Name: use of single chain mhc technology to investigate co-agonism in human cd8+ t cell activation
Uploaded: 2019-02-28T15:00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Single Chain MHC Technology to Investigate Co-agonism in Human CD8+ T Cell Activation at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av Singapore helsedepartementets National Medical Research Council under dets CBRG/0064/2014 til N.R.J.G., ved å opprette under sin R571-002-012-592 P.A.M., National Research Foundation Investigatorship R571-000-272-281 til P.A.M ., og en Singapore translasjonsforskning (stjerne) etterforsker prisen (NMRC/STaR/013/2012) til AB Vi er takknemlige til Dr. Paul Hutchinson og Mr. Teo Guo Hui fra NUS immunologi program Flow Core anlegg for ekspert celle sorteringen. Vi er takknemlige for Elijah Chen for kritisk lesning av manuskriptet.

Merk: Alle trinn som involverer bruk av live, ikke-fast celler skal utføres i en biosafety hette, og eventuelle biologisk farlige avfall skal kastes i henhold til de lokale helse- og sikkerhetsforskrifter.
1. CHO celle Transfection og generasjon stabil CHO linjer
<ol><li>
CHO celle transfection Merk: denne delen beskriver CHO celle transfection bruker polyethylenimine (PEI). Men kan alternative metoder brukes, som CHO celler er relativt lett å transfect bruke kommersielt tilgjengelige lipid transfection reagenser.<ol>
<li>Kultur CHO celler i fullstendig F12 (cF12, F12 supplert med 5% FBS, 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin og 10 µg/mL blasticidin å opprettholde uttrykk for tetracycline repressor). Passasje cellene hver 3-4 dager på en 1:10 forholdet.</li>
		<li>En dag før transfection, forberede CHO celle suspensjon. Vask CHO celler i flasken med PBS (10 mL for PBS for en MT75 kolbe, 5 mL PBS for en T25 kolbe). Legge til 0,05% Trypsin/0.02% EDTA i PBS (2 mL for en MT75 kolbe, 1 mL for en T25 kolbe) til flasken og Inkuber i 5-10 min ved romtemperatur (RT). Bruker lys mikroskop, kontroller at cellene har frittliggende og stoppe trypsinization ved å legge cF12 til kolbe (8 mL for en MT75 kolbe, 4 mL for en T25 kolbe).</li>
		<li>Overføre CHO celle suspensjon til en 15 mL tube, og sentrifuge 300-400 x g for 5 min på 4 ° C eller RT. Fjern nedbryting, nytt avbryte cF12 (10 mL for en MT75 kolbe, 5 mL for en T25 kolbe) og telle ved hjelp av en hemocytometer.</li>
		<li>Justere celle konsentrasjon til 60 000-100.000 CHO celler/mL. Legge til 5 mL av CHO celle suspensjon (300.000-500.000 CHO celler) per brønn i en 6 godt plate. Ruge over natten ved 37 ° C, 5% CO2.</li>
		<li>På dagen for transfection, legge til 400 μL serum-free F12 medium eller lav serum media en 1,5 mL tube. Legge til 3 μg av plasmider 400 μL media. Bland ved pipettering. Legge til 6 μg Pei (6 μL 1 mg/mL PEI løsning) til media/DNA blanding og vortex umiddelbart for 10 s.</li>
		<li>Inkuber i media/DNA/PEI blandingen på RT i 10-15 min. Under denne inkubasjon erstatte CHO cellen media i 6 godt plate med 5 mL av fersk cF12 media.</li>
		<li>Legg til media/DNA/PEI løsningen CHO celler. Legge til løsningen dropwise og jevnt over brønnen. Ruge over natten ved 37 ° C, 5% CO2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Generasjon av stabil CHO linjer
	<ol>
<li>En dag etter transfection, Fjern medier fra brønnene og legge 5 mL av cF12 som inneholder riktig valg antibiotika i hver brønn. Bruk 0,3 mg/mL hygromycin for pcDNA5TO-basert plasmider og 1 mg/mL geneticin for pcDNA3-basert plasmider.</li>
		<li>Hvis cellene nå mer enn 90% confluency på 24 h bokfører transfection, trypsinize cellene.</li>
		<li>Vask brønner med 1 mL av PBS per brønn, Legg 1 mL av 0,05% trypsin/0.02% EDTA i PBS og ruge for 5-10 minutter til RT. bruke lys mikroskop, kontroller at cellene har frittliggende og stoppe trypsinization ved å legge til 3-4 mL cF12 per brønn.</li>
		<li>Overføre CHO celle suspensjon en 15 mL tube og sentrifuge 300-400 x g for 5 min på 4 ° C eller RT. Fjern nedbryting og re avbryte 10 mL av cF12. Legge til 5 mL av cellen suspensjon per brønn i 6 godt plate. Bruke to brønner for å maksimere avkastningen av transfekterte celler.</li>
		<li>Inkuber 6 godt platene på 37 ° C, 5% CO2. Overvåke celledød og veksten av motstandsdyktig kolonier bruker lys mikroskop. Fjerne media og erstatte den med ferske mediet som inneholder de aktuelle antibiotika etter 4-5 dager eller når betydelige celledød er observert.</li>
		<li>Når motstandsdyktig celler nå mer enn 70% samløpet, trypsinize cellene som beskrevet i trinn 1.2.2 og overføre til en T25 kolbe for ekspansjon. Antibiotika valget tar 1-2 uker.</li>
		<li>Når antibiotika-resistente CHO cellene i T25 kolbe nå 70-80% samløpet, utføre antistoff flekker for å kontrollere cellen overflaten uttrykk for konstruksjoner av interesse. En dag før antistoff flekker, trypsinize cellene som beskrevet i trinn 1.2.2 justere celle konsentrasjonen til 200.000 celler/mL og legge til 1 mL av cellen suspensjon 12 godt plate. For testing av tetracycline-induserbart konstruksjoner, legger du til 50-60 ng/mL av tetracycline. Ruge over natten ved 37 ° C, 5% CO2.</li>
		<li>Bruk cellen skraper koble CHO celler fra bunnen av brønnen. Denne metoden er best å trypsinization, som reduserer risikoen for epitope skade proteolytisk cleavage.</li>
		<li>Overføre den 1 mL av mediet som inneholder CHO cellene slik FACS. Nedspinning 300-400 x g, 4 ° C i 5 min. re suspendere 100 μL anti-HLA antistoff fortynnet i FWB. Inkuber 30 min på 4 ° C på is. Utføre denne flekker med anti-A2 antistoff å oppdage totale A2 cellen overflaten uttrykk nivåer og TCR-lignende antistoffer spesifikke for A2 i kompleks med E183 peptid å oppdage Agonistiske pMHC-jeg celle overflaten uttrykk nivåer.</li>
		<li>Kontrollere MHC uttrykk, FACS-Sorter positiv cellene og opprettholde sorterte cellene i media med antibiotika for å redusere tap av transgene. CHO celler uttrykke Agonistiske pMHC, anbefales enkelt celle sortering for å sikre sammenlignbare Agonistiske pMHC uttrykk med og uten supertransfection med co Agonistiske pMHC. 2-3 uker kreves for CHO cellevekst etter enkeltcelle sorteringen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. HBV-spesifikke CTL-kultur
<ol><li>
Utarbeidelse av PBMCs som forer for HBV-spesifikke menneskelig CTL re stimulering Merk: For A2-E183-spesifikk CTL klone, re stimulering med fersk isolert PBMCs, snarere enn tinte PBMCs, gir de beste resultatene. Forsiktig: Få alle nødvendige etiske godkjenninger før rekruttere frivillige for blod donasjoner. For dette arbeidet, PBMC ble Hentet fra friske frivillige under godkjent av NUS IRB-protokollen. Informert samtykke ble innhentet fra alle givere. Følg alle nødvendige forholdsregler når du arbeider med menneskelig blod å redusere risikoen for overføring av blod båret sykdommer.<ol>
<li>Før du starter, sette sentrifuge temperaturen på 19-20 ° C og Forvarm tetthet gradient (f.eks Ficoll) til RT.</li>
		<li>Legge til rommet tetthet gradert 15 mL til 50 mL tube. Sentrifuger 400 x g i 5 min på 19-20 ° C. Dette er å sikre det er ingen tetthet gradert på siden av røret.</li>
		<li>Samle 20 mL blod fra en frisk frivillige donor gjennom venipuncture. Legge til 15 mL PBS 20 mL blod i en 50 mL tube. Bland ved pipettering opp og ned.</li>
		<li>Sakte, legge til 35 mL blod fortynnet i PBS over de 15 mL tetthet gradert fra trinn 2.1.2. Kontroller at blodet og tetthet graderingen ikke blander. Sentrifuge rør ved 19 ° C, 1200 x g for 20 min med bremser av.</li>
