קומפלקסים לא-סטימולטוריים של פפטיד MHC אינם מפעילים תאי T, אך יכולים לשפר את תגובות תאי T לפפטיד MHC אגוניסט. פרוטוקול זה מתאר מערכת ניסיונית לחקור אגוניזם שותף במהלך הפעלת תא CD8 T אנושי. אנו מבטאים מולקולות MHC כמתחמים בעלי שרשרת אחת עם שרשרת כבדה המקושרת באופן קווולנטי, בטא-2-מיקרוגלובולין ופפטיד.
זה מאפשר החדרת מוטציות למולקולות MHC המציגות פפטידים קבועים מראש. פרוטוקול זה משתמש שיבוט CTN אנושי, ספציפי עבור אפיטופ של וירוס הפטיטיס B. הבנת המנגנון של אגוניזם משותף במהלך תגובות תא T נגד הפטיטיס יכול לתרום להתפתחות של immunotropics נגד זיהום ויראלי זה.
השיטות המוצגות ניתן להשתמש במחקר היבטים בסיסיים אחרים של הפעלת תא T במערכות תא T אנושי עם ספציפיות ידועה פפטיד MHC. פרוטוקול זה משתמש במולקולות MHC מסוג I אנושיות בשרשרת אחת, המורכבות מרצף אותות, פפטיד של עניין, מקשר, מקשר בטא-2-מיקרוגלובולין אנושי ושרשרת כבדה MHC. E1A3 פפטיד מהפטיטיס B משמש פפטיד אגוניסט.
איסור פרסום מאיידס משמש כפפטיד לא סטימולטורי. מולקולות MHC אנושיות בשרשרת אחת מתבטאות בקו תא אוגר המכיל מדכא טטרציקלין. MHC שרשרת אחת אגוניסטית באה לידי ביטוי באמצעות פלסמיד טטרציקלין-בלתי ניתן לעיכול, וכתוצאה מכך רמות ביטוי נמוכות מאוד בהעדר טטרציקלין, ורמות ביטוי גבוהות בנוכחות טטרציקלין.
תאי CHO המבטאים רמות נמוכות של פפטיד אגוניסט MHC מתחלפים עם פפטיד MHC שאינו מתבטא באופן מכונן. השימוש במערכת ניסיונית זו מאפשר השוואת תגובות תא T פפטיד אגוניסט MHC בנוכחות או היעדר פפטיד nonstimulatory MHC. כדי להתחיל בהליך זה, לטפח תאי CHO בבקבוק T-75, כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
ביום שלפני הניסוי בהפעלת תאי T, שטפו את התאים בבקבוקון עם PBS. הוסף פתרון המכיל 05%trypsin ו- 2%EDTA ב- PBS, ודגירה במשך חמש עד עשר דקות בטמפרטורת החדר. באמצעות מיקרוסקופ אור, להתבונן בתאים כדי לוודא שהם התנתקו.
לאחר מכן הוסף F12 מלא לבקבוקון כדי לעצור את טריפסיוניזציה. העבר את ההשעיה התא לצינור 15 מיליליטר. צנטריפוגה ב 400G במשך חמש דקות, ולהסיר את supernatant על ידי צינור או decanting.
להשעות מחדש את גלולת התא בחמישה מיליליטר של F12 מלא. השתמש בהמוציטומטר כדי לספור את התאים, ולהתאים את ריכוז התאים ל- 200, 000 תאים למיליליטר ב- CF12. הוסף 50 עד 60 ננוגרם למיליליטר של טטרציקלין לדגימות אגוניסט בלבד כדי לגרום כמויות גבוהות של אגוניסט pMHC בכיתה אני ביטוי כפקד חיובי.
לאחר מכן, מערבבים את תאי CHO או על ידי מערבולת או צינורות. הוסף 100 microliters של ההשעיה התא לכל באר של צלחת U-התחתון 96-well. דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.
יום לפני הניסוי, תאי CTLS צנטריפוגה ב 400 פעמים G וב ארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. השתמש hemocytometer לספור את התאים, ולהשעות אותם מחדש בצפיפות של מיליון תאים למיליליטר במדיה תא T אנושי מלא ללא ציטוקינות או PHA. דגירה CTLs לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.
למחרת, צנטריפוגה תאי T ב 400 פעמים G ו בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי והשהה מחדש את התאים ב- 2 מיליליטר של מדיה מלאה ללא סרום. השתמש בהמוציטומטר כדי לספור את תאי T, ולהתאים את צפיפותם למיליון תאים חיים למיליליטר במדיה מלאה של תאי T אנושיים.
הוסף נוגדן CD107a אנטי אנושי בדילול של 1 עד 100, וברפלדין A בדילול של 1 עד 1000. לאחר מכן, לאחזר את הלוח 96 באר המכיל את תאי CHO. באמצעות פיפטה פסטר זכוכית, שאפו את המדיה מתאים CHO.
הוסף 200 microliters של ההשעיה תא T לכל באר. שיתוף תרבת תאי T עם תאי CHO ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני במשך שלוש עד ארבע שעות. בסוף התרבות ה-21, צנטריפוגה צלחת 96 באר ב 400 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.
הסר את העל-טבעי על-ידי שאיפה או החלקה. לאחר מכן הוסיפו 2.5 מיקרוליטרים של נוגדני CD3 ו-2.5 מיקרוליטרים של נוגדני CD8 ב-50 מיקרוליטרים של 5%BSA ב-PBS לכל באר, לכתמת אנטיגן על פני התא, ומערבבים על ידי צינורות. להדגירה את הדגימות בחושך, ועל קרח, במשך 30 דקות.
