Name: use of single chain mhc technology to investigate co-agonism in human cd8+ t cell activation
Uploaded: 2019-02-28T15:00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Single Chain MHC Technology to Investigate Co-agonism in Human CD8+ T Cell Activation at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי סינגפור משרד הבריאות של רפואי המועצה הלאומית למחקר תחת שלה CBRG/0064/2014 ל N.R.J.G., על ידי יצירת תחת שלה R571-002-012-592 ל- P.A.M., Investigatorship הלאומי של קרן המחקר R571-000-272-281 ל P.A.M ., על ידי סינגפור המחקר Translational (סטאר) חוקר פרס (NMRC/כוכב/013/2012) עד א. ב אנחנו אסירי תודה ד ר פול האצ'ינסון, מר Teo גואו הואי ממתקן NUS אימונולוגיה לזרום תכנית הליבה עבור המיון תא מומחה אנו מודים על אליהו חן לקריאה ביקורתית של כתב היד.

המחברים מצהירים אין אינטרסים מתחרים.

פרוטוקול שהוצגו מספקת כלי חזקים לחקירה של אינטראקציות מולקולרית במהלך הפעלת תאי CD8 + T אנושי. שלב קריטי לחקירה של co-agonism במהלך הפעלת תא T האנושי הוא שליטה אגוניסט pMHC תא השטח ביטוי כדי להבטיח אגוניסט שווה pMHC מצגת על נגמ שים עם או בלי שיתוף אגוניסט pMHC הביטוי. במערכת הניסוי שלנו, זו מושגת באמצעות שיבוט תא בודד לבטא כמויות נמוכות של אגוניסט pMHC, ואחריו supertransfection עם אגוניסט שיתוף pMHC לבנות, אגוניסט pMHC כמת באמצעות TCR דמוי נוגדן10, 32-אגוניסט sc pMHC ביטוי יכולים להשתנות לאורך זמן, זה קריטי לכמת אגוניסט pMHC ביטוי משטח על נגמ שים בשימוש כל הניסוי באמצעות TCR כמו נוגדנים. אם אין נוגדנים כמו TCR הספציפי זמין, אגוניסט scMHC-יכול לבוא לידי ביטוי כמו חלבון פלואורסצנטי פיוז'ן, ואת ביטויה פני שטח התא ואז ניתן לכמת באמצעות שיטה מיקרוסקופ רגישים, כגון מיקרוסקופ פלורסצנטיות החזרה גמורה 35 , 36. יתר על כן, תא השטח של אגוניסט שיתוף pMHC פוחתת עם הזמן, בשל מתילציה תלוית ובלתי - תלוי להחרשת יזם CMV37, וביטוי צריך לפקח באמצעות נוגדן מכתים לזרום cytometry וניתוח, עם חוזרים ונשנים FACS-מיון בעת הצורך. לנו יש תרבותי צ'ו תאים עד 5 שבועות עם אובדן מוגבלת יחסית sc pMHC הביטוי. מומלץ מאוד להקפיא את התאים צ'ו מיד לאחר הבחירה/מיון כדי להבטיח מלאי אמין של תאים עם ביטוי MHC sc ידוע.
מספר שלבים של הפרוטוקולים שהוצגו יכול להיות שונה, בהתאם לזמינות של ציוד, או בהתאם מטרות מחקר ספציפי. לדוגמה, PBMC התפשטות פוטנציאלי יכול להיות מאופק (שלב 3.2.1) באמצעות שיטות חלופיות שאינן מחייבות גמא (או X-) בעוצמה, כגון טיפול עם מיטומיצין C38. מאגרי דיסוציאציה תאים שאינם אנזימטי המכיל chelators מתכת39 יכול לשמש במקום תא גירוד בשלב 3.3.1. יתר על כן, יכול להיות שונה אנטיגן הצגת המערכת כדי להפוך אותו מתאים יותר עבור שיבוטים אנושיים CTL המבטאת שונות TCRs. צ'ו תאים האוגרים אקספרס MHC מחלקה אני מולקולות, ולמרות האלה לא רלוונטים עבור שורת רשימת אישורים אמינים למדתי כאן (איור 2 א ו איור 3A, הבחנו אין תגובות תא T untransfected תאי CHO), קיימת אפשרות כי TCRs אנושיים אחרים עשויים להראות כמה xenoreactivity. במקרה, אוגר MHC מחלקה אני הביטוי יכול להיות מופחת על ידי לדפוק אוגר β2-microglubulin או הקש על שימוש CRISPR/Cas9; או קו APC האנושי יכול לשמש לאחר β2-microglubulin CRISPR/Cas9-מתווכת או ברז נוק-אאוט.
המערכת ניסיוני המוצג כאן מאפשרת שליטה מדויקת של TCR ו CD8 אינטראקציות מולקולות MHC מציגים פפטידים מוגדרים מראש. לדוגמה, אנחנו בעבר הראו כי מוטציות המבטלת CD8 איגוד40 coagonist pMHC חיסלה שיפור ההפעלה בתיווך coagonist מאתר ואנושי CD8 + T תאים9,10, ואילו abrogating TCR אינטראקציה עם אגוניסט שיתוף pMHC לא היתה השפעה על שיפור ההפעלה בתיווך coagonist10. עם זאת, השימוש של בונה יחיד שרשרת MHC יש מספר מגבלות. לדוגמה, הגיע הזמן, הצורכים העבודה לבחון פפטיד אגוניסט שותף מספר רצף באמצעות מערכת ניסויית זו, כפי זה כרוך דור של פלסמידים מרובים קידוד sc MHC עם פפטידים שונים, ו transfections הבאים ומיון תא. בעבר, השתמשנו הקו תא חשוכת-ברז מאתר RMA-S כדי לבדוק פפטידים אגוניסט שיתוף מרובים עכבר תא T הפעלה8,9, אבל גישה זו היה לא מוצלח עם ברז לקויה האנושי T2 תא קו10, ככל הנראה עקב מצגת של ברז תלויית פפטידים41. הגבלה נוספת של מערכת הניסוי שלנו היא שזה אינו מספק שיטה מהירה לשנות את כמות מולקולות pMHC אגוניסט שותף לצורך לקביעת כמות קריטית של אגוניסט שיתוף pMHC נדרש להפעיל הפעלה תא T. יתר על כן, המשמש את המחשב טטרציקלין-inducible אינו מאפשר טיטור של אגוניסט pMHC כמות ברמת תא בודד על-ידי שינוי הריכוז טטרציקלין, כמו ריכוז טטרציקלין משתנות משנה את הפרופורציה של תאים חיוביים הלע-A2, במקום רמות הלע-A2 על בסיס לכל תא. גישה חלופית אשר אנו חוקרים כיום היא להשתמש השומנים הנתמכים bilayers42, השתמשת קודם לכן כדי לחקור co-agonism במהלך מאתר CD4 + T תאים הפעלה4 או חרוזים המציג כמות קבועה של אגוניסט pMHC ב נוכחות של כמויות משתנות של אגוניסט שיתוף pMHC. בעת שימוש בשילוב עם UV-cleavable פפטיד טכנולוגיה4,43, מערכות ניסיוני חלופיים אלה אמור לאפשר בדיקה מהירה של אגוניסט שיתוף פפטיד רצפים מרובים, כמו גם כמויות שונות של אגוניסט שיתוף pMHC .
Sc MHC הטכנולוגיה יכולה להיות גם רלוונטי לחקירה של co-agonism בתאי CD4 T אנושית או מאתר, כפי יחיד MHC class II מולקולות שרשרת הצגת שנקבעו מראש פפטידים יש כבר הביע בהצלחה על משטחים בתרבית של תאים44. יתר על כן, השימוש בטכנולוגיה sc MHC ניתן להרחיב את החקירה של מולקולות MHC-קלאסי כגון הלע-אי Sc הלע-E תואר קודם, הביטוי שלה הוכח לעכב הפעלת תאי T אדם45. מולקולת MHC-קלאסי עוד עניין היא CD1, המציג שומנים במקום פפטידים46. בונה Sc המורכב שרשרת כבדה CD1 ו β2-microglobulin הוכחו לבוא לידי ביטוי על פני השטח של התא, כדי לאגד השומנים הרלוונטיים ליגנדים47. שרשרת אחת טכנולוגיה MHC יש פוטנציאל אדיר ככלי מחקר על חקירת האינטראקציות מולקולרית במהלך הפעלת תאי T ו- NK.

