min. ved 4 ° C, og Fjern supernatanten ved sugning eller svippede. Tilføje 2,5 μL af CD3 og 2,5 μL af antistoffer, CD8 i 50 μL af 0,5% BSA i PBS (flow vaskebuffer, FWB) pr. brønd for celle overflade antigen farvning. Inkuber prøver på is i 30 min. i mørke.</li>
		<li>Vask prøver ved at tilføje 150 μl af FWB pr. brønd. Spin ned 96 godt plade på 300-400 x g, 5 min. ved 4 ° C, og Fjern supernatanten ved sugning eller svippede.</li>
		<li>Udfør fiksering/permeabilization trin ved hjælp af en fiksering/permeabilization kit. Tilsæt 100 µL af fiksering/permeabilization løsning (fra fiksering/permeabilization kit) pr. brønd, mix af pipettering. Der inkuberes i isbad i 20 min.</li>
		<li>Der centrifugeres ved 300-400 x g og 4 ° C i 5 min, og Fjern supernatanten ved sugning eller svippede. Tilføje 200 μl 1 x perm/vaskebuffer (fortyndet 10 x perm/vask stock buffer fra kit før brug) pr. brønd. Gentag dette trin.</li>
		<li>Genopslæmmes celle pellet i 50 μL 1 x perm/wash buffer der indeholder anti-IFN-γ antistof på 0,3 μg/mL. Der inkuberes i isbad i 30 min. i mørke.</li>
		<li>Tilføj 150 μL 1 x perm/wash buffer. Der centrifugeres ved 300-400 x g for ved 4 ° C i 5 min, og Fjern supernatanten ved sugning eller svippede. Tilføje 200 μl 1 x perm/wash buffer, centrifugeres 300-400 x g for ved 4 ° C i 5 min, og Fjern supernatanten ved sugning eller svippede.</li>
		<li>Genopslæmmes hver prøve i 200 μl af FWB. Gå videre med analysen af cytometric.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
CHO celle MHC klasse I farvning Bemærk: er det kritisk at kontrollere scMHC-jeg cellens overflade niveauer på celler, der bruges på hvert eksperiment, som cellelinjer kan miste transgen udtryk. Når du forbereder 96 godt plade for T-celle stimulation, angive 12 godt plade for CHO celle farvning, som beskrevet i afsnit 3.1.4.<ol>
<li>Brug en celle skraber til at frigøre CHO celler fra bunden af brønden. Denne metode er at foretrække frem for trypsinization, da det reducerer risikoen for epitop skader forårsaget af proteolytiske kavalergang.</li>
		<li>Der overføres 1 mL af medier indeholdende CHO celler til FACS tube. Spin ned på 300-400 x g ved 4 ° C i 5 min. genopslæmmes i 100 μl anti-HLA antistof fortyndet i FWB. Inkuber i 30 min. ved 4 ° C på is.<ol>
<li>Udføre denne farvning med anti-A2 antistof til at opdage samlede A2 celle overflade udtryk niveauer og TCR-lignende antistoffer specifikke for A2 i kompleks med E183 peptid32 at opdage agonist pMHC-jeg cellens overflade udtryk niveauer.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Der tilsættes 1 mL af FWB til hver prøve, CHO, spin ned på 300-400 x g, 4 ° C, 5 min, og derefter genopslæmmes prøven i 0,3 mL af FWB. Gå videre med analysen af handelsstrømmen flowcytometri.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Forfatterne erklærer ikke konkurrerende interesser.