		<li>Fjern ca 70% av plasma laget. Nøye Sug opp laget som inneholder PBMC (skyet laget oppå klart tetthet gradert laget) bruker en Pasteur Pipetter og plasserer den i en ny 50 mL tube.</li>
		<li>Legge til PBS PBMCs å få en 50 mL totalt volum. Sentrifuge rør ved 4 ° C, 300-400 x g for 10 min. forsiktig fjerne nedbryting bruker vakuum aspirator og sterile glass Pasteur pipette, eller av dekantere vin.</li>
		<li>Nytt suspendere cellene i 50 mL av PBS. Sentrifuge rør ved 4 ° C, 300 x g for 10 min. forsiktig fjerne nedbryting bruker vakuum aspirator og sterile glass Pasteur pipette, eller av dekantere vin.</li>
		<li>Nytt suspendere celler i 2 mL komplett human T celle media (serum gratis media med 2% humant serum). Telle celler ved hjelp av hemocytometer. Denne protokollen gir i gjennomsnitt 1-2 x 106 PBMCs per 1 mL blod brukes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
CTL re stimulering med PBMCs som mater celler
	<ol>
<li>Irradiate PBMCs på 30 Gy å hemme spredning svar på etterfølgende stimulering. FORSIKTIG: Sikre tilstrekkelig opplæring og etterlevelse laboratoriet sikkerhetskrav ved bruk av irradiator.</li>
		<li>Nytt avbryte bestrålt PBMCs komplett human T celle medier på 2 x 106 celler/mL. Legge til cytokiner og Lektiner fra Phaseolus vulgaris (PHA) for Sertifikatklareringslisten re stimulering på 2 x konsentrasjon i PBMC suspensjon. Den endelige cytokin og PHA konsentrasjoner er: 20 U/mL rekombinant menneskelige IL-2, 10 ng/mL rekombinant IL-7, 10 ng/mL rekombinant menneskelige IL-15 og 1.5 mg/mL PHA.</li>
		<li>Tine frossen CTL ampullen i en 37 ° C vannbad. Overføre tinte cellene til en 15 mL tube med 10 mL komplett human T celle media. Nedspinning 300-400 x g på 4 ° C for 5 min. forsiktig fjerne nedbryting bruker vakuum aspirator og sterile glass Pasteur pipette, eller av dekantere vin.</li>
		<li>Nytt avbryte CTLer 2 mL komplett human T celle media. Telle celler ved hjelp av hemocytometer. Legge til komplett human T celle media for å innhente celle konsentrasjon av 106 celler/mL.</li>
		<li>I en 24 godt plate, Legg til 0,5 mL bestrålt PBMCs (106 celler) med 2 x cytokines og PHA (trinn 2.2.2) og 0,5 mL sertifikatklareringslister (0,5 x 106 celler) per brønn. Antall brønner brukes, avhenger av antall CTLer eller PBMCs tilgjengelig. Inkuber ved 37 ° C, 5% CO2.</li>
		<li>Etter 4-5 dager, da CTL eksplosjonene er synlig og media blir gult, overføre kulturer til 6 bra plater og supplere første 1 mL volumet med 4 mL komplett human T celle media med 20 U/mL IL-2, 10 ng/mL IL-7 og 10 ng/mL IL-15 (ingen PHA).</li>
		<li>Etter 2-3 dager, overføre kulturer i en MT75 kolbe, legge til 40 mL av komplett human T celle media med cytokiner (trinn 2.2.2, ingen PHA) og kultur i oppreist stilling.</li>
		<li>Opprettholde sertifikatklareringslister i en konsentrasjon av 1-2 x 106 celler/mL ved å legge friske media med cytokiner (trinn 2.2.2, ingen PHA) på et volum for eksisterende kultur volumet på annenhver dag. Sertifikatklareringslister kan brukes i eksperimenter 7-14 dager etter re stimulering.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. T celle aktivering eksperimenter
Merk: En typisk eksperiment krever flere ulike T-RExCHO linjer: untransfected T-REx CHO celler (negativ kontroll), T-REx CHO celler uttrykke ikke-stimulerende pMHC bare (scA2-GAG, negativ kontroll), T-REx CHO celler uttrykke lave mengder Agonistiske pMHC-jeg () scA2-KONV uten tetracycline, eksperimentelle utvalg), T-REx CHO celler uttrykke lave mengder Agonistiske pMHC og store mengder ikke-stimulerende co Agonistiske pMHC (scA2-KONV og scA2-GAG, uten tetracycline, eksperimentelle prøve), og T-REx CHO celler uttrykke store mengder Agonistiske pMHC-jeg scA2-KONV med tetracycline, positiv kontroll), som vist på figur 1 cD.
<ol><li>
Kontaktflate CHO celler som antigen presentere celler
	<ol>
<li>Kultur CHO cellene i MT75 kolbe, som beskrevet i trinn 1.1.1. Bruk celler på 70-90% samløpet for best resultat. En dag før T celle aktivering eksperiment, trypsinize cellene som beskrevet i delen 1.1.2. Etter trypsinization, overføre celle suspensjon i en 15 mL tube, sentrifuge 400 x g for 5 min på 4 ° C eller RT, fjerne nedbryting av pipettering eller dekantere vin.</li>
		<li>Nytt avbryte celle pellet 5 mL av cF12. Telle CHO celler ved hjelp av en hemocytometer.</li>
		<li>Juster til celle konsentrasjonen til 2 x 105/mL bruker cF12. Legge til 50-60 ng/mL av tetracycline til Agonistiske bare prøver for å indusere store mengder Agonistiske pMHC-jeg uttrykk som positive kontroll (figur 1 c). CHO celler vil bosette seg i 15 mL rør, så sørg for å blande dem av pipettering eller vortexing før plating.</li>
		<li>For T celle aktivering analysen, tilsett 100 μL av CHO celle suspensjon per brønn U bunn 96 godt plate, og bruk triplicates per CHO cellen linje. For CHO celle anti-MHC flekker, Legg 1 mL av cellen suspensjon 12 godt platen, og bruke triplicates per celle linje. Ruge over natten ved 37 ° C, 5% CO2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
T celle aktivering analysen Merk: denne T celle aktivering analysen kan samtidig kvantifisering av T celle omfatter degranulering (CD107a flekker, et mål på T celle cytotoksisitet) og cytokin produksjon.<ol>
<li>Dagen før eksperimentet sentrifuge CTLer cellene på 400 x g ved 4 ° C i 5 min og telle bruker hemocytometer å suspendere cellene på 106 celler/mL i komplett human T celle media uten cytokiner eller PHA. Inkuber ved 37 ° C, 5% CO2. Formålet med dette resten trinnet er å redusere CTL følsomhet, som vi har observert maksimum aktivisering svar på lave mengder antigen uten dette trinnet.</li>
		<li>På dagen for eksperimentet sentrifuge T celler på 400 x g ved 4 ° C i 5 min, fjerne nedbryting av dekantere vin eller pipettering og å suspendere cellene i 2 mL komplett serum-frie medier (uten cytokiner eller PHA). Teller live T celler ved hjelp av en hemocytometer, og justere T celle konsentrasjon til 106 levende celler/mL bruker komplett human T celle medier (uten cytokiner eller PHA).</li>
		<li>Legg anti-CD107a antistoff på en 1: 100 fortynning (siste konsentrasjon av 2,5 μg/mL), legge brefeldin A på en 1:1000 fortynning (siste konsentrasjon av 1 μg/mL).</li>
		<li>Fjern medier fra CHO cellene i 96 godt platen aspirating med glass Pasteur pipette eller flicking platen. Per brønn, tilsett 200 μL av T celle suspensjon (0,2 x 106 celler) inneholder anti-CD107a og brefeldin A. co kultur T celler med CHO celler for 3-4 h.</li>
		<li>På slutten av co kultur, utføre farging av T celle-overflate antigen. Nedspinning 96 godt plate på 300-400 x g, 5 min på 4 ° C, og fjern nedbryting av aspirating eller flicking. Legge til 2,5 μL CD3 og 2,5 μL CD8 antistoffer i 50 μL av 0,5% BSA i PBS (flyt vaskebuffer, FWB) per brønn til farging av celle-overflate antigen. Inkuber prøvene på is 30 min i mørket.</li>
		<li>Vask eksempler ved å legge 150 μL av FWB per brønn. Nedspinning 96 godt plate på 300-400 x g, 5 min på 4 ° C, og fjern nedbryting av aspirating eller flicking.</li>
		<li>Utføre fiksering/permeabilization skritt benytter en fiksering/permeabilization kit. Legg 100 µL fiksering/permeabilization løsning (fra fiksering/permeabilization kit) per brønn, blande av pipettering. Ruge på is 20 min.</li>
		<li>Sentrifuge 300-400 x g og 4 ° C i 5 min og fjerne nedbryting av aspirating eller flicking. Tilsett 200 μL 1 x perm/vaskebuffer (fortynne 10 x perm/lager vaskebuffer fra den kit før bruk) per brønn. Gjenta dette trinnet.</li>