MHC מחלקה אני (MHC-אני) מולקולות מציגים פפטידים קצרים (8-10 חומצות אמינו) נגזר חלבונים מסונתז על ידי כל תא. MHC-אני מולקולות על תאים בריאים להציג עצמי פפטידים שמקורם חלבונים אנדוגני. זיהום נגיפי מוביל למצגת של פפטידים נגזר וירוס-עצמי ב- MHC-אני, אבל תאים נגועים אפילו פפטידים-עצמי נוכח בנוכחות כמויות גדולות של פפטיד עצמית-MHC (pMHC). MHC-אני מזוהה על-ידי הקולטן תא T (TCR) את קולטן CD8 שיתוף על תאי T. TCR זיקה מחייבת כדי פפטיד pMHC תלויה מאוד הרצף של פפטידים שהוצגו, ואילו CD8 האיגוד אינו תלוי-פפטיד. TCR מחייב אגוניסט-עצמי pMHC מורכבים מוביל הפעלת תא T ופונקציות אפקטור. Non-מופחתים pMHC עצמית מתחמי אל תגרום / הפעלת תא T ופונקציות אפקטור, אך יכול לשפר את תא T התגובות pMHC אגוניסט, בתהליך הנקרא co-agonism1,2,3. Co-agonism נצפתה העכבר CD4 + T תאים4,5,6 וכן העכבר האנושי CD8 + T תאים7,8,9,10, 11 , 12 , 13. בתנאים פיזיולוגיים, תאי T צריך לזהות כמויות מוגבלות של אגוניסט pMHC על אנטיגן הצגת תאים (נגמ שים) שיתוף מציגים רמות גבוהות של מתחמי pMHC שאינם מופחתים, רומז co-agonism הזה תורם T אופטימלית תגובות תא ויוו. מחלקה MHC פני שטח התא סך הכל אני רמות הם לעתים קרובות downregulated במהלך זיהומים נגיפיים14 , גידולים15. אסטרטגיה זו התחמקות המערכת החיסונית תקטין את המצגת pMHC אגוניסט, אך גם מפחית את כמות pMHC אגוניסט שיתוף אני זמין עבור שיפור הפעלת תא T. יתר על כן, רמות הביטוי משטח תאים גבוהה של MHC מחלקה אני מולקולה הלע-C הוכחו לתאם עם משופרת HIV שליטה16, רומז תפקיד קריטי עבור מחלקה MHC סה כ אני ביטוי תא T הפעלה. למרות המשמעות הפיזיולוגית של co-agonism, מנגנון מולקולרי שלה עדיין שהיישום. זה מובן זאת בעיקר בשל האתגרים הטכניים השפעול לשלוט כמות pMHC הציג אגוניסט שיתוף תוך שמירה אגוניסט pMHC קבוע.
פיתחנו ניסיוני של המערכת כדי לחקור co-agonism במהלך הפעלת תאי CD8 + T האנושי בהבעת MHC האנושי מחלקה אני מולקולות מציג פפטיד שנקבע מראש כמו מפוליפפטיד יחיד (יחיד שרשרת MHC-אני, איור 1A) בתוך תא xenogeneic קו9,10. רשת יחיד (sc) אגוניסט pMHC בא לידי ביטוי בשליטה של יזם טטרציקלין-inducible בקו אוגר-derived צ'ו טי-רקס תא לבטא טטרציקלין מדכא. שבולם.; דבר זה מאפשר ביטוי "דולף" נמוך מאוד של sc אגוניסט pMHC בהיעדרו של טטרציקלין והבעה sc גבוהה אגוניסט pMHC לאחר תוספת של טטרציקלין (איור 1Bג). Sc אגוניסט לבטא pMHC T-REx צ'ו התאים היו אז supertransfected עם pMHC sc אגוניסט שותף שאינו מופחתים,-אני תחת שליטה של מקדם צורונים פעילים (איור 1Bג). השימוש במערכת ניסויית זו אפשר לנו להשוות CD8 + T cell התגובות אגוניסט pMHC נוכחות או היעדרות של רמות גבוהות של pMHC שאינם מופחתים. אנושות, מאז פפטיד MHC-אני שרשרת כבדה מחוברים covalently scMHC-לעצב, דבר זה מאפשר היכרות של מוטציות למולקולות MHC מציגים פפטידים שנקבע מראש. השימוש scMHC-אני טכנולוגיה ובכך אפשרה לנו במיוחד לווסת TCR או מחייב CD8 מאפייני אגוניסט או אגוניסט שיתוף pMHC.
Co-agonism ב- CD8 + T תאים הפעלה נצפתה באמצעות מטוהרים MHC-אני מתחמי הצגת אגוניסט, אגוניסט שיתוף פפטידים בצורה של heterodimers11,17 או קוונטית שהוצגו על הנקודות12,13. בתחילת העבודה על co-agonism בהפעלת תא CD8 + T בהקשר של אגוניסט pMHC זיהוי ב- APC להשתמש TAP2 לקויה התא קווים נגמ שים. ברז נדרש עבור תחבורה פפטיד של הציטופלסמה רשתית תוך-פלזמית, מחסור ברז קשות מפחית את מאגר זמין MHC class-איגוד פפטידים. בהיעדרו של פפטידים, המתחם המתהווה של MHC מחלקה אני שרשרת כבדה,2β - microglobulin אינו יציב, וכתוצאה מכך MHC נמוך מאוד-אני תא ביטוי משטח. בתחילה, השוואה של תאי T מגורה עם אנטיגן טעון על ברז-מספיקות והלקוי בעכבר RMA שורות תאים RMA-S, בהתאמה, כמו נגמ שים, אינו חושף ראיות עבור co-agonism במהלך העכבר תא T הפעלה18. עם זאת, השימוש במערכת ניסויית זו לא איפשרה בקרה מדויקת על כמות pMHC אגוניסט הציג בנפרד pMHC עצמית-מופחתים. יתר על כן, שורות תאים שני אלה עשויות להשתנות גם הביטוי של מולקולות אחרות אשר לווסת את תא T ההפעלה, כגון ליגנדים לקולטנים co-stimulatory או מעכבות תא T או מולקולות אדהזיה.
לאחר מכן, פיתחנו פרוטוקול עבור טעינת תאים TAP2 לקויה RMA-S עם פפטידים אקסוגני כדי לאפשר הצגה של כמות קבועה של אגוניסט pMHC ב נוכחות או היעדרות של pMHC שאינם מופחתים. דבר זה הושג באמצעות הפעולות הבאות: דגירה של TAP2 לקויה RMA-S תאים בטמפרטורות נמוכות (28 ° C, במקום הרגיל 37 ° C) כדי לייצב MHC ריק מחלקה אני שרשרת כבדה/β2 microglobulin מתחמי19; הדגירה ב 28 ° C עם אגוניסט אקסוגני פפטיד; הדגירה ב 28 ° C, נוכחות או היעדרות של פפטיד שאינם מופחתים אקסוגני; דגירה ב 37 ° C כדי להפחית את תא השטח ביטוי MHC ריק מחלקה אני מתחמי8,9. השימוש הגדרת הניסוי הזה חשף כי הנוכחות של pMHC שאינם מופחתים משופרת הפעלה של העכבר thymocytes, תמים היקפיים CD8 + T תאים ו- Ctl8. . Mechanistically, הנוכחות של אי-מופחתים pMHC יכול לגרום הגיוס CD8 T תאים: APC המערכת החיסונית הסינפסה גם בהיעדר של אגוניסט pMHC, pMHC מופחתים יכול לשפר TCR אינטראקציה עם CD8-coreceptor-7,-8. עם זאת, מערכת ניסויית זו אינו מאפשר בדיקות את התרומה של TCR ו CD8 מחייב coreceptor pMHC אגוניסט, אגוניסט שיתוף מתווכים של שיפור ההפעלה, כמו כל שינוי שינוי מחייב TCR או CD8 מחלקה MHC שהייתי להשפיע על כל מולקולות MHC, ללא קשר פפטידי הציג. ולכן השתמשנו מחלקה MHC רקדתי שרשרת בטכנולוגיה כדי להתגבר על בעיה זו.
מחלקה MHC רשת יחיד (sc) לעצב שכבר נעשה שימוש כדי לשפר את המצגת antigenic pMHC לאסטרטגיה טיפולית, כדי לענות על שאלות עקרוניות על מנגנונים של הפעלת קולטן תא TCR ו NK ולתפקד20,21 . scMHC-אני מורכב פפטיד,2β - microglobulin ו MHC-אני שרשרת כבדה הצטרפו שני linkers סרין/גליצין-עשיר גמיש (איור 1 א'), מספר רצפים שונים מקשר כבר פיתח ובחן22. scMHC-אני יכול לקפל בנפרד הברז מורכב, שתלווה אותנו חלבונים הדרושים עבור pMHC קונבנציונאלי ההרכבה מורכב20. scMHC-אני כבר הראו לקפל בצורה נכונה, כפי שנקבע באמצעות נוגדן ספציפי קונפורמציה מכתים22 , על ידי פתירת sc מבנה עם קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן23. ScMHC בסיסי-אני עיצוב שונתה כדי לשפר את הכריכה של זיקה נמוכה פפטידים24,25.