Præsenteres protokollen giver en robust værktøj til undersøgelse af molekylære interaktioner under menneskelige CD8 + T celle aktivering. Et kritisk trin for undersøgelse af co-agonisme under human T-celle aktivering er kontrol over agonist pMHC celle overflade udtryk at sikre lige agonist pMHC præsentation på PMV'er med eller uden Co agonist pMHC udtryk. I vores eksperimentel system, dette opnås ved hjælp af en enkelt celle klon udtryk for lavt beløb af agonist pMHC, efterfulgt af supertransfection med en co agonist pMHC konstruktion og agonist pMHC kvantificering ved hjælp af TCR-lignende antistof10, 32. som agonist sc pMHC udtryk kan ændre sig over tid, det er afgørende at kvantificere agonist pMHC overflade udtryk på PMV'er anvendes i hvert eksperiment ved hjælp af TCR-lignende antistoffer. Hvis ingen specifikke TCR-lignende antistof er tilgængelige, agonist scMHC-jeg kan udtrykkes som fluorescerende proteiner fusion, og dets celle overflade udtryk kan derefter kvantificeres ved hjælp af en følsom mikroskopi metode, som total interne reflection Fluorescens mikroskopi 35 , 36. Derudover celle overflade udtryk for Co agonist pMHC aftager over tid, på grund af methylering-afhængig og -uafhængig hæmning af CMV promotor37, og bør overvåges ved hjælp af antistof farvning og flow flowcytometri analyse, med gentagne FACS-sortering efter behov. Vi har kulturperler CHO celler op til 5 uger med relativt begrænset tab af sc pMHC udtryk. Vi anbefale varmt frysning CHO celler hurtigt efter valg/sortering til at sikre en pålidelig bestand af celler med kendt sc MHC udtryk.
De flere skridt præsenteret protokoller kan ændres, afhængigt af tilgængeligheden af udstyr eller afhængigt af de specifikke forskning mål. For eksempel PBMC spredning potentielle kan blive hæmmet (trin 3.2.1) ved hjælp af alternative metoder, der ikke kræver en gamma (eller X-) irradiator, såsom behandling med mitomycin C38. En ikke-enzymatiske celle dissociation buffere der indeholder metal chelatorer39 kan bruges i stedet for celle skrabning taktfast 3.3.1. Derudover antigen præsentere systemet kan ændres for at gøre det mere velegnet til kloning af mennesker CTL udtryk for forskellige TCRs. CHO celler udtrykkelige hamster MHC klasse I molekyler, og selv om disse er irrelevant for linjen CTL studerede her (figur 2A og Figur 3A, vi observerede ingen T-celle svar til untransfected CHO celler), der er en mulighed for, at andre menneskers TCRs kan vise nogle xenoreactivity. I at sagen, hamster MHC klasse I udtryk kan reduceres ved at udskære hamster β2-microglubulin eller tryk ved hjælp af CRISPR/Cas9; eller en menneskelig APC linje kan bruges efter CRISPR/Cas9-medieret β2-microglubulin eller TAP banke.
Eksperimentelle systemet præsenteres her tillader præcis styring af TCR og CD8 interaktioner med MHC molekyler præsenterer foruddefinerede peptider. For eksempel, har vi tidligere vist at mutationer afskaffe CD8 bindende40 til coagonist pMHC elimineret coagonist-medieret aktivering ekstraudstyr i murine og menneskelige CD8 + T celler9,10, mens om ophævelse af TCR interaktion med co agonist pMHC havde ingen effekt på coagonist-medieret aktivering enhancement10. Brugen af enkelt kæde MHC konstruktioner har imidlertid flere begrænsninger. For eksempel, det er tid og arbejdskraft-forbrugende at teste flere Co agonist peptid sekvenser ved hjælp af denne eksperimentelle system, da dette indebærer generation af flere plasmider kodning sc MHC med forskellige peptider, og efterfølgende transfections og celle sortering. Tidligere vi brugt murine TAP-mangelfuld cellelinie RMA-S til at teste flere Co agonist peptider i musen T-celle aktivering8,9, men denne tilgang blev ikke gennemført med TAP-mangelfuld menneskelige T2 celle linje10, mest sandsynligt på grund af præsentation af TAP-uafhængig peptider41. En anden begrænsning af vores eksperimentel system er der er ikke giver en hurtig metode til at ændre mængden af co agonist pMHC molekyler ved fastlæggelsen af den kritiske mængde Co agonist pMHC kræves for at udløse T-celle aktivering. Derudover tillader tetracyklin-inducerbar systemet anvendes ikke titrering af agonist pMHC mængde på niveauet enkelt celle ved at ændre tetracyklin koncentration, som varierende tetracyklin koncentration ændrer andelen af HLA-A2 positive celler, stedet for HLA-A2 niveauer på pr. celle grundlag. En alternativ tilgang, som vi undersøger i øjeblikket er at bruge understøttede lipid dobbeltlag42, tidligere brugt til at undersøge co-agonisme under murine CD4 + T celle aktivering4 eller perler præsenterer fast beløb af agonist pMHC i den tilstedeværelsen af forskellige mængder af co agonist pMHC. Når det bruges sammen med UV-cleavable peptid teknologi4,43, disse alternative eksperimentelle systemer bør give mulighed for hurtig test af flere Co agonist peptid sekvenser samt forskellige mængder af co agonist pMHC .
Sc MHC teknologi kan også være relevant til undersøgelse af co-agonisme i menneskelige eller murine CD4 T celler, som enkelt kæde MHC klasse II molekyler præsenterer forudbestemt peptider med succes har udtrykt på pattedyr celle overflader44. Desuden kan brug af sc MHC teknologi udvides til at omfatte undersøgelse af ikke-klassisk MHC molekyler såsom HLA-E. SC HLA-E har været beskrevet før, og dens udtryk har vist sig at hæmme human T-celle aktivering45. En anden ikke-klassisk MHC molekyle af interesse er CD1, som præsenterer lipider i stedet for peptider46. SC konstruktioner bestående af CD1 tunge kæde og β2-mikroglobulin har vist udtrykkes på celleoverfladen og binde relevante lipid ligander47. Enkelt kæde MHC teknologi har stort potentiale som et forsknings-værktøj for at undersøge molekylære interaktioner under T og NK celle aktivering.