		<li>Nytt avbryte celle pellet 50 μL av 1 x perm/vaskebuffer inneholder anti-IFN-γ antistoff på 0,3 μg/mL. Ruge på is 30 min i mørket.</li>
		<li>Tilsett 150 μL av 1 x perm/vaskebuffer. Sentrifuge 300-400 x g for ved 4 ° C i 5 min og fjerne nedbryting av aspirating eller flicking. Legge til 200 μL 1 x perm/vaskebuffer, sentrifuge 300-400 x g til ved 4 ° C i 5 min og fjerne nedbryting av aspirating eller flicking.</li>
		<li>Nytt avbryte hver prøve 200 μL av FWB. Fortsett med flyt cytometric analyse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
CHO celle MHC klasse I flekker Merk: er det viktig å kontrollere scMHC-jeg celle overflaten nivåer på celler brukes på hvert eksperiment, som linjer kan miste transgene uttrykk. Når forbereder 96 godt plate T celle stimulering, sette opp 12 godt plate for CHO celle flekker, som beskrevet i § 3.1.4.<ol>
<li>Bruk cellen skraper koble CHO celler fra bunnen av brønnen. Denne metoden er best å trypsinization, som reduserer risikoen for epitope skade proteolytisk cleavage.</li>
		<li>Overføre den 1 mL av mediet som inneholder CHO cellene til FACS røret. Nedspinning 300-400 x g ved 4 ° C i 5 min. re suspendere 100 μL anti-HLA antistoff fortynnet i FWB. Inkuber i 30 min på 4 ° C på is.<ol>
<li>Utføre denne flekker med anti-A2 antistoff å oppdage totale A2 cellen overflaten uttrykk nivåer og TCR-lignende antistoffer spesifikke for A2 i kompleks med E183 peptid32 å oppdage Agonistiske pMHC-jeg celle overflaten uttrykk nivåer.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Legg 1 mL av FWB hver CHO utvalg, Nedspinning 300-400 x g, 4 ° C, 5 min, og deretter å avbryte prøven 0,3 mL av FWB. Fortsett med flyt cytometri analyse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Presentert protokollen gir et kraftig verktøy for undersøkelse av molekylære interaksjoner i human CD8 + T celle aktivering. Et kritisk punkt for undersøkelse av co-agonism under menneskelige T celle aktivering er kontroll over Agonistiske pMHC celle overflaten uttrykk for å sikre lik Agonistiske pMHC presentasjon på APCs med eller uten co Agonistiske pMHC uttrykk. I eksperimentelle systemet, dette oppnås ved hjelp av en enkelt celle klone uttrykke lave mengder Agonistiske pMHC, etterfulgt av supertransfection med en co Agonistiske pMHC konstruksjon og Agonistiske pMHC kvantifisering bruker TCR-lignende antistoff10, 32. som agonist sc pMHC uttrykk kan endres over tid, er det avgjørende å kvantifisere Agonistiske pMHC overflaten uttrykk på APCs brukt i hvert eksperiment med TCR-lignende antistoffer. Hvis ingen spesifikke TCR-lignende antistoff tilgjengelig, Agonistiske scMHC-jeg kan uttrykkes som fluorescerende protein fusion, og cellen overflaten uttrykket kan deretter kvantifiseres bruke en følsom mikroskopi metode, for eksempel total intern refleksjon fluorescens mikroskopi 35 , 36. videre cellen overflaten uttrykk for co Agonistiske pMHC reduseres over tid på grunn av metylering-avhengige og -uavhengig stanse CMV promoter37, og bør følges med antistoff flekker og flyt cytometri analyse, gjentatte FACS-sortering ved behov. Vi har kultivert CHO celler 5 uker med relativt begrenset tap av sc pMHC uttrykk. Vi anbefaler frysing CHO cellene etter valg/sortering å sikre et pålitelig lager av celler kjent sc MHC-uttrykk.
Flere trinnene presentert protokollene kan endres, avhengig av tilgjengeligheten av utstyr, eller avhengig av den spesifikke forskning mål. For eksempel PBMC spredning potensielle kan bli hemmet (trinn 3.2.1) bruke alternative metoder som ikke krever en gamma (eller X-) irradiator, for eksempel behandling med mitomycin C38. En ikke-enzymatisk celle dissosiasjon buffere som inneholder metall chelater39 kan brukes i stedet for celle skraping i trinn 3.3.1. Videre antigen presentere systemet kan endres for å gjøre det mer egnet for menneskelig CTL kloner uttrykke forskjellige TCRs. CHO celler uttrykke hamster MHC klasse I molekyler, og selv om disse er irrelevant for Sertifikatklareringslisten linjen studert her (figur 2A og Figur 3A, vi observerte ingen T celle Svar å untransfected CHO celler), det er en mulighet at andre menneskelige TCRs kan vise noen xenoreactivity. I at saken, hamster MHC klasse I uttrykk kan reduseres av slå ut hamster β2-microglubulin eller trykk bruker CRISPR/Cas9; eller en menneskelig APC linje kan brukes etter CRISPR/Cas9-mediert β2-microglubulin eller trykk slå ut.
Eksperimentell systemet presenteres her tillater presis kontroll av TCR og CD8 interaksjoner med MHC molekyler presentere forhåndsdefinerte peptider. For eksempel har vi tidligere vist at mutasjoner avskaffe CD8 bindende40 til coagonist pMHC eliminert coagonist-mediert aktivisering ekstrautstyr i murine og menneskelig CD8 + T celler9,10, mens lertid TCR interaksjon med co Agonistiske pMHC hadde ingen effekt på coagonist-mediert aktivisering ekstrautstyr10. Bruk av enkelt kjede MHC konstruksjoner har imidlertid flere begrensninger. For eksempel er det tid og arbeid tidkrevende å teste flere co Agonistiske peptid sekvenser med dette eksperimentelle systemet, fordi dette innebærer generasjon av flere plasmider koding sc MHC med forskjellige peptider, og påfølgende transfections og celle sortering. Tidligere vi brukte murine trykk-mangelfull celle linjen RMA-S for å teste flere co Agonistiske peptider i musen T celle aktivering8,9, men dette var ikke vellykket med trykk-mangelfull menneskelige T2 cellen linje10, mest sannsynlig på grunn av presentasjonen av trykk-uavhengig peptider41. En annen begrensning av vår eksperimentelle systemet er ikke gir en rask metode for å endre mengden co Agonistiske pMHC molekyler for å bestemme kritisk mengden co Agonistiske pMHC for å utløse T celle aktivering. Videre tillater tetracycline-induserbart systemet brukes ikke Serine Agonistiske pMHC antallet på nivå én celle ved å endre tetracycline konsentrasjonen, som varierende tetracycline konsentrasjon endrer andelen HLA-A2 positiv celler, snarere enn HLA-A2 nivåer på per celle-basis. En alternativ tilnærming som vi er nå undersøke å bruke støttes lipid bilayers42, tidligere undersøke co-agonism under murine CD4 + T celle aktivering4 eller perler presenterer fast mengde Agonistiske pMHC i den tilstedeværelsen av varierende mengder co Agonistiske pMHC. Når den brukes sammen med UV-cleavable peptid teknologi4,43, bør disse alternative eksperimentelle systemer tillate rask testing av flere co Agonistiske peptid sekvenser i tillegg til ulike mengder av co Agonistiske pMHC .
Sc MHC teknologien kan være også gjelder for undersøkelse av co-agonism i menneskelige eller murine CD4 T celler, som enkelt kjede klasse II molekylene av MHC presentere forhåndsbestemt peptider har blitt vellykket uttrykt på pattedyr celle overflater44. Videre kan bruk av sc MHC teknologi utvides til undersøkelse av ikke-klassiske MHC molekyler som HLA-E. SC HLA-E har blitt beskrevet før, og dets uttrykk har vist seg å hemme human T celle aktivering45. En annen ikke-klassiske MHC molekyl av interesse er CD1, som presenterer lipider i stedet for peptider46. SC konstruksjoner CD1 tung kjetting og β2-microglobulin har vist seg å bli uttrykt på cellens overflate og binde relevante lipid ligander47. Enkelt kjede MHC teknologi har stort potensial som et forskningsverktøy for å undersøke molekylære interaksjoner i T og NK celle aktivering.