פרוטוקול זה מתאר את השימוש scMHC האנושי-אני לחקור co-agonism במהלך CTL אדם משבט הפעלה. הפרוטוקול מוטבה עבור שיבוט CTL אנושי ספציפי epitope של הנגיף הפטיטיס B (HBV). HBV הוא נטל בריאות חמורות ברחבי העולם, שכן ישנם 350 מיליון אנשים נגוע HBV ולדלקת HBV כרוני יכול להוביל להתפתחות קרצינומה hepatocellular (HCC). התאים HCC הנובע HBV זיהום יכול בדרך כלל להציג HBV, נגזר epitopes, ניתן לזהות על-ידי תאי T אנושי ספציפי. סיווג HBV ו HCC מסתמך על תגובות תא T אנושיים26, אך חולים HCC סובלים לעתים קרובות תא T ומעט תא T מופחתת תגובות27. . לא הקדמה של TCR HBV ספציפיים לתאי T של HBV כאסטרטגיה חיסוני פוטנציאליים כדי למנוע זיהום כרוני של HBV28. עם זאת, זה לא ידוע אם שיטה זו תהיה יעילה בסביבה קלינית, בגלל רמות נמוכות של פני MHC-אני אדם hepatocytes29. לכן, להבין את המנגנון של coagonism עשוי לספק פרספקטיבות חלופיות חיסוני של HBV, כנראה על ידי שיפור את המצגת של pMHC אנדוגני לזירוז co-agonism-מתווכת ' T cell תגובות. הפרוטוקול מכסה את כל הצעדים הדרושים למחקר על האדם co-agonism: תרביות תאים של תאי T-REx צ'ו עם אגוניסט, אגוניסט שיתוף pMHC sc, דור של שורות תאים T-REx צ'ו יציב, תרבות של HBV ספציפיים האנושי CTL CD8 + T תאים בטור והפעלה CTL ניסויים לכימות ייצור ציטוקינים ו degranulation בתגובה לתאי T-REx צ'ו. למרות אנו מתמקדים באמצעות של MHC sc מחלקה אני טכנולוגיה לחקור co-agonism במהלך הפעלת תא HBV T, יש לציין כי השיטות הציג בקלות ניתן להתאים למחקר על היבטים אחרים של תא T ההפעלה במערכות תאי T אדם עם pMHC ידוע-אני ירידה לפרטים.
פרוטוקול זה משתמש ספציפי קו CD8 + CTL אנושי עבור פפטיד HBV, נגזר E183-91 (FLLTRILTI: "E183")30 שהוצגו ב הלע-A2. sc הלע מולקולות המורכב מרצף אות מβ2 אנושי-microglobulin, פפטיד איגוד הלע-A2 של עניין, מקשר גליצין/סרין, של האדם β2-microglobulin, מקשר סרין גליצין/A2 שרשרת כבד יכול להיות מסחרית מסונתז (איור 1A ). פלסמידים קידוד scA2 בונה עם אגוניסט E183 פפטיד, או פפטידים31 HIV מחסום פה (SLYNTVATL) coagonist הינם זמינים מן המחברים על פי בקשה. ניתן לשנות את רצף פפטיד באמצעות האתר בוים-מוטגנזה מכוונת. וקטור טטרציקלין-inducible pcDNA5/אל שימש כדי להביע את השרשרת יחיד אגוניסט הלע-A2 עם פפטיד E183 (sc E183-הלע-A2). בנוכחות טטרציקלין מדכא. שבולם., pcDNA5/אל פלסמיד מאפשר רק נמוך מאוד, "דולף" ביטוי של החלבון עניין; ביטוי גבוהה יכולה להיגרם על ידי התוספת של טטרציקלין (איור 1Bג). השימוש של מערכת ביטוי טטרציקלין-inducible מאפשר שליטה על כמות תא אגוניסט משטח pMHC הביטוי. PcDNA3.1 פלסמיד ביטוי מכוננת שימש לבטא coagonist scA2 עם איסור פרסום פפטיד (sc איסור פרסום-הלע-A2). הביטוי מוסדר טטרציקלין (T-REx) צ'ו תא (קו אוגר תא, אין MHC האנושי אנדוגני) שימש לבטא אגוניסט, אגוניסט שיתוף בונה sc-הלע-A2. מערכת ניסויית זו מאפשרת שליטה מדויקת pMHC מצגת (איור 1C): לא מצגת pMHC (טי untransfected...), כמות גבוהה של אגוניסט שיתוף pMHC מצגת (sc מכוננת ביטוי איסור פרסום-הלע-A2), כמות נמוכה של אגוניסט pMHC מצגת (sc E183-הלע-A2 בהיעדרו של טטרציקלין), כמות גבוהה של אגוניסט pMHC מצגת (sc E183-הלע-A2 בנוכחות טטרציקלין), כמות נמוכה של אגוניסט pMHC מצגת וביטוי גבוהה של אגוניסט שיתוף pMHC (sc E183-הלע-A2 ב היעדרות של טטרציקלין, sc מכוננת ביטוי איסור פרסום-הלע-A2). השימוש במערכת ניסויית זו מאפשרת שליטה מדויקת של כמויות פני שטח התא של אגוניסט coagonist pMHC.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aim-V (serum free media)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12055091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blasticidin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm (fixation/permealibisation kit)</td>
			<td>BD</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH3007103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>geneticin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10131035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GolgiPlug (Brefeldin A)</td>
			<td>BD</td>
			<td>555029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hygromycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10687010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (low serum media)</td>
			<td>Bibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 X PBS</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>PB0344 &#8211; 1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>408727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant human IL2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>202-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant human IL7</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>207-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant human IL15</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>247-ILB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetracycline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-REx CHO cell line</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R71807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 x Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BD</td>
			<td>347347</td>
			<td>Clone SK7, RRID:AB_400287</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8&#945;</td>
			<td>BD</td>
			<td>563795</td>
			<td>Clone RPA-T8, RRID:AB_2722501</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD107a</td>
			<td>BD</td>
			<td>566261</td>
			<td>Clone H4A3, RRID:AB_2739639</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-A2</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-9876-41</td>
			<td>Clone BB7.2, RRID:AB_11151522</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-&#947;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-7319-41</td>
			<td>Clone 4S.B3, RRID:AB_1311250</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of single chain mhc technology to investigate co-agonism in human cd8+ t cell activation

