Niet-stimulerende peptide MHC complexen niet activeren T-cellen, maar kan verbeteren T-cel reacties op agonistische peptide MHC. Dit protocol beschrijft een experimenteel systeem om co-agonisme te onderzoeken tijdens menselijke CD8 T-celactivering. We drukken MHC-moleculen uit als single-chained complexen met covalently-gekoppelde zware ketting, bèta-2-microglobuline, en het peptide.
Dit maakt het mogelijk om mutaties in MHC-moleculen te introduceren die vooraf bepaalde peptiden presenteren. Dit protocol maakt gebruik van menselijke CTN kloon, een specifiek voor een epitoop van hepatitis B-virus. Inzicht in het mechanisme van co-agonisme tijdens T-celreacties tegen hepatitis kan bijdragen aan de ontwikkeling van immunotropen tegen deze virale infectie.
De gepresenteerde methoden kunnen worden gebruikt in onderzoek en andere fundamentele aspecten van T-cel activering in menselijke T-celsystemen met bekende peptide MHC specificiteit. Dit protocol maakt gebruik van single-chain menselijke MHC klasse I moleculen, bestaande uit signaal sequentie, peptide van belang, linker, menselijke beta-2-microglobuline linker, en MHC zware keten. E1A3 peptide van hepatitis B wordt gebruikt als agonistenpepttide.
Gag van HIV wordt gebruikt als niet-stimulerend peptide. De menselijke MHC-moleculen met één ketting worden uitgedrukt in een hamstercellijn die tetracyclinerepressor bevat. Agonist single-chain MHC wordt uitgedrukt met behulp van tetracycline-inducible plasmide, wat resulteert in zeer lage expressieniveaus bij afwezigheid van tetracycline, en hoge expressieniveaus in aanwezigheid van tetracycline.
CHO-cellen die lage niveaus van agonistenpepte MHC uitdrukken, worden doorfecteerd met constitutief uitgedrukt niet-stimulerend peptide MHC. Gebruik van dit experimentele systeem maakt het mogelijk het vergelijken van T-celreacties op agonistenpeptide MHC in de aanwezigheid of afwezigheid van niet-stimulerend peptide MHC. Om deze procedure te beginnen, cultiveren CHO cellen in een T-75 kolf, zoals beschreven in het tekstprotocol.
Op de dag voor het T-celactiveringsexperiment was je de cellen in de kolf met PBS. Voeg een oplossing toe met 05% trypsine en 2%EDTA in PBS en broed gedurende vijf tot tien minuten bij kamertemperatuur uit. Met behulp van een lichtmicroscoop, observeren de cellen om ervoor te zorgen dat ze hebben losgemaakt.
Voeg vervolgens volledige F12 toe aan de kolf om de trypsinisatie te stoppen. Breng de celsuspensie over naar een buis van 15 milliliter. Centrifuge op 400G gedurende vijf minuten, en verwijder de supernatant door ofwel pipetten of decanteren.
Schors de celpellet opnieuw in vijf milliliter van volledige F12. Gebruik een hemocytometer om de cellen te tellen en pas de celconcentratie aan op 200.000 cellen per milliliter in CF12. Voeg 50 tot 60 nanogram per milliliter tetracycline toe aan de agonist-only monsters om grote hoeveelheden agonist pMHC-klasse I-expressie als een positieve controle te induceren.
Meng hierna de CHO-cellen door vortexen of pipetten. Voeg 100 microliter van de celsuspensie toe aan elke put van een U-bottom 96-well plaat. Incubeer 's nachts bij 37 graden Celsius met 5%kooldioxide.
De dag voor het experiment, centrifuge CTLS cellen op 400 keer G en op vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Gebruik een hemocytometer om de cellen te tellen, en opnieuw op te schorten ze op een dichtheid van een miljoen cellen per milliliter in volledige menselijke T-cel media zonder cytokines of PHA. Incubeer de CTLs 's nachts op 37 graden Celsius met 5%kooldioxide.
De volgende dag, centrifuge de T-cellen op 400 keer G en op vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant weg en schort de cellen opnieuw op in 2 milliliter complete serumvrije media. Gebruik een hemocytometer om de T-cellen te tellen en pas hun dichtheid aan op een miljoen levende cellen per milliliter in volledige menselijke T-celmedia.
Voeg anti-menselijke CD107a antilichaam bij een een tot 100 verdunning, en Brefeldin A bij een een tot 1000 verdunning. Haal vervolgens de 96-put plaat met de CHO-cellen. Met behulp van een glazen Pasteur pipet, aspirate de media uit de CHO cellen.
Voeg 200 microliter van de T-cel suspensie toe aan elke put. Co-cultuur van de T-cellen met CHO-cellen op 37 graden Celsius met 5%kooldioxide gedurende drie tot vier uur. Aan het einde van de co-cultuur, centrifuge de 96-put plaat op 400 keer G en vier graden Celsius gedurende vijf minuten.
Verwijder de supernatant door te aspireren of te vegen. Voeg vervolgens 2,5 microliter CD3-antilichamen en 2,5 microliter CD8-antilichamen toe in 50 microliter van 5%BSA in PBS aan elke put, voor antigeenkleuring van het celoppervlak en meng door pipetting. Broed de monsters in het donker, en op ijs, gedurende 30 minuten.