MHC klasse I (MHC-jeg) molekyler præsenterer kort (8-10 aminosyrer) peptider afledt af proteiner syntetiseret af hver celle. MHC-jeg molekyler på raske celler præsentere self peptider afledt af endogene proteiner. Viral infektion fører til præsentation af ikke-selv virus-afledte peptider på MHC-jeg, men selv inficerede celler nuværende ikke-selv peptider ved tilstedeværelse af store mængder af self peptid-MHC (pMHC). MHC-jeg er anerkendt af T-celle receptoren (TCR) og CD8 Co receptor på T-celler. TCR bindende affinitet til peptid pMHC er stærkt afhængige af sekvensen af præsenteres peptider, CD8 bindende er peptid-uafhængig. TCR binding til ikke-selv agonist pMHC komplekse fører til T-celle aktivering og effektor funktion. Ikke-stimulerende self pMHC komplekser Fremkald ikke T-celle aktivering og effektor funktion, men kan forbedre T-celle svar til agonist pMHC, gennem en proces, der kaldes co-agonisme1,2,3. Co-agonisme er blevet observeret i mus CD4 + T celler4,5,6 samt mus og menneskelige CD8 + T celler7,8,9,10, 11 , 12 , 13. under fysiologiske tilstande, T-celler skal genkende begrænsede mængder af agonist pMHC på antigen præsentere celler (PMV'er) Co præsenterer høje niveauer af ikke-stimulerende pMHC komplekser, tyder på, at co-agonisme bidrager til optimal T celle svar in vivo. Cellen Total overflade MHC klasse jeg niveauer er ofte downregulated under virusinfektioner14 og på tumorer15. Denne immun unddragelse strategi falder agonist pMHC præsentation, men også reducerer mængden af co agonist pMHC jeg tilgængelig for T-celle aktivering ekstraudstyr. Desuden klasse høj celle overflade udtryk niveauer af MHC I molekyle HLA-C har vist sig at korrelere med forbedret HIV kontrol16, hvilket tyder på en afgørende rolle for samlede MHC klasse udtryk i T-celle aktivering. Trods den fysiologiske betydning af co-agonisme, er dens molekylære mekanisme stadig utilstrækkeligt forstået. Dette skyldes hovedsageligt tekniske udfordringer for eksperimentelt kontrollere mængden af præsenteres Co agonist pMHC samtidig holde agonist pMHC konstant.
Vi udviklede en eksperimentel system at undersøge co-agonisme under menneskelige CD8 + T celle aktivering af udtrykker humane MHC klasse I molekyler præsenterer forudbestemte peptid som enkelt polypeptid (enkelt kæde MHC-I, figur 1A) i en xenogene celler linje9,10. Enkelt kæde (sc) agonist pMHC blev udtrykt under kontrol af tetracyclin-inducerbar promotor i den hamster-afledte T-REx CHO cellelinie, udtrykker tetracyklin repressor; Dette giver mulighed for meget lave "utætte" udtryk for sc agonist pMHC i mangel af tetracyklin og høj sc agonist pMHC udtryk efter tilsætning af tetracyklin (figur 1BC). Sc agonist at udtrykke pMHC T-REx CHO celler blev derefter supertransfected med ikke-stimulerende, co agonist sc pMHC-jeg under kontrol af en constitutively aktiv promotor (figur 1BC). Brug af denne eksperimentelle systemet tillod os at sammenligne CD8 + T-celle svar til agonist pMHC i tilstedeværelse eller fravær af høje niveauer af ikke-stimulerende pMHC. Kritisk, da peptid og MHC-jeg tunge kæde er kovalent knyttet i scMHC-jeg format, dette giver introduktioner af mutationer i MHC molekyler præsenterer forudbestemte peptider. Brug af scMHC-jeg teknologi således tilladt os at specifikt modulere TCR eller CD8-bindende egenskaber af agonist eller co agonist pMHC.
Co-agonisme i CD8 + T celle aktivering er blevet observeret ved hjælp af renset MHC-jeg komplekser præsenterer agonist og co agonist peptider i form af heterodimers11,17 eller præsenteres på quantum dots12,13. Tidligt arbejde på co-agonisme i CD8 + T celle aktivering inden for rammerne af agonist pMHC anerkendelse på APC brugt TAP2-mangelfuld cellelinjer som pansrede mandskabsvogne. HANEN er nødvendig for peptid transport fra cytoplasmaet til det endoplasmatiske reticulum, og HANEN-vitaminmangel reducerer stærkt puljen af tilgængelige MHC klasse-bindende peptider. I mangel af peptider, den spirende kompleks af MHC klasse I tunge kæde og β2- mikroglobulin er ustabilt, hvilket resulterer i meget lav MHC-jeg cellens overflade udtryk. I første omgang, afslørede sammenligning af T-celler stimuleret med antigen indlæst på TAP-tilstrækkelig - og mangelfuld mus RMA og RMA-S cellelinjer, henholdsvis som pansrede mandskabsvogne, ikke nogen beviser for co-agonisme under musen T-celle aktivering18. Men brugen af dette eksperimentelle system ikke tillod præcis kontrol over mængden af agonist pMHC præsenteret uafhængigt af ikke-stimulerende self pMHC. Desuden, disse to cellelinjer kan også variere i udtryk for andre molekyler, der modulerer T-celle aktivering, såsom ligander til T-celle co-stimulatory eller hæmmende receptorer eller adhæsionsmolekyler.
Efterfølgende, udviklede vi en protokol til indlæsning af TAP2-mangelfuld RMA-S celler med eksogene peptider til præsentation af et fast beløb af agonist pMHC i tilstedeværelse eller fravær af ikke-stimulerende pMHC. Dette blev opnået gennem følgende: inkubation af TAP2-mangelfuld RMA-S cellerne ved lavere temperaturer (28 ° C, i stedet for de sædvanlige 37 ° C) for at stabilisere Tom MHC klasse i tunge kæde/β2 mikroglobulin komplekser19; inkubation ved 28 ° C med eksogene agonist peptid; inkubation ved 28 ° C i tilstedeværelse eller fravær af eksogene ikke-stimulerende peptid; og inkubation ved 37 ° C at reducere celle overflade udtryk for tomme MHC klasse I komplekser8,9. Brug af dette eksperimentelle set-up afslørede, at tilstedeværelsen af ikke-stimulerende pMHC forøget aktivering af musen thymocytter, naive perifere CD8 + T celler og CTLs8. Mekanisk, tilstedeværelsen af ikke-stimulerende pMHC kan fremkalde CD8 rekruttering til T celle: APC immun synapse selv i mangel af agonist pMHC, og ikke-stimulerende pMHC kan forbedre TCR interaktion med CD8 coreceptor7,8. Men denne eksperimentelle system ikke tillader test TCR og CD8 coreceptor binding til agonist og co agonist pMHC relative bidrag i mediating ekstraudstyr aktivering som ændringer at ændre TCR eller CD8 binding til MHC klasse ville jeg påvirke alle MHC molekyler, uanset den præsenteres peptid. Derfor brugte vi MHC klasse jeg enkelt kæde teknologi for at overvinde dette problem.
Enkelt kæde (sc) MHC klasse jeg format har været brugt før at forbedre antigene pMHC præsentation for terapeutiske strategier, og at besvare grundlæggende spørgsmål om mekanismer af TCR og NK celle receptor aktivering og fungere20,21 . scMHC-jeg består af peptid, β2- mikroglobulin og MHC-jeg tunge kæde følgeskab af to fleksible Serin/glycin-rige linkers (figur 1A), flere forskellige linker sekvenser er blevet udviklet og testet22. scMHC-jeg kan folde uafhængigt af HANEN komplekse og ledsage proteiner kræves til konventionelle pMHC komplekse forsamling20. scMHC-jeg har vist sig at folde korrekt, som bestemmes ved hjælp af kropsbygning-specifikke antistof farvning22 og ved at løse sc struktur med røntgenkrystallografi23. De grundlæggende scMHC-jeg design er blevet ændret for at forbedre bindingen af lav affinitet peptider24,25.