לאחר מכן, להוסיף 150 microliters של חיץ לשטוף לכל באר לשטוף את הדגימות. צנטריפוגה הדגימות ב 400 פעמים G וב ארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. הסר את העל-טבעי על-ידי שאיפה או החלקה.
הגדר ערכת קיבעון/פרמיביליזציה, והוסף 100 מיקרוליטרים של פתרון קיבעון/פרמיביליזציה לכל באר, ופיקט לערבב. דגירה על קרח במשך 20 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה הצלחת ב 400 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.
השליכו את העל-טבעי והוסיפו 200 מיקרוליטרים של חיץ 1X perm/wash לכל באר. חזור על תהליך זה מצנטריפוגה באמצעות הוספת מאגר perm / לשטוף פעם אחת. לאחר מכן, להשעות מחדש את התאים 50 microliters של חיץ פרם / לשטוף המכיל אנטי אינטרפרון-גמא בריכוז של 3 מיקרוגרם למיליליטר.
דגירה על קרח בחושך במשך 30 דקות. לאחר מכן, להוסיף 150 microliters של חיץ 1X פרם / לשטוף. צנטריפוגה ב400G, ארבע מעלות צלזיוס, במשך חמש דקות.
הסר את supernatant ולהוסיף 200 microliters של חיץ 1X פרם / לשטוף. צנטריפוגה הצלחת שוב ב 400 פעמים G, ארבע מעלות צלזיוס, במשך חמש דקות, ולהסיר את העל טבעי על ידי שאיפה או הבהוב. להשעות מחדש את המדגם ב 200 microliters של מאגר לשטוף ולהמשיך עם ניתוח ציטומטרי.
יום אחד לפני הניסוי, מערבבים את תאי CHO על ידי מערבולת או צינורות. הבא להוסיף מיליליטר אחד של ההשעיה התא לכל באר של צלחת 12 היטב. דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.
ביום הניסוי, השתמש במגרד תאים כדי לנתק את תאי CHO מתחתית כל באר. העבר את מיליליטר אחד של מדיה המכילה את התאים מכל באר לצינורות FACS. צנטריפוגה ב 400 פעמים G וב ארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.
להשעות מחדש ב 100 microliters של נוגדן נגד HLA מדולל במאגר לשטוף. דגירה על קרח במשך 30 דקות. לאחר מכן להוסיף מיליליטר אחד של חיץ לשטוף לכל מדגם CHO.
צנטריפוגה ב 400 פעמים G וב ארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, ולהשליך את העל טבעי. להשעות מחדש כל מדגם ב 3 מיליליטר של חיץ לשטוף, ולהמשיך להזרים ניתוח ציטומטריה. במחקר זה, כלי חזק מוצג לחקר האינטראקציה המולקולרית במהלך הפעלת תא T חיובי CD8 אנושי.
מערכת קסנוגנית מהונדסת נוצרת המציגה רמות נמוכות של pMHC אגוניסט בנוכחות או היעדר pMHC אגוניסט שותף. מחשבי API מהונדסים אלה משמשים לאחר מכן כדי לעורר שיבוט תא T חיובי CD8 אנושי ספציפי E183. תאי CHO לא נטרפו, ותאי CHO המבטאים את קומפלקס Gag-MHC שאינו סטימולטורי בשרשרת אחת אינם גורמים להפעלה.
ביטוי של רמות גבוהות של קומפלקס E183-MHC אגוניסט שרשרת אחת, שהוא השליטה החיובית, נראה לגרום לייצור יעיל מאוד אינטרפרון-גמא, degranulation, המוכיח כי מבנה E183 שרשרת אחת ניתן לזהות על ידי TCR ספציפי כדי להפעיל פונקציות אפקט תא T. ביטוי של רמות נמוכות של קומפלקס E183-MHC שרשרת אחת לגרום לרמות נמוכות יותר של ייצור אינטרפרון-גמא ו degranulation, אשר שופרה על ידי נוכחות של קומפלקס Gag-MHC nonstimulatory. שים לב כי אחוזים גבוהים מאוד של תאים CD107a + T נצפו אפילו בתגובה לרמות נמוכות של pMHC אנטיגני, אשר עולה בקנה אחד עם מחקרים קודמים.
עם זאת, נוכחות של קומפלקס Gag-MHC לא סטימולטורי מגדילה את CD107a MFI. במהלך הליך זה, חיוני לשלוט בביטוי mHC פפטיד אגוניסט כדי להבטיח מצגת אגוניסטית שווה עם או בלי פפטיד nonstimulatory. זה קריטי לכמת ביטוי פפטיד אגוניסט MHC באמצעות נוגדנים דמויי TCR בכל ניסוי.
גישה חלופית היא להשתמש bilayers השומנים נתמך, או חרוזים, הצגת כמות קבועה של פפטיד אגוניסט MHC בנוכחות פפטיד nonstimulatory MHC. מערכת ניסיונית זו אמורה לאפשר בדיקה של רצפי פפטיד לא-סטימולטוריים מרובים עבור אגוניזם שותף. ניתן להשתמש בטכנולוגיית MHC בשרשרת אחת כדי לחקור אינטראקציות מולקולריות בהפעלת תאי CD4 T, כמו גם כדי לחקור מולקולות MHC לא קלאסיות.
פרוטוקול זה משתמש בדם אנושי ותאים אנושיים. בצע את כל אמצעי הזהירות הדרושים בעת עבודה עם דם אנושי כדי להפחית את הסיכון להעברת מחלות המועברות בדם.