פפטיד עצמית מופחתים-ללא MHC (pMHC) מתחמי אל תגרום / הפעלת תא T ופונקציות אפקטור, אך יכול לשפר את תא T התגובות pMHC אגוניסט, בתהליך הנקרא co-agonism. פרוטוקול זה מתאר של ניסויי מערכת לחקור co-agonism במהלך הפעלת תאי CD8 + T האנושית על ידי הבעת MHC האנושי מחלקה אני מולקולות מציגים פפטידים שנקבע מראש כמו יחיד polypeptides (יחיד שרשרת MHC) בקו תא xenogeneic. אנחנו הביע יחיד שרשרת MHCs בתנאים שבו רמות נמוכות של אגוניסט שרשרת אחת p-MHC מתחמי לבין רמות גבוהות של שרשרת יחיד שאינו מופחתים p-MHC מתחמי באו לידי ביטוי. השימוש במערכת ניסויית זו אפשר לנו להשוות CD8 + T cell התגובות אגוניסט pMHC נוכחות או היעדרות של pMHC שאינם מופחתים. הפרוטוקול מתאר תא קו תרביות תאים עם שרשרת יחיד MHC בונה, דור תא יציב של קווים, תרבות של הפטיטיס B וירוסים ספציפיים-CD8 + T תאים אנושיים, הפעלת תא T ניסויים בו זמנית לכימות ייצור ציטוקינים ו degranulation. השיטות שהוצגו ניתן למחקר על היבטים שונים של CD8 + T cell הפעלת תא T בני אדם במערכות עם ירידה לפרטים הידועים פפטיד MHC.