Denne protokol beskriver brugen af menneskelige scMHC-jeg at undersøge co-agonisme under humane Tillidsliste klon aktivering. Protokollen er blevet optimeret til humane Tillidsliste klon specifikke for en epitop af Hepatitis B virus (HBV). HBV er en svær healthcare byrde på verdensplan, som der er 350 millioner mennesker smittet med HBV og kronisk HBV infektion kan føre til udvikling af hepatocellulært carcinom (HCC). HCC celler som følge af HBV infektion kan normalt præsentere HBV-afledte epitoper og kan genkendes på specifikke humane T celler. HBV og HCC clearance er afhængig af human T-celle svar26, men HCC patienter lider ofte af T celle udmattelse og nedsat T celle svar27. Indførelsen af HBV-specifikke TCR i T-celler af HBV har været forsøgt som potentielle immunterapi strategi at fjerne kroniske HBV infektion28. Men det er uvist, om denne metode vil være effektiv i en klinisk indstilling, på grund af de lave niveauer af overflade MHC-I humane hepatocytter29. Derfor kan forstå mekanisme af coagonism give alternative perspektiver for immunterapi af HBV, eventuelt ved at forbedre præsentationen af endogene pMHC til at fremkalde co-agonisme-medieret T celle svar. Protokollen omfatter alle de nødvendige skridt til forskning på menneskelige co-agonisme: Transfektion af T-REx CHO celler med agonist og co agonist sc pMHC, generation af stabil T-REx CHO cellelinjer, kultur af HBV-specifikke humane Tillidsliste CD8 + T cellelinje og CTL aktivering forsøg kvantificering cytokin produktion og degranulering svar på T-REx CHO celler. Selvom vi fokuserer på ved hjælp af sc MHC klasse i-teknologi til at undersøge co-agonisme under HBV T celle aktivering, skal det bemærkes, at de præsenterede metoder kan nemt tilpasses til forskning på andre aspekter af T-celle aktivering i human T-celle systemer med kendt pMHC-jeg specificitet.
Denne protokol bruger en menneskelige CD8 + CTL linje specifikke for HBV-afledte peptid E183-91 (FLLTRILTI: "E183")30 præsenteret på HLA-A2. SC HLA molekyler bestående af et signal sekvensen fra menneskelige β2-mikroglobulin, et HLA-A2 bindende peptid af interesse, en glycin/Serin linker, en menneskelig β2-mikroglobulin, et glycin/Serin linker og en A2 tunge kæde kan være kommercielt syntetiseret (figur 1A ). Plasmider kodning scA2 konstruktioner med agonist E183 peptid eller coagonist HIV GAG (SLYNTVATL)31 peptider er ledige fra forfattere efter anmodning. Peptid rækkefølge kan ændres ved hjælp af webstedet instrueret-mutagenese. Tetracyclin-inducerbar vektor blev pcDNA5/at brugt til at udtrykke agonist enkelt kæde HLA-A2 med E183 peptid (sc E183-HLA-A2). I nærværelse af tetracyklin repressor, pcDNA5/at plasmid tillader kun meget lav, "utætte" udtryk for protein af interesse; høj udtryk kan være fremkaldt ved tilsætning af tetracyklin (figur 1BC). Brug af en tetracyklin-inducerbar ekspressionssystem giver kontrol over mængden af celle overflade agonist pMHC udtryk. En konstitutiv udtryk plasmidet pcDNA3.1 blev brugt til at udtrykke coagonist scA2 med GAG peptid (sc GAG-HLA-A2). Tetracyclin-regulerede udtryk (T-REx) CHO cellelinje (hamster cellelinie, ingen endogene humane MHC) blev brugt til at udtrykke agonist og co agonist sc-HLA-A2 konstruktioner. Denne eksperimentelle system giver præcis kontrol over pMHC præsentation (figur 1 c): ingen pMHC præsentation (untransfected T-REx), en stor mængde af co agonist pMHC præsentation (konstitutiv sc GAG-HLA-A2 udtryk), et lavt beløb af agonist pMHC præsentation (sc E183-HLA-A2 i mangel af tetracyklin), en stor mængde af agonist pMHC præsentation (sc E183-HLA-A2 i overværelse af tetracyklin), et lavt beløb af agonist pMHC præsentation og høj udtryk for Co agonist pMHC (sc E183-HLA-A2 i den fravær af tetracyklin og konstituerende sc GAG-HLA-A2 udtryk). Brug af denne eksperimentelle system giver præcis kontrol over celle overflade mængder af agonist og coagonist pMHC.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aim-V (serum free media)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12055091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blasticidin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm (fixation/permealibisation kit)</td>
			<td>BD</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH3007103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>geneticin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10131035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GolgiPlug (Brefeldin A)</td>
			<td>BD</td>
			<td>555029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hygromycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10687010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (low serum media)</td>
			<td>Bibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 X PBS</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>PB0344 &#8211; 1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>408727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant human IL2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>202-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant human IL7</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>207-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant human IL15</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>247-ILB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetracycline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-REx CHO cell line</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R71807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 x Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BD</td>
			<td>347347</td>
			<td>Clone SK7, RRID:AB_400287</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8&#945;</td>
			<td>BD</td>
			<td>563795</td>
			<td>Clone RPA-T8, RRID:AB_2722501</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD107a</td>
			<td>BD</td>
			<td>566261</td>
			<td>Clone H4A3, RRID:AB_2739639</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-A2</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-9876-41</td>
			<td>Clone BB7.2, RRID:AB_11151522</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-&#947;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-7319-41</td>
			<td>Clone 4S.B3, RRID:AB_1311250</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of single chain mhc technology to investigate co-agonism in human cd8+ t cell activation