MHC klasse I (MHC-jeg) molekyler presentere kort (8-10 aminosyrer) peptider fra proteiner syntetisert av hver celle. MHC-jeg molekyler på friske celler presentere selv peptider fra endogene proteiner. Viral infeksjon fører til presentasjon av ikke-selv virus-avledet peptider på MHC-jeg, men selv infiserte celler finnes ikke-selv peptider i nærvær av store mengder selv peptid-MHC (pMHC). MHC-jeg er anerkjent av den T-celle reseptoren (TCR) og CD8 co reseptoren på T-celler. TCR forpliktende tilhørighet til peptid pMHC er svært avhengig av en rekke presentert peptider, mens CD8 binding er peptid-uavhengig. TCR binding til ikke-selv Agonistiske pMHC komplekse fører til T celle aktivering og effektor funksjoner. Non-stimulerende selv pMHC komplekser Fremkall ikke T celle aktivering og effektor funksjoner, men kan forbedre T celle Svar å Agonistiske pMHC, gjennom en prosess kalt co-agonism1,2,3. Co-agonism har blitt observert i musen CD4 + T celler4,5,6 samt mus og menneskelige CD8 + T celler7,8,9,10, 11 , 12 , 13. under fysiologiske forhold T celler må anerkjenne begrensede mengder av Agonistiske pMHC på antigen presentere celler (APCs) co-presentere høye nivåer av ikke-stimulerende pMHC komplekser, antyder at co-agonism bidrar til optimal T cellen svar i vivo. Total-celle overflaten MHC, klasse jeg nivåer er ofte downregulated under virusinfeksjoner14 og svulster15. Denne immun evasion strategien reduserer Agonistiske pMHC presentasjon, men også reduserer mengden co Agonistiske pMHC jeg tilgjengelig for T celle aktivering ekstrautstyr. Videre klasse høyt overflaten uttrykk nivåer av MHC I molekylet HLA-C har vist seg å korrelere med forbedret HIV kontroll16, antyder en avgjørende rolle for totalt MHC, klasse jeg uttrykk i T celle aktivering. Til tross for fysiologiske betydningen av co-agonism, er dens molekylær mekanikk fortsatt ufullstendig forstått. Dette skyldes i stor grad tekniske utfordringer eksperimentelt kontrollere mengden presentert co Agonistiske pMHC samtidig Agonistiske pMHC konstant.
Vi utviklet en eksperimentell systemet å undersøke co-agonism under menneskelige CD8 + T celle aktivering ved å uttrykke menneskelige MHC klasse I molekyler presentere forhåndsbestemt peptid som enkelt polypeptid (enkelt kjede MHC-I, figur 1A) i en xenogeneic celle linje9,10. Enkelt kjede (sc) Agonistiske pMHC ble uttrykt under kontroll av tetracycline-induserbart arrangøren i hamster-avledet T-REx CHO cellen linje uttrykke tetracycline repressor; Dette gir svært lav "lekk" uttrykk for sc Agonistiske pMHC i fravær av tetracycline og høy sc Agonistiske pMHC uttrykk etter tillegg av tetracycline (figur 1BC). Sc Agonistiske pMHC-uttrykke T-REx CHO cellene var da supertransfected med ikke-stimulerende, co Agonistiske sc pMHC-jeg under kontroll av en constitutively aktive promoter (figur 1BC). Bruk av dette eksperimentelle systemet tillot oss å sammenligne CD8 + T celle Svar å Agonistiske pMHC i tilstedeværelse eller fravær av høye nivåer av ikke-stimulerende pMHC. Kritisk, siden peptid og MHC-jeg tunge kjeden er covalently koblet i scMHC-jeg format, lar dette introduksjoner av mutasjoner i MHC molekyler presentere forhåndsbestemt peptider. Bruk av scMHC-jeg teknologien dermed tillatt oss å modulere spesielt TCR eller CD8 bindende egenskaper Agonistiske eller co Agonistiske pMHC.
Co-agonism i CD8 + T celle aktivering er observert med renset MHC-jeg komplekser presentere Agonistiske og co Agonistiske peptider i form av heterodimerer11,17 eller presenteres på kvante prikker12,13. Tidlige arbeider på co-agonism i CD8 + T celle aktivering i sammenheng Agonistiske pMHC anerkjennelse på APC brukt TAP2 dårlig linjer som APCs. Trykk kreves for peptid transport fra cytoplasma til det endoplasmatiske retikulum, og trykk-mangel reduserer sterkt utvalget av tilgjengelige MHC klasse-bindende peptider. I fravær av peptider, begynnende komplekset av MHC klasse I tung kjetting og β2- microglobulin er ustabil, noe som resulterer i svært lav MHC-jeg celle overflaten uttrykk. I utgangspunktet avsløre sammenligning av T-celler stimulert med antigen lastet på trykk-nok - mangelfull mus RMA og RMA-S cellelinjer, som APCs, ikke noen bevis for co-agonism under musen T celle aktivering18. Men tillater bruk av dette eksperimentelle systemet ikke presis kontroll over mengden av Agonistiske pMHC presenterte uavhengig av ikke-stimulerende selv pMHC. Videre kan disse to linjer også variere i uttrykk for andre molekyler som modulerer T celle aktivering, som ligander til T celle co-stimulatory eller hemmende reseptorer eller vedheft molekyler.
Deretter utviklet vi en protokoll for lasting TAP2 dårlig RMA-S celler med eksogene peptider tillate presentasjon av en fast mengde Agonistiske pMHC i tilstedeværelse eller fravær av ikke-stimulerende pMHC. Dette ble oppnådd gjennom følgende: inkubasjonstiden for TAP2-mangelfull RMA-S celler ved lavere temperaturer (28 ° C i stedet for den vanlige 37 ° C) for å stabilisere tom MHC klasse I tunge kjede/β2 microglobulin komplekser19; inkubasjon på 28 ° C med eksogene Agonistiske peptid; inkubasjon på 28 ° C i tilstedeværelse eller fravær av eksogene ikke-stimulerende peptid; og inkubasjon på 37 ° C å redusere cellen overflaten uttrykk for tom MHC klasse I komplekser8,9. Bruk av denne eksperimentelle set-up avslørte at tilstedeværelsen av ikke-stimulerende pMHC forbedret aktivering av musen thymocytes, naiv perifere CD8 + T celler og CTLer8. Mechanistically, tilstedeværelse av ikke-stimulerende pMHC kan indusere CD8 rekruttering T celle: APC immun synapse selv i fravær av Agonistiske pMHC, og ikke-stimulerende pMHC kan forbedre TCR interaksjon med CD8 coreceptor7,8. Men tillater dette eksperimentelle systemet ikke teste den relative bidrag av TCR og CD8 coreceptor binding til Agonistiske og co Agonistiske pMHC i formidling aktivisering ekstrautstyr, som endringer endre TCR eller CD8 binding til MHC, klasse jeg ville påvirke alle MHC molekyler, uansett presentert peptid. Vi brukte derfor MHC, klasse jeg single chain teknologi for å løse dette problemet.
Enkelt kjede (sc) MHC klassen jeg format har vært brukt før å forbedre antigen pMHC presentasjon for strategier, og å svare på grunnleggende spørsmål om mekanismer av TCR og NK celle reseptor aktivering og fungerer20,21 . scMHC-jeg består av peptid, β2- microglobulin og MHC-jeg tunge kjeden av to fleksible serine/glycine-rik linkers (figur 1A), flere forskjellige koblingsfunksjonalitet sekvenser har vært utviklet og testet22. scMHC-jeg kan kaste uavhengig av KRANEN komplekse og Anstandsdame proteiner kreves for konvensjonelle pMHC komplekse samlingen20. scMHC-jeg har blitt vist å kaste riktig, som bruker konformasjon-spesifikke antistoffer flekker22 og løse sc struktur med Røntgenkrystallografi23. Den grunnleggende scMHC-jeg design er endret for å forbedre binding av lav affinitet peptider24,25.