Sc MHC מחלקה אני טכנולוגיה המשמשת כאן מאפשר שליטה מדויקת של הבעת פני שטח התא מחלקה MHC אני עם פפטידים הידוע, covalently מקושרים, לזירוז ההפעלה תא T. יש לנו שנוצר מהונדסים xenogeneic APC מערכת (איור 1A, B, C) מאפשר הצגה של רמות נמוכות של אגוניסט pMHC נוכחות או היעדרות של אגוניסט שיתוף pMHC (איור 1D, E). אנושות, השתמשנו TCR דמוי נוגדן ספציפי עבור פפטיד E183 המציג הלע-A2 כדי להציג את המצגת של sc אגוניסט ש-e183-הלע-A2 אינה משתנה על ידי ביטוי משותף של אגוניסט שיתוף sc איסור פרסום-הלע-A2 (איור 1E). עם זאת, יש לציין כי E183-הלע-A2 ספציפי TCR דמוי נוגדן מראה כמה מחייב הלע-A2 איסור פרסום המציג פפטיד (איור 1E). ניתן לבנות דומה אנטיגן מהונדסים, הצגת מערכות התא באמצעות פפטידים שונים או מולקולות MHC לחקור דרישות מולקולרית עבור אינטראקציות TCR ו/או coreceptor בתאי T אדם עם specificities שונים.
השתמשנו אלה נגמ שים מהונדסים לעורר של E183-הלע-A2-ספציפי האנושי CD8 + T cell שיבוט. שלושה פקדים שלילי שימשו: T תאים תאים T-REx צ'ו בלבד, untransfected, תאי T-REx צ'ו לבטא כמויות גבוהות של אגוניסט שיתוף sc איסור פרסום-הלע-A2 כדי לבדוק את פוטנציאל T תאים הפעלה על ידי כל מולקולות מבוטא בתאי T-REx צ'ו (T-REx untransfected צ'ו תאים לעומת תא T בלבד), ו עבור הפעלת תא T מאת sc-איסור פרסום-הלע-A2 (תאי T-REx צ'ו לבטא רמות גבוהות של sc-איסור פרסום-הלע-A2 לעומת תאי T-REx צ'ו untransfected). Untransfected תאי T-REx צ'ו או תאי T-REx צ'ו לבטא sc-איסור פרסום-הלע-A2 לא לגרום הפעלה של E183-הלע-A2-ספציפי CD8 + CTL שיבוט, כפי שנקבע על ידי לכימות IFN-γ ייצור וביטוי של סמן degranulation CD107a כאמצעי של תא T cytotoxicity (איור 2 אב'). ביטוי של רמות גבוהות של אגוניסט sc E183-הלע-A2, משמש בקרה חיובית, המושרה יעילה מאוד IFN-γ ייצור, degranulation (איור 2 אב'), הוכחת sc הלע-A2 הבונה יכול להיות מוכר על ידי TCR הספציפי להפעלת תא t אפקטור פונקציות. ביטוי לרמות נמוכות של sc E183-הלע-A2 המושרה רמות נמוכות יותר של ייצור IFN-γ ו degranulation, זה התעצם נוכחות של אגוניסט שיתוף sc איסור פרסום-הלע-A2 (איור 2 אב'). יש לציין כי אחוזים גבוהים מאוד של CD107a + T תאים נצפו אפילו בתגובה רמות נמוכות של antigenic pMHC (איור 2B), בקנה אחד עם דיווחים קודמים על דרישות נמוכה יחסית עבור כמות אגוניסט pMHC עבור אינדוקציה של תא T cytotoxicity33. MFI CD107a, המציין את כמות degranulation על בסיס לתא בודד, מספק טווח דינמי טוב יותר (איור 2B). תא T וזמינותו ההפעלה המשמש מאפשר כימות בו זמנית של שתי פונקציות אפקטור העיקריים: ציטוקין ייצור, cytotoxicity, ומספק הבדיקה רגישה מאוד עם טווח דינמי טוב.
השתמשנו הטכנולוגיה שרשרת אחת כדי לבדוק אם TCR מחייב שיתוף אגוניסט pMHC נדרש עבור שיפור pMHC תלוית ההפעלה אגוניסט משותף. אנחנו מוטציה ולין במיקום 152 בקצה של החריץ איגוד פפטיד הלע-A2 (איור 3B) כדי חומצה גלוטמית ליצירת מוטציה V152E, כמו מוטציה זו דווחה לבטל מחייב TCR הלע-A234. לאחר מכן, בדקנו אם המוטציה V152E יכולים לבטל TCR מחייב עבור השיבוט E183-הלע-A2 CTL בשימוש, על ידי היכרות עם מוטציה זו לתוך אגוניסט sc E183-הלע-A2 ולבטא הבונה sc אגוניסט מוטציה בתאי T-REx צ'ו. Sc פראי סוג, אבל לא V152E, E183-הלע-A2 המושרה הפעלה של השיבוט CTL E183 הלע-A2-ספציפי בשימוש (איור 3 א). יש לציין כי כל מוטציה TCR מחייב מחלקה MHC אני צריך להבדק בנפרד באמצעות שיבוט בודדים בכל תא TCR/T נעשה שימוש, כמו ההשפעה של מוטציה יהיה תלוי האינטראקציות מולקולרית מדויק בין TCR pMHC מורכבים, אלו יהיו שונים בין TCRs שונים. לדוגמה, בדקנו שמונה מוטציות, גם דיווח בעבר מחייב TCR מוטציות או מוטציות חזה כדי לשבש TCR איגוד ללא abrogating מחייב פפטיד לתוך הלע-A2. אלה, V152E היה המוטציה היחידה ביטלה הפעלה של שיבוט תא T ספציפי E183 בשימוש10. אנחנו מכן הציג את המוטציה V152E לתוך sc אגוניסט שיתוף איסור פרסום-הלע-A2, והביע משותפת WT או V152E sc איסור פרסום-הלע-A2 עם רמות נמוכות של אגוניסט sc E183-הלע-A2. Sc WT והן V152E איסור פרסום-הלע-A2 משופרת ייצור IFN-γ ו degranulation (איור 3CD), רומז TCR מחייב שיתוף אגוניסט pMHC הוא לא נדרש עבור אגוניסט שיתוף תלויי-pMHC CD8 + T תאים הפעלה שיפור. שרשרת אחת MHC מחלקה אני טכנולוגיה, כפי שהוצג כאן, ניתן להשתמש כדי לשנות TCR או coreceptor מחייב את מחלקה MHC אני עם פפטיד ידוע לחקור את הדרישות מולקולרית עבור זיהוי אנטיגן תא T והפעלה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59126/59126fig1.jpg"> איור 1: