Nonstimulatoriske peptid MHC komplekser ikke aktivere T-celler, men kan forbedre T-celle reaktioner på agonist peptid MHC. Denne protokol beskriver et eksperimentelt system til at undersøge co-agonisme under menneskelig CD8 T-celle aktivering. Vi udtrykker MHC molekyler som enkeltkædede komplekser med kovalent forbundet tung kæde, beta-2-mikroglobulin, og peptid.
Dette gør det muligt at indføre mutationer i MHC molekyler præsenterer forudbestemte peptider. Denne protokol bruger human CTN klon, en specifik for en epitop af hepatitis B-virus. Forståelse af mekanismen for co-agonisme under T-celle reaktioner mod hepatitis kan bidrage til udviklingen af immunotropica mod denne virusinfektion.
De præsenterede metoder kan anvendes i forskning og andre grundlæggende aspekter af T-celle aktivering i menneskelige T-celle systemer med kendt peptid MHC specificitet. Denne protokol bruger single-kæde menneskelige MHC klasse I molekyler, der består af signal sekvens, peptid af interesse, linker, human beta-2-mikroglobulin linker, og MHC tunge kæde. E1A3 peptid fra hepatitis B anvendes som agonist peptid.
Gag fra HIV anvendes som nonstimulatorisk peptid. De enkædede humane MHC-molekyler udtrykkes i en hamstercellelinje, der indeholder tetracyklinrepressor. Agonist single-chain MHC udtrykkes ved hjælp af tetracyclin-inducerende plasmid, hvilket resulterer i meget lave udtryksniveauer i mangel af tetracyklin, og høje udtryksniveauer i nærvær af tetracyklin.
CHO celler udtrykker lave niveauer af agonist peptid MHC er transficeret med konstituerende udtrykt nonstimulatory peptid MHC. Brug af dette eksperimentelle system gør det muligt at sammenligne T-celle respons på agonist peptid MHC i nærvær eller fravær af nonstimulatoriske peptid MHC. For at starte denne procedure, dyrke CHO celler i en T-75 kolbe, som skitseret i tekstprotokollen.
Dagen før T-celleaktiveringsforsøget vaskes cellerne i kolben med PBS. Tilføj en opløsning, der indeholder 05% trypsin og 2% EDTA i PBS, og inkuberes i fem til ti minutter ved stuetemperatur. Ved hjælp af et lysmikroskop skal cellerne observeres for at sikre, at de er taget af.
Derefter tilsættes komplet F12 til kolben for at stoppe trypsinisering. Celleaffjedringen overføres til et 15 milliliterrør. Centrifuge ved 400G i fem minutter, og fjern supernatanten ved enten pipettering eller dekantering.
Re-suspendere cellen pellet i fem milliliter komplet F12. Brug et hæmocytometer til at tælle cellerne, og juster cellekoncentrationen til 200.000 celler pr. milliliter i CF12. Der tilsættes 50 til 60 nanogram pr. milliliter tetracyklin til de agonistprøver, der kun er relateret til, for at fremkalde store mængder agonist pMHC-klasse I-udtryk som en positiv kontrol.
Efter dette, bland CHO celler enten ved vortexing eller pipettering. Tilføj 100 mikroliter af celle suspensionen til hver brønd af en U-bund 96-brønd plade. Inkubere natten over ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid.
Dagen før eksperimentet, centrifuge CTLS celler på 400 gange G og ved fire grader Celsius i fem minutter. Brug et hæmocytometer til at tælle cellerne, og re-suspendere dem med en tæthed på en million celler pr milliliter i komplette menneskelige T-celle medier uden cytokiner eller PHA. Inkuber ctls natten over ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid.
Den næste dag, centrifuge T-cellerne på 400 gange G og ved fire grader Celsius i fem minutter. Kassér supernatanten, og re-suspension cellerne i 2 milliliter komplet serum-fri medier. Brug et hæmocytometer til at tælle T-cellerne, og juster deres tæthed til en million levende celler pr. milliliter i komplette humane T-cellemedier.
Tilføj anti-human CD107a antistof på en en til 100 fortynding, og Brefeldin A på en en til 1000 fortynding. Dernæst hente 96-brønd plade, der indeholder CHO celler. Ved hjælp af et glas Pasteur pipette, aspirere medierne fra CHO celler.
Tilføj 200 mikroliter af T-celle suspension til hver brønd. Co-kultur T-celler med CHO celler ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid i tre til fire timer. I slutningen af co-kultur, centrifuge 96-brønd plade ved 400 gange G og fire grader Celsius i fem minutter.
Fjern supernatanten ved at aspirere eller svippe. Derefter tilsættes 2,5 mikroliter CD3 antistoffer og 2,5 mikroliter cd8 antistoffer i 50 mikroliter på 5% BSA i PBS til hver brønd, for celleoverflade antigen farvning, og blandes ved pipettering. Inkuber prøverne i mørke og på is i 30 minutter.