Denne protokollen beskriver bruken av menneskelig scMHC-jeg undersøke co-agonism under menneskelige CTL klone aktivisering. Protokollen er optimalisert for menneskelig CTL klone spesifikke for en epitope av hepatitt B-viruset (HBV). HBV er en alvorlig helse lasten over hele verden, som det er 350 millioner mennesker smittet med HBV og kronisk HBV-infeksjon kan føre til utvikling av leverkreft (HCC). HCC celler som følge av HBV-infeksjon kan vanligvis presentere HBV-avledet epitoper og kan bli gjenkjent av spesifikke menneskelig T-celler. HBV og HCC klaring avhengig den menneskelige T celle svar26, men HCC pasienter lider ofte av T celle utmattelse og redusert T celle svar27. Innføring av HBV-spesifikke TCR i T-celler av HBV har vært prøvd som potensielle immunterapi strategi å eliminere kronisk HBV-infeksjon28. Men det er ukjent om denne metoden vil være effektiv i en klinisk setting, på grunn av de lave nivåene av overflaten MHC-I menneskelig hepatocytter29. Derfor kan forstå mekanismen av coagonism gi alternative perspektiver for immunterapi av HBV, muligens ved å forbedre presentasjonen av endogene pMHC å indusere co-agonism-mediert T celle svar. Protokollen dekker alle de nødvendige skritt for forskning på menneskelige co-agonism: hva T-REx CHO celler Agonistiske og co Agonistiske sc pMHC, generasjon av stabil T-REx CHO linjer, HBV-spesifikke menneskelig CTL CD8 + T celle linje og CTL aktivisering eksperimenter kvantifisere cytokin produksjon og omfatter degranulering svar på T-REx CHO celler. Selv om vi fokusere på å bruke sc MHC klasse I teknologien å undersøke co-agonism under HBV T celle aktivering, det må bemerkes at metodene presentert kan lett tilpasses for forskning på andre aspekter av T celle aktivering i human T celle systemer med kjente pMHC-jeg spesifisitet.
Denne protokollen bruker en menneskelig CD8 + CTL linje bestemt HBV-avledet peptid E183-91 (FLLTRILTI: "E183")30 presentert på HLA-A2. SC HLA molekyler som består av et signal fra menneskelige β2-microglobulin, en HLA-A2 bindende peptid av interesse, en glysin/serine linker, en menneskelig β2-microglobulin, et glysin/serine linker og en A2 tunge kjede kan være kommersielt syntetisert (figur 1A ). Plasmider koding scA2 konstruksjoner med Agonistiske E183 peptid eller coagonist HIV KNEBLE (SLYNTVATL)31 peptider er tilgjengelig fra forfatterne på forespørsel. Peptid rekkefølgen kan endres med nettstedet regissert-mutagenese. En tetracycline-induserbart vektor ble pcDNA5/til brukt til å uttrykke Agonistiske enkelt kjeden HLA-A2 med E183 peptid (sc E183-HLA-A2). I nærvær av tetracycline repressor, pcDNA5/plasmider tillater bare svært lav, "lekk" uttrykk av proteinet steder. høy uttrykk kan være forårsaket av tillegg av tetracycline (figur 1BC). Bruk av et tetracycline-induserbart uttrykk system gir kontroll over mengden av cellen overflaten Agonistiske pMHC uttrykk. En grunnleggende uttrykk plasmider pcDNA3.1 ble brukt til å uttrykke coagonist scA2 med GAG peptid (sc GAG-HLA-A2). Tetracycline regulert uttrykket (T-REx) CHO celle (linje hamster cellen, ingen endogene menneskelige MHC) ble brukt til å uttrykke Agonistiske og co Agonistiske sc-HLA-A2 konstruksjoner. Eksperimentell systemet gir presis kontroll over pMHC presentasjon (figur 1 c): ingen pMHC presentasjon (untransfected T-REx), en stor mengde co Agonistiske pMHC presentasjon (konstituerende sc GAG-HLA-A2 uttrykk), lite Agonistiske pMHC presentasjon (sc E183-HLA-A2 i fravær av tetracycline), en stor mengde Agonistiske pMHC presentasjon (sc E183-HLA-A2 i nærvær av tetracycline), lite Agonistiske pMHC presentasjon og høy uttrykk for co Agonistiske pMHC (sc E183-HLA-A2 i den fravær av tetracycline, og konstituerende sc GAG-HLA-A2 uttrykk). Bruk av dette eksperimentelle systemet tillater presis styring av celle overflaten mengder Agonistiske og coagonist pMHC.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aim-V (serum free media)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12055091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blasticidin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm (fixation/permealibisation kit)</td>
			<td>BD</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH3007103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>geneticin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10131035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GolgiPlug (Brefeldin A)</td>
			<td>BD</td>
			<td>555029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hygromycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10687010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (low serum media)</td>
			<td>Bibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 X PBS</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>PB0344 &#8211; 1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>408727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant human IL2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>202-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant human IL7</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>207-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant human IL15</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>247-ILB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetracycline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-REx CHO cell line</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R71807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 x Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BD</td>
			<td>347347</td>
			<td>Clone SK7, RRID:AB_400287</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8&#945;</td>
			<td>BD</td>
			<td>563795</td>
			<td>Clone RPA-T8, RRID:AB_2722501</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD107a</td>
			<td>BD</td>
			<td>566261</td>
			<td>Clone H4A3, RRID:AB_2739639</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-A2</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-9876-41</td>
			<td>Clone BB7.2, RRID:AB_11151522</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-&#947;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-7319-41</td>
			<td>Clone 4S.B3, RRID:AB_1311250</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of single chain mhc technology to investigate co-agonism in human cd8+ t cell activation