Voeg hierna 150 microliter wasbuffer aan elke put toe om de monsters te wassen. Centrifugeren de monsters op 400 keer G en op vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Verwijder de supernatant door te aspireren of te vegen.
Stel een fixatie / permeabilisatie kit, en voeg 100 microliter van fixatie / permeabilisatie oplossing om elke put, en pipet te mengen. Incubeer op ijs gedurende 20 minuten. Dan, centrifuge de plaat op 400 keer G op vier graden Celsius gedurende vijf minuten.
Gooi de supernatant en voeg 200 microliters van 1x perm / wasbuffer aan elke put. Herhaal dit proces vanaf centrifugatie door het toevoegen van de permanent / wasbuffer eenmaal. Daarna worden de cellen opnieuw opgehangen in 50 microliter perm/wasbuffer met anti-interferon-gamma bij een concentratie van 3 microgram per milliliter.
Incubeer op ijs in het donker gedurende 30 minuten. Voeg vervolgens 150 microliters van 1x perm/wasbuffer toe. Centrifuge op 400G, vier graden Celsius, gedurende vijf minuten.
Verwijder de supernatant en voeg 200 microliters van 1x perm/ wasbuffer toe. Centrifuge de plaat opnieuw op 400 keer G, vier graden Celsius, gedurende vijf minuten, en verwijder de supernatant door aspirating of flicking. Schort het monster opnieuw op in 200 microliter wasbuffers en ga verder met cytometrische analyse.
Een dag voor het experiment, meng de CHO cellen, hetzij door vortexing of pipetting. Voeg vervolgens een milliliter van de cel suspensie aan elke put van een 12-well plaat. Incubeer 's nachts bij 37 graden Celsius met 5%kooldioxide.
Gebruik op de dag van het experiment een celschraper om de CHO-cellen van de bodem van elke put los te maken. Breng de een milliliter van de media met de cellen van elke put naar FACS buizen. Centrifuge op 400 keer G en bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten.
Opnieuw opschorten in 100 microliters anti-HLA antilichaam verdund in wasbuffer. Incubeer op ijs gedurende 30 minuten. Voeg vervolgens een milliliter wasbuffer toe aan elk CHO-monster.
Centrifuge op 400 keer G en op vier graden Celsius gedurende vijf minuten, en gooi de supernatant. Stel elk monster opnieuw op in 3 milliliter wasbuffer en ga verder met cytometrieanalyse. In deze studie wordt een robuust hulpmiddel gepresenteerd voor het onderzoek naar moleculaire interactie tijdens menselijke CD8 positieve T-celactivering.
Een ontworpen xenogeen systeem wordt gegenereerd dat lage niveaus van agonist pMHC presenteert in de aanwezigheid of afwezigheid van co-agonist pMHC. Deze engineered APC's worden vervolgens gebruikt om een E183-specifieke menselijke CD8 positieve T-celkloon te stimuleren. Onvertransfecteerde CHO-cellen en CHO-cellen die het niet-stimulerende single-chain Gag-MHC-complex uitdrukken, veroorzaken geen activering.
Expressie van hoge niveaus van de agonistische single-chain E183-MHC complex, dat is de positieve controle, wordt gezien om zeer efficiënte interferon-gamma productie te induceren, en degranulation, waaruit blijkt dat de single-chain E183 constructie kan worden herkend door een specifieke TCR te activeren T-cel effector functies. Expressie van lage niveaus van single-chain E183-MHC complex induceren lagere niveaus van interferon-gamma productie en degranulation, die werd versterkt door de aanwezigheid van een niet-stimulerende Gag-MHC complex. Merk op dat zeer hoge percentages van CD107a + T-cellen worden waargenomen, zelfs in reactie op lage niveaus van antigene pMHC, wat in overeenstemming is met eerdere studies.
Echter, de aanwezigheid van niet-stimulerende Gag-MHC complex verhoogt CD107a MFI. Tijdens deze procedure is het van cruciaal belang om agonistische peptide MHC-expressie te controleren om gelijke agonistische presentatie te garanderen met of zonder niet-stimulerend peptide. Het is van cruciaal belang om agonistische peptide MHC expressie met behulp van TCR-achtige antilichamen in elk experiment te kwantificeren.
Een alternatieve aanpak is het gebruik van ondersteunde lipide bilayers, of kralen, de presentatie van vaste hoeveelheid agonistenpepte MHC in aanwezigheid van niet-stimulerend peptide MHC. Deze experimentele systeem moet het mogelijk maken het testen van meerdere niet-stimulerende peptide sequenties voor co-agonisme. De MHC-technologie met één keten kan worden gebruikt om moleculaire interacties in CD4 T-celactivering te onderzoeken en om niet-klassieke MHC-moleculen te onderzoeken.
Dit protocol maakt gebruik van menselijk bloed en menselijke cellen. Volg alle nodige voorzorgsmaatregelen bij het werken met menselijk bloed om het risico van overdracht van door bloed overgedragen ziekten te verminderen.