יחיד שרשרת הלע-A2 בונה השתמשו לחקור אגוניסט שותף באנושי הפעלת תא CD8 + T. (א) תרשים סכמטי של מבנה scHLA-A2, המורכב covalently אות הרצף של β האנושי מאוחה2 microglobulin, פפטיד של בחירה, גליצין גמיש-סרין מקשר (GGGGSGGGGS GGGGS), microglobulin2 β אנושי, גמיש סרין גליצין מקשר, שרשרת כבדה הלע-A2. (B) תרשים סכמטי של פלסמידים המשמש ליצירת מהונדסים אנטיגן הצגת תאים לחקור co-agonism בהפעלת תא CD8 + T אנושיים: מדכא. שבולם טטרציקלין, אגוניסט sc E183-הלע-A2 תחת שליטה של טטרציקלין-inducible מקדם, אגוניסט שותף שאינו מופחתים sc איסור פרסום-הלע-A2 תחת שליטה של יזם צורונים פעילים. (ג) תרשים סכמטי של אנטיגן מהונדסים הצגת תאים השתמשו לחקור co-agonism: תאי T-REx צ'ו (אין האדם MHC ביטוי), תאי T-REx צ'ו לבטא רמות גבוהות צורונים של sc איסור פרסום-הלע-A2 (אגוניסט שותף שאינו מופחתים pMHC), תאי T-REx צ'ו לבטא רמות גבוהות של sc E183-הלע-A2 בנוכחות טטרציקלין (ברמה גבוהה של אגוניסט פפטיד), תאי T-REx צ'ו לבטא "דולף" רמות נמוכות של sc E183-הלע-A2 בהיעדרו של טטרציקלין (רמה נמוכה של אגוניסט פפטיד), תאים T-REx צ'ו הבעת רמות נמוכות של sc E183-הלע-A2, רמות גבוהות של sc איסור פרסום-הלע-A2 (רמה נמוכה של אגוניסט פפטיד), רמה גבוהה של שיתוף אגוניסט פפטיד. (ד) תא צביעת משטח של אנטיגן מהונדסים הצגת שורות תאים באמצעות נוגדן anti-הלע-A2. המספרים המוצגים מציינות MFI ערכים עבור MHC הכתם בשער תא חי. נתונים נציג של ניסויים עצמאית 5 (E) תא השטח מכתים של אנטיגן מהונדסים הצגת שורות תאים באמצעות TCR דמוי נוגדן ספציפי נגד פפטיד E183 המציג הלע-A2. המספרים המוצגים מציינות MFI ערכים עבור MHC הכתם בשער תא חי. נתונים נציג של 5 ניסויים עצמאית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59126/59126fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59126/59126fig2v3.jpg"> איור 2: נוכחות של אגוניסט שיתוף pMHC משופרת ייצור ציטוקינים, degranulation של שיבוט CD8 + CTL האנושי הלע-A2-ספציפי E183. (א) תאיים IFN-γ מכתים של שיבוט CD8 + CTL האנושי הלע-A2-ספציפיות לאחר גירוי 3 h עם הצביעו מהונדסים אנטיגן הצגת תאים. המספרים המוצגים מציינות יבויחה אחוז עבור IFN-γ מכתים. נתונים נציג של 3 ניסויים עצמאי, כל אחד הופיע עם triplicates טכני. תא (B) על פני השטח CD107a מכתים של שיבוט CD8 + CTL האנושי הלע-A2-ספציפיות לאחר גירוי 3 h עם הצביעו מהונדסים אנטיגן הצגת תאים. המספרים המוצגים מציינות את אחוז חיובי עבור CD107a מכתים או את MFI CD107a עבור האוכלוסייה תא CD8 + T. נתונים נציג של 3 ניסויים עצמאי, כל אחד הופיע עם triplicates טכני. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59126/59126fig2v3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59126/59126fig3.jpg"> איור 3: שיתוף אגוניסט – שיפור הפעלת תא T בתיווך לא דורשת TCR מחייב pMHC אגוניסט שיתוף מורכבים. (א) V152E מוטציה ב- sc E183-הלע-A2 מבטל הפעלה של השיבוט CD8 + CTL האנושי E183 הלע-A2-ספציפית. תאי T-REx צ'ו לבטא (טטרציקלין אינדוקציה) רמות גבוהות של WT או V152E מוטציה sc E183-הלע-A2 שימשו כדי לעורר E183 הלע-A2-ספציפי שיבוט CD8 + CTL אנושי במשך 3 שעות. תא t ההפעלה הייתה לכמת באמצעות צביעת IFN-γ תאיים. המספרים המוצגים מציינות יבויחה אחוז עבור IFN-γ מכתים. נתונים נציג של 3 ניסויים עצמאי, כל אחד הופיע עם triplicates טכני. (B) מיקום המוטציה V152E בתוך החריץ איגוד פפטיד של הלע-A2. (ג) V152E מוטציה ב- sc איסור פרסום-הלע-A2 אגוניסט שיתוף pMHC מורכבים לא לבטל את שיפור co agonist תלוית ההפעלה. תאיים IFN-γ מכתים של שיבוט CD8 + CTL האנושי הלע-A2-ספציפיות לאחר גירוי 4 שעות עם הצביעו מתוכנן אנטיגן הצגת תאים. המספרים המוצגים מציינות יבויחה אחוז עבור IFN-γ מכתים. נתונים נציג של 3 ניסויים עצמאי, כל אחד הופיע עם triplicates טכני. (ד) V152E מוטציה ב- sc איסור פרסום-הלע-A2 אגוניסט שיתוף pMHC מורכבים לא לבטל את שיפור co agonist תלוית ההפעלה. תא השטח CD107a מכתים של שיבוט CD8 + CTL האנושי הלע-A2-ספציפיות לאחר גירוי 3h עם הצביעו מהונדסים אנטיגן הצגת תאים. המספרים המוצגים מציינות את אחוז חיובי עבור CD107a מכתים או את MFI CD107a עבור האוכלוסייה תא CD8 + T. נתונים נציג של 3 ניסויים עצמאי, כל אחד הופיע עם triplicates טכני. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59126/59126fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Use of Single Chain MHC Technology to Investigate Co-agonism in Human CD8+ T Cell Activation at JoVE.com