Non-stimulerende selv peptid MHC (pMHC) komplekser Fremkall ikke T celle aktivering og effektor funksjoner, men kan forbedre T celle Svar å Agonistiske pMHC, gjennom en prosess kalt co-agonism. Denne protokollen beskriver en eksperimentell systemet å undersøke co-agonism under menneskelige CD8 + T celle aktivering ved å uttrykke menneskelige MHC klasse I molekyler presentere forhåndsbestemt peptider som enkelt polypeptides (enkelt kjede MHC) i en xenogeneic celle linje. Vi uttrykte enkelt kjede MHCs under forhold der lave nivåer av Agonistiske enkelt kjede p-MHC komplekser og høye nivåer av ikke-stimulerende enkelt kjede p-MHC komplekser ble uttrykt. Bruk av dette eksperimentelle systemet tillot oss å sammenligne CD8 + T celle Svar å Agonistiske pMHC i tilstedeværelse eller fravær av ikke-stimulerende pMHC. Protokollen beskriver cellen linje transfection med enkelt kjede MHC konstruerer, generering av stabil linjer, kultur av hepatitt B virus-spesifikke menneskelig CD8 + T-celler og T celle aktivering eksperimenter samtidig kvantifisere cytokiner produksjonen og omfatter degranulering. Presentert metodene kan brukes for forskning på ulike aspekter av CD8 + T celle aktivering i human T celle systemer med kjente peptid MHC spesifisitet.