Derefter tilsættes 150 mikroliter vaskebuffer til hver brønd for at vaske prøverne. Centrifuge prøverne ved 400 gange G og ved fire grader Celsius i fem minutter. Fjern supernatanten ved at aspirere eller svippe.
Sæt en fiksering / permeabilization kit, og tilsæt 100 mikroliter af fiksering / permeabilization løsning til hver brønd, og pipette til at blande. Inkuber på is i 20 minutter. Derefter centrifuge pladen ved 400 gange G ved fire grader Celsius i fem minutter.
Kassér supernatanten og tilsæt 200 mikroliter 1X perm /vask buffer til hver brønd. Gentag denne proces fra centrifugering ved at tilføje perm/vaskebufferen én gang. Derefter skal cellerne igen suspenderes i 50 mikroliter perm/vaskebuffer, der indeholder anti-interferon-gamma ved en koncentration på 3 mikrogram pr. milliliter.
Inkuber på is i mørke i 30 minutter. Dernæst tilsættes 150 mikroliter af 1X perm / vask buffer. Centrifuge ved 400G, fire grader Celsius, i fem minutter.
Fjern supernatant og tilsæt 200 mikroliter af 1X perm / vask buffer. Centrifuge pladen igen ved 400 gange G, fire grader Celsius, i fem minutter, og fjern supernatant ved at aspirere eller svirpende. Prøven suspenderes igen i 200 mikroliter vaskebuffer, og der foretages cytometrisk analyse.
En dag før eksperimentet, bland CHO celler enten ved vortexing eller pipettering. Næste tilføje en milliliter af cellen suspension til hver brønd af en 12-brønd plade. Inkubere natten over ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid.
På dagen for forsøget, bruge en celle skraber til at frigøre CHO celler fra bunden af hver brønd. Overfør den ene milliliter medier, der indeholder cellerne fra hver brønd, til FACS-rør. Centrifuge ved 400 gange G og ved fire grader Celsius i fem minutter.
Re-suspendering i 100 mikroliter anti-HLA antistof fortyndet i vask buffer. Inkuber på is i 30 minutter. Derefter tilsættes en milliliter vaskebuffer til hver CHO-prøve.
Centrifuge ved 400 gange G og ved fire grader Celsius i fem minutter, og kassér supernatanten. Re-suspendere hver prøve i 3 milliliter vask buffer, og gå videre til flow cytometri analyse. I denne undersøgelse præsenteres et robust værktøj til undersøgelse af molekylær interaktion under human CD8 positiv T-celleaktivering.
En manipuleret xenogenic system er genereret, der præsenterer lave niveauer af agonist pMHC i nærvær eller fravær af co-agonist pMHC. Disse manipulerede APC'er bruges derefter til at stimulere en E183-specifik human CD8 positiv T-celle klon. Uptransmittede CHO-celler og CHO-celler, der udtrykker det nonstimulatoriske gag-MHC-kompleks, fremkalder ikke aktivering.
Udtryk for høje niveauer af den agonistiske single-kæde E183-MHC kompleks, som er den positive kontrol, ses at fremkalde meget effektiv interferon-gamma produktion, og degranulation, viser, at den en-kæde E183 konstrukt kan genkendes af en bestemt TCR til at aktivere T celle effektor funktioner. Ekspression af lave niveauer af single-chain E183-MHC kompleks fremkalde lavere niveauer af interferon-gamma produktion og degranulation, som blev forstærket af tilstedeværelsen af en nonstimulatoriske Gag-MHC kompleks. Bemærk, at meget høje procentdele af CD107a+T-celler observeres selv som reaktion på lave niveauer af antigen pMHC, hvilket er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser.
Men tilstedeværelsen af nonstimulatory Gag-MHC kompleks øger CD107a MFI. Under denne procedure, Er det afgørende at kontrollere agonist peptid MHC udtryk for at sikre lige agonist præsentation med eller uden nonstimulatory peptid. Det er afgørende at kvantificere agonist peptid MHC udtryk ved hjælp af TCR-lignende antistoffer i hvert eksperiment.
En alternativ tilgang er at bruge understøttede lipid tolags, eller perler, præsentere fast mængde af agonist peptid MHC i overværelse af nonstimulatoriske peptid MHC. Disse eksperimentelle system bør give mulighed for test af flere nonstimulatoriske peptid sekvenser for co-agonisme. Den enkædede MHC-teknologi kan bruges til at undersøge molekylære interaktioner i CD4 T-celleaktivering samt til at undersøge ikke-klassiske MHC-molekyler.
Denne protokol bruger humant blod og menneskelige celler. Følg alle de nødvendige forholdsregler, når du arbejder med humant blod for at reducere risikoen for overførsel af blodbårne sygdomme.