Ikke-stimulerende self peptid MHC (pMHC) komplekser Fremkald ikke T-celle aktivering og effektor funktion, men kan forbedre T-celle svar til agonist pMHC, gennem en proces, der kaldes co-agonisme. Denne protokol beskriver en eksperimentel system at undersøge co-agonisme under menneskelige CD8 + T celle aktivering af udtrykker humane MHC klasse I molekyler præsenterer forudbestemte peptider som enkelt polypeptider (enkelt kæde MHC) i en xenogene cellelinie. Vi udtrykt enkelt kæde MHCs betingelser hvor lave niveauer af agonist enkelt kæde p-MHC komplekser og høje niveauer af ikke-stimulerende enkelt kæde p-MHC komplekser blev udtrykt. Brug af denne eksperimentelle systemet tillod os at sammenligne CD8 + T-celle svar til agonist pMHC i tilstedeværelse eller fravær af ikke-stimulerende pMHC. Protokollen beskriver celle linje Transfektion med enkelt kæde MHC konstruktioner, generation af stabil celle linjer, kultur af hepatitis B virus-specifikke menneskelige CD8 + T-celler og T-celle aktivering eksperimenter samtidig kvantificere cytokin produktion og degranulering. De præsenterede metoder kan bruges til forskning om forskellige aspekter af CD8 + T-celle aktivering i human T-celle systemer med kendt peptid MHC specificitet.