Sc MHC klasse I teknologi brukes her gir presis styring av celle overflaten uttrykk av MHC, klasse med kjent, covalently koblet peptider å indusere T celle aktivering. Vi har generert en utviklet xenogeneic APC-system (figur 1A, B, C) som tillater presentasjon av lave nivåer av Agonistiske pMHC i tilstedeværelse eller fravær av co Agonistiske pMHC (figur 1 d, E). Kritisk, har vi brukt en TCR-lignende antistoff bestemt HLA-A2 presenterer E183 peptid vise presentasjonen av Agonistiske sc E183-HLA-A2 ikke endres av co uttrykk for co Agonistiske sc GAG-HLA-A2 (figur 1E). Men må det bemerkes at E183-HLA-A2 spesifikke TCR-lignende antistoffer viser noen binde seg til HLA-A2 presentere GAG peptid (figur 1E). Lignende utviklet antigen presentere celle systemer kan konstrueres ved hjelp av ulike peptider eller MHC molekyler for å undersøke molekylær krav til TCR og/eller coreceptor interaksjoner i human T-celler med forskjellige særegenheter.
Vi brukte disse utviklet APCs for å stimulere en E183-HLA-A2-spesifikke menneskelig CD8 + T celle klone. Tre negative kontrollene ble brukt: T celler bare, untransfected T-REx CHO celler og T-REx CHO celler uttrykke store mengder co Agonistiske sc GAG-HLA-A2 å teste for potensielle T celle aktivering av noen molekyler på T-REx CHO celler (untransfected T-REx CHO celler i forhold til T celle bare), og for T celle aktivering av sc-GAG-HLA-A2 (T-REx CHO celler uttrykke høye nivåer av sc-GAG-HLA-A2 sammenlignet med untransfected T-REx CHO celler). Untransfected T-REx CHO celler eller T-REx CHO celler uttrykke sc-GAG-HLA-A2 ikke få aktivering av E183-HLA-A2-spesifikk CD8 + CTL klone, som bestemmes av kvantifisere IFN-γ produksjon og uttrykk for omfatter degranulering markør CD107a som et mål på T celle cytotoksisitet (figur 2AB). Uttrykk for høye nivåer av Agonistiske sc E183-HLA-A2, som positive kontroll, indusert svært effektiv IFN-γ produksjon og omfatter degranulering (figur 2AB), viser at sc HLA-A2 Konstruer kan bli gjenkjent av en bestemt TCR å aktivere T celle funksjoner effektor. Uttrykk for lave nivåer av sc E183-HLA-A2 indusert lavere nivåer av IFN-γ produksjon og omfatter degranulering, og dette ble forsterket av tilstedeværelsen av co Agonistiske sc GAG-HLA-A2 (figur 2AB). Det må bemerkes at svært høye prosenter av CD107a + T celler ble observert selv i respons til lave nivåer av antigen pMHC (figur 2B), forenlig med tidligere rapporter om relativt lave krav for Agonistiske pMHC for induksjon av T celle cytotoksisitet33. CD107a MFI, viser omfatter degranulering på en enkelt celle-basis, gir en bedre dynamisk omfang (figur 2B). T celle aktivering analysen brukes tillater samtidig kvantifisering av to store effektor funksjoner: cytokin produksjon og cytotoksisitet, og gir svært følsomme avlesning god dynamisk rekkevidde.
Vi brukte enkelt kjede teknologien for å teste om TCR binding til co Agonistiske pMHC kreves for co Agonistiske pMHC-avhengige aktivisering ekstrautstyr. Vi muterte Valin posisjonen 152 ytterst HLA-A2 peptid bindende Groove (figur 3B) til Glutaminsyre å opprette V152E mutant, som denne mutasjonen har blitt rapportert å avskaffe TCR binding til HLA-A234. Vi testet om V152E mutasjon kan avskaffe TCR bindende for E183-HLA-A2 CTL klone brukes, ved å innføre denne mutasjonen i Agonistiske sc E183-HLA-A2 og uttrykker mutant Agonistiske sc Konstruer i T-REx CHO celler. Wild type, men ikke V152E, sc E183-HLA-A2 indusert aktivering av E183-HLA-A2-spesifikk CTL klone brukes (figur 3A). Det må bemerkes at noen TCR-bindende mutasjon på MHC, klasse jeg må testes separat for hver individuelle TCR/T celle klone brukes, effekten av mutasjon avhenger presise molekylære samspillet mellom TCR og pMHC komplekse, og dette vil variere mellom forskjellige TCRs. For eksempel vi testet åtte mutasjoner, enten tidligere rapportert TCR-bindende mutasjoner eller mutasjoner spådd for å forstyrre TCR binding uten lertid peptid binding til HLA-A2. Av disse var V152E eneste mutasjon som avskaffet aktivering av E183-spesifikke T celle klone brukt10. Vi introdusert V152E mutasjon i co Agonistiske sc GAG-HLA-A2, og co-uttrykkes WT eller V152E sc GAG-HLA-A2 med lave nivåer av Agonistiske sc E183-HLA-A2. Både WT og V152E sc GAG-HLA-A2 forbedret IFN-γ produksjon og omfatter degranulering (Figur 3 cD), tyder på at TCR binding til co Agonistiske pMHC ikke er nødvendig for co Agonistiske pMHC-avhengige CD8 + T celle aktivering ekstrautstyr. Enkelt kjede MHC klasse I teknologi, som presenteres her, kan brukes til å endre TCR og/eller coreceptor binding til MHC, klasse jeg med kjente peptid undersøke molekylær kravene for T celle antigen anerkjennelse og aktivisering.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59126/59126fig1.jpg"> Figur 1: enkelt kjede HLA-A2 konstruerer brukes til å undersøke co Agonistiske i menneskelig CD8 + T celle aktivering. (A) skjematisk diagram av en scHLA-A2 konstruksjon, bestående av covalently signal rekkefølge fra smeltet menneskelige β2 microglobulin, peptid valg, fleksibel glycine-serine koblingsfunksjonalitet (GGGGSGGGGS GGGGS), menneskelige β2 microglobulin, fleksibel Glycine-serine linker og HLA-A2 tunge kjede. (B) skjematisk diagram av plasmider brukes til å generere utviklet antigen presentere celler for å undersøke co-agonism i menneskelig CD8 + T celle aktivering: tetracycline repressor, Agonistiske sc E183-HLA-A2 under kontroll av tetracycline-induserbart promoter, ikke-stimulerende co Agonistiske sc GAG-HLA-A2 under kontroll constitutively aktive formidler. (C) skjematisk diagram av konstruert antigen presentere celler som brukes til å undersøke co-agonism: T-REx CHO celler (ingen menneskelig MHC uttrykk), T-REx CHO celler uttrykke constitutively høye nivåer av sc GAG-HLA-A2 (ikke-stimulerende co Agonistiske pMHC), T-REx CHO celler uttrykke lave "lekk" nivåer av sc E183-HLA-A2 i fravær av tetracycline (lavt nivå av Agonistiske peptid), celler T-REx CHO celler uttrykke høye nivåer av sc E183-HLA-A2 i nærvær av tetracycline (høy Agonistiske peptid), T-REx CHO uttrykke lave nivåer av sc E183-HLA-A2 og høye nivåer av sc GAG-HLA-A2 (lavt nivå av Agonistiske peptid) og høy co Agonistiske peptid. (D) celle overflaten farging av konstruert antigen presentere cellelinjer med anti-HLA-A2 antistoff. Tallene vises betegne MFI verdier for MHC flekken i levende celle porten. Data representative for 5 uavhengige eksperimenter (E) cellen overflaten farging av konstruert antigen presentere linjer ved hjelp av TCR-lignende antistoffer spesifikke mot HLA-A2 presenterer E183 peptid. Tallene vises betegne MFI verdier for MHC flekken i levende celle porten. Data representant 5 uavhengige eksperimenter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59126/59126fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59126/59126fig2v3.jpg"> Figur 2: tilstedeværelsen av co Agonistiske pMHC forbedret cytokiner produksjonen og omfatter degranulering av E183-HLA-A2-spesifikke menneskelig CD8 + CTL klon. (A) intracellulær IFN-γ farging av HLA-A2-spesifikke menneskelig CD8 + CTL Klon etter 3t stimulering med angitt konstruert antigen presentere celler. Tallene vises betegne prosent positive til IFN-γ farging. Data representant 3 uavhengige eksperimenter, hvert utført med teknisk triplicates. (B) cellen overflaten CD107a farging av HLA-A2-spesifikke menneskelig CD8 + CTL Klon etter 3t stimulering med angitt konstruert antigen presentere celler. Tallene vises betegne prosenten positivt for CD107a flekker eller CD107a MFI for CD8 + T celle befolkningen. Data representant 3 uavhengige eksperimenter, hvert utført med teknisk triplicates. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59126/59126fig2v3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59126/59126fig3.jpg"> Figur 3: co agonist-mediert T celle aktivering ekstrautstyr krever ikke TCR binding til co Agonistiske pMHC kompleks. (A) V152E mutasjon i sc E183-HLA-A2 opphever aktivering av E183-HLA-A2-spesifikke menneskelig CD8 + CTL klone. T-REx CHO celler uttrykke høye nivåer (tetracycline induksjon) av WT eller V152E mutant sc E183-HLA-A2 ble brukt til å stimulere E183-HLA-A2-spesifikke menneskelig CD8 + CTL klone for 3t. T celle aktivering ble kvantifisert bruker intracellulær IFN-γ flekker. Tallene vises betegne prosent positive til IFN-γ farging. Data representant 3 uavhengige eksperimenter, hvert utført med teknisk triplicates. (B) plassering av V152E mutasjon i peptid bindende sporet av HLA-A2. (C) V152E mutasjon på sc GAG-HLA-A2 co Agonistiske pMHC komplekse ikke avskaffe co-agonist-avhengige aktivisering ekstrautstyr. Intracellulær IFN-γ farging av HLA-A2-spesifikke menneskelig CD8 + CTL Klon etter 4t stimulering med angitt konstruert antigen presentere celler. Tallene vises betegne prosent positive til IFN-γ farging. Data representant 3 uavhengige eksperimenter, hvert utført med teknisk triplicates. (D) V152E mutasjon på sc GAG-HLA-A2 co Agonistiske pMHC komplekse ikke avskaffe co-agonist-avhengige aktivisering ekstrautstyr. Celle overflaten CD107a farging av HLA-A2-spesifikke menneskelig CD8 + CTL Klon etter 3t stimulering med angitt konstruert antigen presentere celler. Tallene vises betegne prosenten positivt for CD107a flekker eller CD107a MFI for CD8 + T celle befolkningen. Data representant 3 uavhengige eksperimenter, hvert utført med teknisk triplicates. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59126/59126fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Use of Single Chain MHC Technology to Investigate Co-agonism in Human CD8+ T Cell Activation at JoVE.com