Use of Single Chain MHC Technology to Investigate Co-agonism in Human CD8+ T Cell Activation

שימוש בטכנולוגיה MHC שרשרת אחת לחקור Co-agonism ב אנושי CD8 + T Cell הפעלה

פרוטוקול זה מתאר את השימוש של רשת יחיד MHC מחלקה אני מתחמי לחקור מולקולרית באינטראקציה האנושית CD8 + T תאים הפעלה: דור של הנדסה אנטיגן הצגת תאים המבטאים שרשרת אחת בונה, תרבות של שיבוט אנושי של תא CD8 + T וניסויים תא T הפעלה.

Non-stimulatory self peptide MHC (pMHC) complexes do not induce T cell activation and effector functions, but can enhance T cell responses to agonist ...

קומפלקסים לא-סטימולטוריים של פפטיד MHC אינם מפעילים תאי T, אך יכולים לשפר את תגובות תאי T לפפטיד MHC אגוניסט. פרוטוקול זה מתאר מערכת ניסיונית לחקור אגוניזם שותף במהלך הפעלת תא CD8 T אנושי. אנו מבטאים מולקולות MHC כמתחמים בעלי שרשרת אחת עם שרשרת כבדה המקושרת באופן קווולנטי, בטא-2-מיקרוגלובולין ופפטיד.זה מאפשר החדרת מוטציות למולקולות MHC המציגות פפטידים קבועים מראש. פרוטוקול זה משתמש שיבוט CTN אנושי, ספציפי עבור אפיטופ של וירוס הפטיטיס B. הבנת המנגנון של אגוניזם משותף במהלך תגובות תא T נגד הפטיטיס יכול לתרום להתפתחות של immunotropics נגד זיהום ויראלי זה.השיטות המוצגות ניתן להשתמש במחקר היבטים בסיסיים אחרים של הפעלת תא T במערכות תא T אנושי עם ספציפיות ידועה פפטיד MHC. פרוטוקול זה משתמש במולקולות MHC מסוג I אנושיות בשרשרת אחת, המורכבות מרצף אותות, פפטיד של עניין, מקשר, מקשר בטא-2-מיקרוגלובולין אנושי ושרשרת כבדה MHC. E1A3 פפטיד מהפטיטיס B משמש פפטיד אגוניסט.איסור פרסום מאיידס משמש כפפטיד לא סטימולטורי. מולקולות MHC אנושיות בשרשרת אחת מתבטאות בקו תא אוגר המכיל מדכא טטרציקלין. MHC שרשרת אחת אגוניסטית באה לידי ביטוי באמצעות פלסמיד טטרציקלין-בלתי ניתן לעיכול, וכתוצאה מכך רמות ביטוי נמוכות מאוד בהעדר טטרציקלין, ורמות ביטוי גבוהות בנוכחות טטרציקלין.תאי CHO המבטאים רמות נמוכות של פפטיד אגוניסט MHC מתחלפים עם פפטיד MHC שאינו מתבטא באופן מכונן. השימוש במערכת ניסיונית זו מאפשר השוואת תגובות תא T פפטיד אגוניסט MHC בנוכחות או היעדר פפטיד nonstimulatory MHC. כדי להתחיל בהליך זה, לטפח תאי CHO בבקבוק T-75, כמתואר בפרוטוקול הטקסט.ביום שלפני הניסוי בהפעלת תאי T, שטפו את התאים בבקבוקון עם PBS. הוסף פתרון המכיל 05%trypsin ו- 2%EDTA ב- PBS, ודגירה במשך חמש עד עשר דקות בטמפרטורת החדר. באמצעות מיקרוסקופ אור, להתבונן בתאים כדי לוודא שהם התנתקו.לאחר מכן הוסף F12 מלא לבקבוקון כדי לעצור את טריפסיוניזציה. העבר את ההשעיה התא לצינור 15 מיליליטר. צנטריפוגה ב 400G במשך חמש דקות, ולהסיר את supernatant על ידי צינור או decanting.להשעות מחדש את גלולת התא בחמישה מיליליטר של F12 מלא. השתמש בהמוציטומטר כדי לספור את התאים, ולהתאים את ריכוז התאים ל- 200, 000 תאים למיליליטר ב- CF12. הוסף 50 עד 60 ננוגרם למיליליטר של טטרציקלין לדגימות אגוניסט בלבד כדי לגרום כמויות גבוהות של אגוניסט pMHC בכיתה אני ביטוי כפקד חיובי.לאחר מכן, מערבבים את תאי CHO או על ידי מערבולת או צינורות. הוסף 100 microliters של ההשעיה התא לכל באר של צלחת U-התחתון 96-well. דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.יום לפני הניסוי, תאי CTLS צנטריפוגה ב 400 פעמים G וב ארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. השתמש hemocytometer לספור את התאים, ולהשעות אותם מחדש בצפיפות של מיליון תאים למיליליטר במדיה תא T אנושי מלא ללא ציטוקינות או PHA. דגירה CTLs לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.למחרת, צנטריפוגה תאי T ב 400 פעמים G ו בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי והשהה מחדש את התאים ב- 2 מיליליטר של מדיה מלאה ללא סרום. השתמש בהמוציטומטר כדי לספור את תאי T, ולהתאים את צפיפותם למיליון תאים חיים למיליליטר במדיה מלאה של תאי T אנושיים.הוסף נוגדן CD107a אנטי אנושי בדילול של 1 עד 100, וברפלדין A בדילול של 1 עד 1000. לאחר מכן, לאחזר את הלוח 96 באר המכיל את תאי CHO. באמצעות פיפטה פסטר זכוכית, שאפו את המדיה מתאים CHO.הוסף 200 microliters של ההשעיה תא T לכל באר. שיתוף תרבת תאי T עם תאי CHO ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני במשך שלוש עד ארבע שעות. בסוף התרבות ה-21, צנטריפוגה צלחת 96 באר ב 400 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.הסר את העל-טבעי על-ידי שאיפה או החלקה. לאחר מכן הוסיפו 2.5 מיקרוליטרים של נוגדני CD3 ו-2.5 מיקרוליטרים של נוגדני CD8 ב-50 מיקרוליטרים של 5%BSA ב-PBS לכל באר, לכתמת אנטיגן על פני התא, ומערבבים על ידי צינורות. להדגירה את הדגימות בחושך, ועל קרח, במשך 30 דקות.לאחר מכן, להוסיף 150 microliters של חיץ לשטוף לכל באר לשטוף את הדגימות. צנטריפוגה הדגימות ב 400 פעמים G וב ארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. הסר את העל-טבעי על-ידי שאיפה או החלקה.הגדר ערכת קיבעון/פרמיביליזציה, והוסף 100 מיקרוליטרים של פתרון קיבעון/פרמיביליזציה לכל באר, ופיקט לערבב. דגירה על קרח במשך 20 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה הצלחת ב 400 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.