Sc MHC klasse I teknologi, der anvendes her giver præcis kontrol over celle overflade udtryk af MHC klasse I med kendte, kovalent sammenkædede peptider, at inducere T-celle aktivering. Vi har genereret et manipuleret xenogene APC system (figur 1A, B, C) præsentation af lave niveauer af agonist pMHC i tilstedeværelse eller fravær af co agonist pMHC (figur 1 d, E). Kritisk, har vi brugt en TCR-lignende antistoffer specifikke for HLA-A2 præsenterer E183 peptid for at vise denne præsentation af agonist sc E183-HLA-A2 ikke er ændret ved fælles udtryk for Co agonist sc GAG-HLA-A2 (figur 1E). Det skal dog bemærkes, at E183-HLA-A2 specifikke TCR-lignende antistof viser nogle binde sig til HLA-A2 præsenterer GAG peptid (figur 1E). Lignende manipuleret antigen præsentere celler systemer kan konstrueres ved hjælp af forskellige peptider eller MHC molekyler for at undersøge molekylære krav for TCR og/eller coreceptor interaktioner i humane T celler med forskellige særegenheder.
Vi brugte disse manipuleret PMV'er for at stimulere en E183-HLA-A2-specifikke menneskelige CD8 + T-celle klon. Tre negative kontroller blev brugt: T celler kun, untransfected T-REx CHO celler og T-REx CHO celler, der udtrykker høje mængder af co agonist sc GAG-HLA-A2 til at teste for potentielle T celle aktivering af enhver molekyler udtrykt på T-REx CHO celler (untransfected T-REx CHO celler i forhold til T celle kun), og T-celle aktivering af sc-GAG-HLA-A2 (T-REx CHO celler, der udtrykker høje niveauer af sc-GAG-HLA-A2 sammenlignet med untransfected T-REx CHO celler). Untransfected T-REx CHO celler eller T-REx CHO celler udtrykker sc-GAG-HLA-A2 ikke fremkalde aktivering af E183-HLA-A2-specifikke CD8 + CTL klon, som bestemmes af kvantificere IFN-γ produktion og udtryk for degranulering markør CD107a som et mål for T-celle cytotoksicitet (figur 2AB). Udtryk for høje niveauer af agonist sc E183-HLA-A2, anvendt som positiv kontrol, induceret meget effektiv IFN-γ produktion og degranulering (figur 2AB), viser, at sc HLA-A2 konstruktion kan genkendes af en specifik TCR at aktivere T-celle effektor funktion. Udtryk for lave niveauer af sc E183-HLA-A2 induceret lavere niveauer af IFN-γ produktion og degranulering, og dette blev forstærket af tilstedeværelsen af co agonist sc GAG-HLA-A2 (figur 2AB). Det skal bemærkes, at meget høje procenter af CD107a + T-celler blev observeret selv som reaktion på lave niveauer af antigene pMHC (figur 2B), i overensstemmelse med tidligere rapporter om relativt lave krav for den agonist pMHC for induktion af T-celle cytotoksicitet33. CD107a MFI, der angiver mængden af degranulering på en enkelt celle grundlag, giver en bedre dynamikområde (figur 2B). T-celle aktivering analysen anvendes tillader simultan kvantificering af to store effektor funktion: cytokin produktion og cytotoksicitet, og giver meget følsomme udlæsning med god dynamikområde.
Vi brugte enkelt kæde-teknologi til at teste om TCR binding til co agonist pMHC er nødvendig for Co agonist pMHC-afhængige aktivering ekstraudstyr. Vi er muteret valin på position 152 på kanten af HLA-A2 peptid bindende groove (figur 3B) til glutaminsyre til at oprette V152E mutant, som denne mutation er blevet rapporteret at afskaffe TCR binding til HLA-A234. Vi testede derefter hvis V152E mutation kan afskaffe TCR bindende for E183-HLA-A2 CTL klon bruges, ved at indføre denne mutation i agonist sc E183-HLA-A2 og udtrykker mutant agonist sc konstruktion i T-REx CHO celler. Vildtype, men ikke V152E, sc E183-HLA-A2 induceret aktivering af E183-HLA-A2-specifikke CTL klon anvendes (figur 3A). Det skal bemærkes, at enhver TCR-bindende mutation på MHC klasse jeg skal testes separat for hver enkelt TCR/T celle klon anvendes, da effekten af mutation vil afhænge af de præcise molekylære interaktioner mellem TCR og pMHC komplekse, og disse vil variere mellem forskellige TCRs. For eksempel, vi har testet otte mutationer, enten tidligere rapporteret TCR-bindende mutationer eller mutationer forudsagt for at forstyrre TCR bindende uden om ophævelse af peptid bindende i HLA-A2. Af disse var V152E, den eneste mutation, der afskaffede aktivering af E183-specifikke T-celle klon bruges10. Vi derefter indført V152E mutation i co agonist sc GAG-HLA-A2, og co udtrykt WT eller V152E sc GAG-HLA-A2 med lave niveauer af agonist sc E183-HLA-A2. Både WT og V152E sc GAG-HLA-A2 forbedret IFN-γ produktion og degranulering (figur 3 cD), hvilket tyder på at TCR binding til co agonist pMHC ikke er påkrævet for Co agonist pMHC-afhængige CD8 + T celle aktivering ekstraudstyr. Enkelt kæde MHC klasse I teknologi, som præsenteres her, kan bruges til at ændre TCR og/eller coreceptor binder til MHC klasse jeg med kendte peptid for at undersøge de molekylære krav for T-celle antigen anerkendelse og aktivering.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59126/59126fig1.jpg"> Figur 1: enkelt kæde HLA-A2 konstruktioner brugt til at undersøge Co agonist i menneskelige CD8 + T celle aktivering. (A) skematisk diagram af en scHLA-A2 konstruktion, bestående af kovalent signal sekvensen fra sammenvoksede menneskelige β2 mikroglobulin, peptid valg, fleksibel glycin-Serin linker (GGGGSGGGGS GGGGS), menneskelige β2 mikroglobulin, fleksibel glycin-Serin linker og HLA-A2 tunge kæde. (B) skematisk diagram over de plasmider, bruges til at generere manipuleret antigen præsentere celler for at undersøge co-agonisme i menneskelige CD8 + T celle aktivering: tetracyklin repressor, agonist sc E183-HLA-A2 under kontrol af tetracyclin-inducerbar promotor, ikke-stimulerende Co agonist sc GAG-HLA-A2 under kontrol af constitutively aktive promotor. (C) skematisk diagram over den manipuleret antigen præsentere celler, der bruges til at undersøge co-agonisme: T-REx CHO celler (ingen humane MHC udtryk), T-REx CHO celler udtrykker constitutively høje niveauer af sc GAG-HLA-A2 (ikke-stimulerende Co agonist pMHC), T-REx CHO celler udtrykker lav "utætte" niveauer af sc E183-HLA-A2 i mangel af tetracyklin (lavt niveau af agonist peptid), celler T-REx CHO celler, der udtrykker høje niveauer af sc E183-HLA-A2 i overværelse af tetracyklin (højt niveau af agonist peptid), T-REx CHO udtryk for lave niveauer af sc E183-HLA-A2 og høje niveauer af sc GAG-HLA-A2 (lavt niveau af agonist peptid) og høj Co agonist peptid. (D) celle overflade farvning af de manipuleret antigen præsentere cellelinjer ved hjælp af anti-HLA-A2 antistof. Numrene betegne MFI værdier for MHC plet i den levende celle gate. Data repræsentative af 5 uafhængige eksperimenter (E) celle overflade farvning af de manipuleret antigen præsentere cellelinjer ved hjælp af TCR-lignende antistof specifikke mod HLA-A2 præsenterer E183 peptid. Numrene betegne MFI værdier for MHC plet i den levende celle gate. Data repræsentative 5 uafhængige forsøg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59126/59126fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59126/59126fig2v3.jpg"> Figur 2: tilstedeværelse af co agonist pMHC forbedret cytokin produktion og degranulering af E183-HLA-A2-specifikke menneskelige CD8 + CTL klon. (A) intracellulære IFN-γ farvning af HLA-A2-specifikke menneskelige CD8 + CTL klon efter 3 h stimulation med den angivne manipuleret antigen præsentere celler. Numrene angiver procentdel positivt for IFN-γ farvning. Data repræsentative 3 uafhængige eksperimenter, hver udført med tekniske tre. (B) celle overflade CD107a farvning af HLA-A2-specifikke menneskelige CD8 + CTL klon efter 3 h stimulation med den angivne manipuleret antigen præsentere celler. Numrene betegne procent positiv for CD107a farvning eller CD107a MFI for CD8 + T celle befolkning. Data repræsentative 3 uafhængige eksperimenter, hver udført med tekniske tre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59126/59126fig2v3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59126/59126fig3.jpg"> Figur 3: Co agonist-medieret T-celle aktivering enhancement kræver ikke TCR binding til co agonist pMHC komplekse. (A) V152E mutation i FM E183-HLA-A2 afskaffer aktivering af E183-HLA-A2-specifikke menneskelige CD8 + CTL klon. T-REx CHO celler, der udtrykker høje niveauer (tetracyklin induktion) af WT eller V152E mutant sc E183-HLA-A2 blev brugt til at stimulere E183-HLA-A2-specifikke menneskelige CD8 + CTL klon til 3h. T-celle aktivering var kvantificeres ved hjælp af intracellulære IFN-γ farvning. Numrene angiver procentdel positivt for IFN-γ farvning. Data repræsentative 3 uafhængige eksperimenter, hver udført med tekniske tre. (B) placering af V152E mutation inden for peptid bindende groove af HLA-A2. (C) V152E mutation på sc GAG-HLA-A2 Co agonist pMHC komplekse ikke afskaffe agonist-afhængige aktivering ekstraudstyr. Intracellulære IFN-γ farvning af HLA-A2-specifikke menneskelige CD8 + CTL klon efter 4h stimulation med den angivne manipuleret antigen præsentere celler. Numrene angiver procentdel positivt for IFN-γ farvning. Data repræsentative 3 uafhængige eksperimenter, hver udført med tekniske tre. (D) V152E mutation på sc GAG-HLA-A2 Co agonist pMHC komplekse ikke afskaffe agonist-afhængige aktivering ekstraudstyr. Cellens overflade CD107a farvning af HLA-A2-specifikke menneskelige CD8 + CTL klon, efter 3h stimulation med den angivne manipuleret antigen præsentere celler. Numrene betegne procent positiv for CD107a farvning eller CD107a MFI for CD8 + T celle befolkning. Data repræsentative 3 uafhængige eksperimenter, hver udført med tekniske tre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59126/59126fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Use of Single Chain MHC Technology to Investigate Co-agonism in Human CD8+ T Cell Activation at JoVE.com