Use of Single Chain MHC Technology to Investigate Co-agonism in Human CD8+ T Cell Activation

Bruk enkelt kjede MHC teknologi å undersøke Co-agonism i menneskelig CD8 + T celle aktivering

Denne protokollen beskriver bruken av enkelt MHC klasse I komplekser undersøke molekylære interaksjoner i human CD8 + T celle aktivering: generasjon utviklet antigen presentere celler uttrykke enkelt kjede konstruerer, kultur for menneskelig CD8 + T celle klone og T celle aktivering eksperimenter.

Non-stimulatory self peptide MHC (pMHC) complexes do not induce T cell activation and effector functions, but can enhance T cell responses to agonist ...

Ikke-stimulerende peptid MHC-komplekser aktiverer ikke T-celler, men kan forbedre T-celleresponsen på agonist peptid MHC. Denne protokollen beskriver et eksperimentelt system for å undersøke koagonisme under menneskelig CD8 T celleaktivering. Vi uttrykker MHC-molekyler som enkjedede komplekser med kovalent koblet tung kjede, beta-2-mikroglobulin og peptidet.Dette gjør det mulig å introdusere mutasjoner i MHC molekyler som presenterer forhåndsbestemte peptider. Denne protokollen bruker human CTN klone, en spesifikk for en epitop av hepatitt B-virus. Forstå mekanismen for co-agonism under T celleresponser mot hepatitt kan bidra til utvikling av immunotropics mot denne virusinfeksjonen.De presenterte metodene kan brukes i forskning og andre grunnleggende aspekter ved T-celleaktivering i humane T-cellesystemer med kjent peptid MHC spesifisitet. Denne protokollen bruker enkjedede humane MHC klasse I molekyler, bestående av signalsekvens, peptid av interesse, linker, human beta-2-microglobulin linker, og MHC tung kjede. E1A3 peptid fra hepatitt B brukes som agonistisk peptid.Gag fra HIV brukes som ikke-stimulerende peptid. De enkjedede humane MHC-molekylene uttrykkes i en hamstercellelinje som inneholder tetracyklinrepressor. Agonist enkjede MHC uttrykkes ved hjelp av tetracyklin-induserbar plasmid, noe som resulterer i svært lave uttrykksnivåer i fravær av tetracyklin og høye uttrykksnivåer i nærvær av tetracyklin.CHO-celler som uttrykker lave nivåer av agonist peptid MHC er transfisert med konstitutivt uttrykt ikke-stimulerende peptid MHC. Bruk av dette eksperimentelle systemet gjør det mulig å sammenligne T-celleresponser på agonist peptid MHC i nærvær eller fravær av ikke-stimulerende peptid MHC. For å starte denne prosedyren, dyrke CHO celler i en T-75 kolbe, som beskrevet i tekstprotokollen.Dagen før T-celleaktiveringseksperimentet vasker du cellene i kolben med PBS. Legg til en løsning som inneholder 05 % trypsin og 2 %EDTA i PBS, og inkuber i fem til ti minutter ved romtemperatur. Ved hjelp av et lett mikroskop, observere cellene for å sikre at de har løsrevet.Deretter legger du til komplett F12 i kolben for å stoppe trypsiniseringen. Overfør cellefjæringen til et 15 milliliter rør. Sentrifuge ved 400G i fem minutter, og fjern supernatanten ved enten pipettering eller dekantering.Re-suspendere cellepellet i fem milliliter av komplett F12. Bruk et hemocytometer for å telle cellene, og juster cellekonsentrasjonen til 200 000 celler per milliliter i CF12. Tilsett 50 til 60 nanogram per milliliter tetracyklin til de agonistiske prøvene for å indusere store mengder agonist pMHC klasse I uttrykk som en positiv kontroll.Etter dette, bland CHO-cellene enten ved vortexing eller pipettering. Tilsett 100 mikroliter av cellefjæringen til hver brønn av en U-bunn 96-brønnsplate. Inkuber over natten ved 37 grader Celsius med 5%karbondioksid.Dagen før eksperimentet sentrifuge CTLS celler på 400 ganger G og på fire grader Celsius i fem minutter. Bruk et hemocytometer for å telle cellene, og re-suspendere dem med en tetthet på en million celler per milliliter i komplette humane T-cellemedier uten cytokiner eller PHA. Inkuber CTLene over natten ved 37 grader Celsius med 5%karbondioksid.Neste dag sentrifuger T-cellene ved 400 ganger G og ved fire grader Celsius i fem minutter. Kast det overnaturlige, og suspender cellene på en ny i 2 milliliter med komplett serumfritt medium. Bruk et hemocytometer for å telle T-cellene, og juster tettheten til en million levende celler per milliliter i komplette humane T-cellemedier.Tilsett anti-menneskelig CD107a antistoff på en en til 100 fortynning, og Brefeldin A på en en til 1000 fortynning. Deretter henter du 96-brønnsplaten som inneholder CHO-cellene. Ved hjelp av et glass Pasteur pipette, aspirere media fra CHO cellene.Tilsett 200 mikroliter av T-cellefjæringen til hver brønn. Co-kultur T-cellene med CHO celler på 37 grader Celsius med 5% karbondioksid i tre til fire timer. På slutten av co-kulturen, sentrifugere 96-brønnsplaten på 400 ganger G og fire grader Celsius i fem minutter.Fjern det overnaturlige ved å aspirere eller sveipe. Tilsett deretter 2,5 mikroliter CD3-antistoffer og 2,5 mikroliter CD8-antistoffer i 50 mikroliter på 5 % BSA i PBS til hver brønn, for celleoverflateantigenfarging, og bland ved pipettering. Inkuber prøvene i mørket, og på is, i 30 minutter.Etter dette legger du til 150 mikroliter vaskebuffer til hver brønn for å vaske prøvene. Sentrifuger prøvene ved 400 ganger G og ved fire grader Celsius i fem minutter. Fjern det overnaturlige ved å aspirere eller sveipe.Sett ut et fikserings-/permeabiliseringssett, og legg til 100 mikroliter fikserings-/permeabiliseringsløsning til hver brønn, og pipette å blande. Inkuber på is i 20 minutter. Deretter sentrifuger platen ved 400 ganger G ved fire grader Celsius i fem minutter.Kast det supernaturlige og tilsett 200 mikroliter 1X perm / vaskebuffer til hver brønn. Gjenta denne prosessen fra sentrifugering til å legge til perm / vaskbufferen en gang. Etter dette, re-suspendere cellene i 50 mikroliter perm / vask buffer som inneholder anti-interferon-gamma i en konsentrasjon på 3 mikrogram per milliliter.Inkuber på is i mørket i 30 minutter. Deretter legger du til 150 mikroliter 1X perm / vaskebuffer. Sentrifuge på 400G, fire grader Celsius, i fem minutter.Fjern supernatanten og tilsett 200 mikroliter 1X perm/vaskebuffer. Sentrifuger platen igjen ved 400 ganger G, fire grader Celsius, i fem minutter, og fjern supernatanten ved å aspirere eller knipse. Suspender prøven på igjen i 200 mikroliter vaskebuffer og fortsett med cytometrisk analyse.En dag før eksperimentet, bland CHO-cellene enten ved vortexing eller pipettering. Deretter legger du til en milliliter cellefjæring til hver brønn på en 12-brønns plate. Inkuber over natten ved 37 grader Celsius med 5%karbondioksid.På dagen for eksperimentet, bruk en celleskraper for å løsne CHO-cellene fra bunnen av hver brønn. Overfør en milliliter medier som inneholder cellene fra hver brønn til FACS-rør. Sentrifuge ved 400 ganger G og ved fire grader Celsius i fem minutter.Re-suspendere i 100 mikroliter anti-HLA antistoff fortynnet i vaskebuffer. Inkuber på is i 30 minutter. Tilsett deretter en milliliter vaskebuffer i hver CHO-prøve.Sentrifuge ved 400 ganger G og ved fire grader Celsius i fem minutter, og kast supernatanten. Re-suspendere hver prøve i 3 milliliter vaskebuffer, og fortsett å flyte cytometri analyse. I denne studien presenteres et robust verktøy for undersøkelse av molekylær interaksjon under menneskelig CD8 positiv T-celleaktivering.Et konstruert xenogent system genereres som presenterer lave nivåer av agonist pMHC i nærvær eller fravær av co-agonist pMHC. Disse konstruerte APCene brukes deretter til å stimulere en E183-spesifikk menneskelig CD8 positiv T-celleklone. Uover infiserte CHO-celler og CHO-celler som uttrykker det ikke-stimulerende, enkeltkjedede Gag-MHC-komplekset, induserer ikke aktivering.Uttrykk for høye nivåer av det agonistiske enkeltkjedede E183-MHC-komplekset, som er den positive kontrollen, anses å indusere svært effektiv interferon-gammaproduksjon, og degranulering, som viser at enkeltkjedet E183-konstruksjon kan gjenkjennes av en bestemt TCR for å aktivere T-celleeffektorfunksjoner. Uttrykk for lave nivåer av enkjedet E183-MHC-kompleks induserer lavere nivåer av interferon-gammaproduksjon og degranulering, som ble forbedret ved tilstedeværelse av et ikke-stimulerende Gag-MHC-kompleks. Merk at svært høye prosentandeler av CD107a + T-celler observeres selv som svar på lave nivåer av antigen pMHC, som er i samsvar med tidligere studier.Tilstedeværelse av ikke-stimulerende Gag-MHC kompleks øker imidlertid CD107a MFI. Under denne prosedyren er det avgjørende å kontrollere agonist peptid MHC uttrykk for å sikre lik agonistisk presentasjon med eller uten ikke-stimulerende peptid. Det er viktig å kvantifisere agonist peptid MHC uttrykk ved hjelp av TCR-lignende antistoffer i hvert eksperiment.En alternativ tilnærming er å bruke støttede lipid bilayers, eller perler, presentere fast mengde agonist peptid MHC i nærvær av ikke-stimulerende peptid MHC. De eksperimentelle systemet bør tillate testing av flere ikke-stimulerende peptid sekvenser for co-agonism. Den enkjedede MHC-teknologien kan brukes til å undersøke molekylære interaksjoner i CD4 T-celleaktivering, samt for å undersøke ikke-klassiske MHC-molekyler.Denne protokollen bruker menneskelig blod og menneskelige celler. Følg alle nødvendige forholdsregler når du arbeider med menneskelig blod for å redusere risikoen for overføring av blodbårne sykdommer.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Use of Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Bruk av Interferon-γ Enzyme-linked Immunospot Assay å karakterisere Novel T-celle epitoper av humant papillomavirus

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induksjon av transplantat-mot-vert-sykdom og<em&gt; In Vivo</em&gt; T Cell overvåking ved hjelp av en MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac transposon System Endring av primære humane T celler

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

Bruk av Fluorescent måloppstill for Vurdering av Cell Responses T<em&gt; In vivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flowcytometrisk analyse av Natural Killer Cell Lytisk aktivitet i humant fullblod

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Analyse av Simian Immunodeficiency Virus-spesifikke CD8<sup&gt; +</sup&gt; T-celler i rhesusape av Peptide-MHC-I Tetramer Farging

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Meget multiplexert, superoppløselig bildebehandling av T-celler ved hjelp av madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

In Situ MHC-tetramer flekker og kvantitativ analyse for å fastslå plasseringen, overflod og fenotypen av Antigen-spesifikke CD8 T celler i vev

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...