השליכו את העל-טבעי והוסיפו 200 מיקרוליטרים של חיץ 1X perm/wash לכל באר. חזור על תהליך זה מצנטריפוגה באמצעות הוספת מאגר perm / לשטוף פעם אחת. לאחר מכן, להשעות מחדש את התאים 50 microliters של חיץ פרם / לשטוף המכיל אנטי אינטרפרון-גמא בריכוז של 3 מיקרוגרם למיליליטר.דגירה על קרח בחושך במשך 30 דקות. לאחר מכן, להוסיף 150 microliters של חיץ 1X פרם / לשטוף. צנטריפוגה ב400G, ארבע מעלות צלזיוס, במשך חמש דקות.הסר את supernatant ולהוסיף 200 microliters של חיץ 1X פרם / לשטוף. צנטריפוגה הצלחת שוב ב 400 פעמים G, ארבע מעלות צלזיוס, במשך חמש דקות, ולהסיר את העל טבעי על ידי שאיפה או הבהוב. להשעות מחדש את המדגם ב 200 microliters של מאגר לשטוף ולהמשיך עם ניתוח ציטומטרי.יום אחד לפני הניסוי, מערבבים את תאי CHO על ידי מערבולת או צינורות. הבא להוסיף מיליליטר אחד של ההשעיה התא לכל באר של צלחת 12 היטב. דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.ביום הניסוי, השתמש במגרד תאים כדי לנתק את תאי CHO מתחתית כל באר. העבר את מיליליטר אחד של מדיה המכילה את התאים מכל באר לצינורות FACS. צנטריפוגה ב 400 פעמים G וב ארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.להשעות מחדש ב 100 microliters של נוגדן נגד HLA מדולל במאגר לשטוף. דגירה על קרח במשך 30 דקות. לאחר מכן להוסיף מיליליטר אחד של חיץ לשטוף לכל מדגם CHO.צנטריפוגה ב 400 פעמים G וב ארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, ולהשליך את העל טבעי. להשעות מחדש כל מדגם ב 3 מיליליטר של חיץ לשטוף, ולהמשיך להזרים ניתוח ציטומטריה. במחקר זה, כלי חזק מוצג לחקר האינטראקציה המולקולרית במהלך הפעלת תא T חיובי CD8 אנושי.מערכת קסנוגנית מהונדסת נוצרת המציגה רמות נמוכות של pMHC אגוניסט בנוכחות או היעדר pMHC אגוניסט שותף. מחשבי API מהונדסים אלה משמשים לאחר מכן כדי לעורר שיבוט תא T חיובי CD8 אנושי ספציפי E183. תאי CHO לא נטרפו, ותאי CHO המבטאים את קומפלקס Gag-MHC שאינו סטימולטורי בשרשרת אחת אינם גורמים להפעלה.ביטוי של רמות גבוהות של קומפלקס E183-MHC אגוניסט שרשרת אחת, שהוא השליטה החיובית, נראה לגרום לייצור יעיל מאוד אינטרפרון-גמא, degranulation, המוכיח כי מבנה E183 שרשרת אחת ניתן לזהות על ידי TCR ספציפי כדי להפעיל פונקציות אפקט תא T. ביטוי של רמות נמוכות של קומפלקס E183-MHC שרשרת אחת לגרום לרמות נמוכות יותר של ייצור אינטרפרון-גמא ו degranulation, אשר שופרה על ידי נוכחות של קומפלקס Gag-MHC nonstimulatory. שים לב כי אחוזים גבוהים מאוד של תאים CD107a + T נצפו אפילו בתגובה לרמות נמוכות של pMHC אנטיגני, אשר עולה בקנה אחד עם מחקרים קודמים.עם זאת, נוכחות של קומפלקס Gag-MHC לא סטימולטורי מגדילה את CD107a MFI. במהלך הליך זה, חיוני לשלוט בביטוי mHC פפטיד אגוניסט כדי להבטיח מצגת אגוניסטית שווה עם או בלי פפטיד nonstimulatory. זה קריטי לכמת ביטוי פפטיד אגוניסט MHC באמצעות נוגדנים דמויי TCR בכל ניסוי.גישה חלופית היא להשתמש bilayers השומנים נתמך, או חרוזים, הצגת כמות קבועה של פפטיד אגוניסט MHC בנוכחות פפטיד nonstimulatory MHC. מערכת ניסיונית זו אמורה לאפשר בדיקה של רצפי פפטיד לא-סטימולטוריים מרובים עבור אגוניזם שותף. ניתן להשתמש בטכנולוגיית MHC בשרשרת אחת כדי לחקור אינטראקציות מולקולריות בהפעלת תאי CD4 T, כמו גם כדי לחקור מולקולות MHC לא קלאסיות.פרוטוקול זה משתמש בדם אנושי ותאים אנושיים. בצע את כל אמצעי הזהירות הדרושים בעת עבודה עם דם אנושי כדי להפחית את הסיכון להעברת מחלות המועברות בדם.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

התמרה retroviral של T-cell קולטנים עכבר מתאי T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Use of Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

השימוש באינטרפרון-γ Assay האנזים המקושר Immunospot לאפיין רומן T-cell אפיטופים של וירוס הפפילומה האנושי

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

אינדוקציה של מחלת שתל נגד מארח ו<em&gt; In Vivo</em&gt; ניטור תא T תוך שימוש במודל Murine MHC התאמה

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

שינוי מערכת Transposon piggyBac של תאי T אנושיים ראשוניים

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

השימוש במערכי יעד פלורסנט להערכה של תגובות תא T<em&gt; בvivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

ניתוח תזרים Cytometric של תא הטבעי Killer ממס פעילות דם מלא אנוש

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

ניתוח של CD8 וירוס ספציפי החיסוני Simian<sup&gt; +</sup&gt; T-התאים קופי רזוס ידי פפטיד-MHC-I tetramer מכתים

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

מאוד מרבב, סופר ברזולוציה הדמיה של תאים T באמצעות madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

בחיי עיר MHC-tetramer מכתים וניתוח כמותי כדי לקבוע את מיקום שפע, ותפקיד של אנטיגן ספציפי CD8 T תאים ברקמות

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...