Use of Single Chain MHC Technology to Investigate Co-agonism in Human CD8+ T Cell Activation

Brug af enkelt kæde MHC teknologi at undersøge Co-agonisme i menneskelige CD8 + T-celle aktivering

Denne protokol beskriver brugen af enkelt kæde MHC klasse I komplekser til at undersøge molekylære interaktioner i menneskelige CD8 + T celle aktivering: generation af manipuleret antigen præsentere celler, der udtrykker enkelt kæde konstruktioner, kultur menneskelige CD8 + T celle klon og T-celle aktivering eksperimenter.

Non-stimulatory self peptide MHC (pMHC) complexes do not induce T cell activation and effector functions, but can enhance T cell responses to agonist ...

Nonstimulatoriske peptid MHC komplekser ikke aktivere T-celler, men kan forbedre T-celle reaktioner på agonist peptid MHC. Denne protokol beskriver et eksperimentelt system til at undersøge co-agonisme under menneskelig CD8 T-celle aktivering. Vi udtrykker MHC molekyler som enkeltkædede komplekser med kovalent forbundet tung kæde, beta-2-mikroglobulin, og peptid.Dette gør det muligt at indføre mutationer i MHC molekyler præsenterer forudbestemte peptider. Denne protokol bruger human CTN klon, en specifik for en epitop af hepatitis B-virus. Forståelse af mekanismen for co-agonisme under T-celle reaktioner mod hepatitis kan bidrage til udviklingen af immunotropica mod denne virusinfektion.De præsenterede metoder kan anvendes i forskning og andre grundlæggende aspekter af T-celle aktivering i menneskelige T-celle systemer med kendt peptid MHC specificitet. Denne protokol bruger single-kæde menneskelige MHC klasse I molekyler, der består af signal sekvens, peptid af interesse, linker, human beta-2-mikroglobulin linker, og MHC tunge kæde. E1A3 peptid fra hepatitis B anvendes som agonist peptid.Gag fra HIV anvendes som nonstimulatorisk peptid. De enkædede humane MHC-molekyler udtrykkes i en hamstercellelinje, der indeholder tetracyklinrepressor. Agonist single-chain MHC udtrykkes ved hjælp af tetracyclin-inducerende plasmid, hvilket resulterer i meget lave udtryksniveauer i mangel af tetracyklin, og høje udtryksniveauer i nærvær af tetracyklin.CHO celler udtrykker lave niveauer af agonist peptid MHC er transficeret med konstituerende udtrykt nonstimulatory peptid MHC. Brug af dette eksperimentelle system gør det muligt at sammenligne T-celle respons på agonist peptid MHC i nærvær eller fravær af nonstimulatoriske peptid MHC. For at starte denne procedure, dyrke CHO celler i en T-75 kolbe, som skitseret i tekstprotokollen.Dagen før T-celleaktiveringsforsøget vaskes cellerne i kolben med PBS. Tilføj en opløsning, der indeholder 05% trypsin og 2% EDTA i PBS, og inkuberes i fem til ti minutter ved stuetemperatur. Ved hjælp af et lysmikroskop skal cellerne observeres for at sikre, at de er taget af.Derefter tilsættes komplet F12 til kolben for at stoppe trypsinisering. Celleaffjedringen overføres til et 15 milliliterrør. Centrifuge ved 400G i fem minutter, og fjern supernatanten ved enten pipettering eller dekantering.Re-suspendere cellen pellet i fem milliliter komplet F12. Brug et hæmocytometer til at tælle cellerne, og juster cellekoncentrationen til 200.000 celler pr. milliliter i CF12. Der tilsættes 50 til 60 nanogram pr. milliliter tetracyklin til de agonistprøver, der kun er relateret til, for at fremkalde store mængder agonist pMHC-klasse I-udtryk som en positiv kontrol.Efter dette, bland CHO celler enten ved vortexing eller pipettering. Tilføj 100 mikroliter af celle suspensionen til hver brønd af en U-bund 96-brønd plade. Inkubere natten over ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid.Dagen før eksperimentet, centrifuge CTLS celler på 400 gange G og ved fire grader Celsius i fem minutter. Brug et hæmocytometer til at tælle cellerne, og re-suspendere dem med en tæthed på en million celler pr milliliter i komplette menneskelige T-celle medier uden cytokiner eller PHA. Inkuber ctls natten over ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid.Den næste dag, centrifuge T-cellerne på 400 gange G og ved fire grader Celsius i fem minutter. Kassér supernatanten, og re-suspension cellerne i 2 milliliter komplet serum-fri medier. Brug et hæmocytometer til at tælle T-cellerne, og juster deres tæthed til en million levende celler pr. milliliter i komplette humane T-cellemedier.Tilføj anti-human CD107a antistof på en en til 100 fortynding, og Brefeldin A på en en til 1000 fortynding. Dernæst hente 96-brønd plade, der indeholder CHO celler. Ved hjælp af et glas Pasteur pipette, aspirere medierne fra CHO celler.Tilføj 200 mikroliter af T-celle suspension til hver brønd. Co-kultur T-celler med CHO celler ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid i tre til fire timer. I slutningen af co-kultur, centrifuge 96-brønd plade ved 400 gange G og fire grader Celsius i fem minutter.Fjern supernatanten ved at aspirere eller svippe. Derefter tilsættes 2,5 mikroliter CD3 antistoffer og 2,5 mikroliter cd8 antistoffer i 50 mikroliter på 5% BSA i PBS til hver brønd, for celleoverflade antigen farvning, og blandes ved pipettering. Inkuber prøverne i mørke og på is i 30 minutter.Derefter tilsættes 150 mikroliter vaskebuffer til hver brønd for at vaske prøverne. Centrifuge prøverne ved 400 gange G og ved fire grader Celsius i fem minutter. Fjern supernatanten ved at aspirere eller svippe.Sæt en fiksering / permeabilization kit, og tilsæt 100 mikroliter af fiksering / permeabilization løsning til hver brønd, og pipette til at blande. Inkuber på is i 20 minutter. Derefter centrifuge pladen ved 400 gange G ved fire grader Celsius i fem minutter.Kassér supernatanten og tilsæt 200 mikroliter 1X perm /vask buffer til hver brønd. Gentag denne proces fra centrifugering ved at tilføje perm/vaskebufferen én gang. Derefter skal cellerne igen suspenderes i 50 mikroliter perm/vaskebuffer, der indeholder anti-interferon-gamma ved en koncentration på 3 mikrogram pr. milliliter.Inkuber på is i mørke i 30 minutter. Dernæst tilsættes 150 mikroliter af 1X perm / vask buffer. Centrifuge ved 400G, fire grader Celsius, i fem minutter.Fjern supernatant og tilsæt 200 mikroliter af 1X perm / vask buffer. Centrifuge pladen igen ved 400 gange G, fire grader Celsius, i fem minutter, og fjern supernatant ved at aspirere eller svirpende. Prøven suspenderes igen i 200 mikroliter vaskebuffer, og der foretages cytometrisk analyse.En dag før eksperimentet, bland CHO celler enten ved vortexing eller pipettering. Næste tilføje en milliliter af cellen suspension til hver brønd af en 12-brønd plade. Inkubere natten over ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid.På dagen for forsøget, bruge en celle skraber til at frigøre CHO celler fra bunden af hver brønd. Overfør den ene milliliter medier, der indeholder cellerne fra hver brønd, til FACS-rør. Centrifuge ved 400 gange G og ved fire grader Celsius i fem minutter.Re-suspendering i 100 mikroliter anti-HLA antistof fortyndet i vask buffer. Inkuber på is i 30 minutter. Derefter tilsættes en milliliter vaskebuffer til hver CHO-prøve.Centrifuge ved 400 gange G og ved fire grader Celsius i fem minutter, og kassér supernatanten. Re-suspendere hver prøve i 3 milliliter vask buffer, og gå videre til flow cytometri analyse. I denne undersøgelse præsenteres et robust værktøj til undersøgelse af molekylær interaktion under human CD8 positiv T-celleaktivering.En manipuleret xenogenic system er genereret, der præsenterer lave niveauer af agonist pMHC i nærvær eller fravær af co-agonist pMHC. Disse manipulerede APC'er bruges derefter til at stimulere en E183-specifik human CD8 positiv T-celle klon. Uptransmittede CHO-celler og CHO-celler, der udtrykker det nonstimulatoriske gag-MHC-kompleks, fremkalder ikke aktivering.Udtryk for høje niveauer af den agonistiske single-kæde E183-MHC kompleks, som er den positive kontrol, ses at fremkalde meget effektiv interferon-gamma produktion, og degranulation, viser, at den en-kæde E183 konstrukt kan genkendes af en bestemt TCR til at aktivere T celle effektor funktioner. Ekspression af lave niveauer af single-chain E183-MHC kompleks fremkalde lavere niveauer af interferon-gamma produktion og degranulation, som blev forstærket af tilstedeværelsen af en nonstimulatoriske Gag-MHC kompleks. Bemærk, at meget høje procentdele af CD107a+T-celler observeres selv som reaktion på lave niveauer af antigen pMHC, hvilket er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser.Men tilstedeværelsen af nonstimulatory Gag-MHC kompleks øger CD107a MFI. Under denne procedure, Er det afgørende at kontrollere agonist peptid MHC udtryk for at sikre lige agonist præsentation med eller uden nonstimulatory peptid. Det er afgørende at kvantificere agonist peptid MHC udtryk ved hjælp af TCR-lignende antistoffer i hvert eksperiment.En alternativ tilgang er at bruge understøttede lipid tolags, eller perler, præsentere fast mængde af agonist peptid MHC i overværelse af nonstimulatoriske peptid MHC. Disse eksperimentelle system bør give mulighed for test af flere nonstimulatoriske peptid sekvenser for co-agonisme. Den enkædede MHC-teknologi kan bruges til at undersøge molekylære interaktioner i CD4 T-celleaktivering samt til at undersøge ikke-klassiske MHC-molekyler.Denne protokol bruger humant blod og menneskelige celler. Følg alle de nødvendige forholdsregler, når du arbejder med humant blod for at reducere risikoen for overførsel af blodbårne sygdomme.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Use of Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Anvendelse af interferon-γ Enzymbundet immunospot Assay til karakterisering hidtil ukendte T-celle epitoper af human papillomavirus

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induktion af graft-versus-host sygdom og<em&gt; In Vivo</em&gt; T Cell Monitoring Brug en MHC-matchet murin model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Ændring af primære humane T-celler

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

Anvendelse af fluorescerende Skud Arrays for Vurdering af T-celle respons<em&gt; In vivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flowcytometrisk analyse of Natural Killer Cell lytisk aktivitet i humant fuldblod

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Analyse af Simian Immunodeficiency Virus-specifikke CD8<sup&gt; +</sup&gt; T-celler i makakaber efter Peptid-MHC-I tetramerfarvning

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Meget multiplexeret, superopløselig billeddannelse af T-celler ved hjælp af madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

In Situ MHC-tetramer farvning og kvantitativ analyse til at bestemme placering, overflod og fænotype af Antigen-specifikke CD8 T celler i væv

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...