Ikke-stimulerende peptid MHC-komplekser aktiverer ikke T-celler, men kan forbedre T-celleresponsen på agonist peptid MHC. Denne protokollen beskriver et eksperimentelt system for å undersøke koagonisme under menneskelig CD8 T celleaktivering. Vi uttrykker MHC-molekyler som enkjedede komplekser med kovalent koblet tung kjede, beta-2-mikroglobulin og peptidet.
Dette gjør det mulig å introdusere mutasjoner i MHC molekyler som presenterer forhåndsbestemte peptider. Denne protokollen bruker human CTN klone, en spesifikk for en epitop av hepatitt B-virus. Forstå mekanismen for co-agonism under T celleresponser mot hepatitt kan bidra til utvikling av immunotropics mot denne virusinfeksjonen.
De presenterte metodene kan brukes i forskning og andre grunnleggende aspekter ved T-celleaktivering i humane T-cellesystemer med kjent peptid MHC spesifisitet. Denne protokollen bruker enkjedede humane MHC klasse I molekyler, bestående av signalsekvens, peptid av interesse, linker, human beta-2-microglobulin linker, og MHC tung kjede. E1A3 peptid fra hepatitt B brukes som agonistisk peptid.
Gag fra HIV brukes som ikke-stimulerende peptid. De enkjedede humane MHC-molekylene uttrykkes i en hamstercellelinje som inneholder tetracyklinrepressor. Agonist enkjede MHC uttrykkes ved hjelp av tetracyklin-induserbar plasmid, noe som resulterer i svært lave uttrykksnivåer i fravær av tetracyklin og høye uttrykksnivåer i nærvær av tetracyklin.
CHO-celler som uttrykker lave nivåer av agonist peptid MHC er transfisert med konstitutivt uttrykt ikke-stimulerende peptid MHC. Bruk av dette eksperimentelle systemet gjør det mulig å sammenligne T-celleresponser på agonist peptid MHC i nærvær eller fravær av ikke-stimulerende peptid MHC. For å starte denne prosedyren, dyrke CHO celler i en T-75 kolbe, som beskrevet i tekstprotokollen.
Dagen før T-celleaktiveringseksperimentet vasker du cellene i kolben med PBS. Legg til en løsning som inneholder 05 % trypsin og 2 %EDTA i PBS, og inkuber i fem til ti minutter ved romtemperatur. Ved hjelp av et lett mikroskop, observere cellene for å sikre at de har løsrevet.
Deretter legger du til komplett F12 i kolben for å stoppe trypsiniseringen. Overfør cellefjæringen til et 15 milliliter rør. Sentrifuge ved 400G i fem minutter, og fjern supernatanten ved enten pipettering eller dekantering.
Re-suspendere cellepellet i fem milliliter av komplett F12. Bruk et hemocytometer for å telle cellene, og juster cellekonsentrasjonen til 200 000 celler per milliliter i CF12. Tilsett 50 til 60 nanogram per milliliter tetracyklin til de agonistiske prøvene for å indusere store mengder agonist pMHC klasse I uttrykk som en positiv kontroll.
Etter dette, bland CHO-cellene enten ved vortexing eller pipettering. Tilsett 100 mikroliter av cellefjæringen til hver brønn av en U-bunn 96-brønnsplate. Inkuber over natten ved 37 grader Celsius med 5%karbondioksid.
Dagen før eksperimentet sentrifuge CTLS celler på 400 ganger G og på fire grader Celsius i fem minutter. Bruk et hemocytometer for å telle cellene, og re-suspendere dem med en tetthet på en million celler per milliliter i komplette humane T-cellemedier uten cytokiner eller PHA. Inkuber CTLene over natten ved 37 grader Celsius med 5%karbondioksid.
Neste dag sentrifuger T-cellene ved 400 ganger G og ved fire grader Celsius i fem minutter. Kast det overnaturlige, og suspender cellene på en ny i 2 milliliter med komplett serumfritt medium. Bruk et hemocytometer for å telle T-cellene, og juster tettheten til en million levende celler per milliliter i komplette humane T-cellemedier.
Tilsett anti-menneskelig CD107a antistoff på en en til 100 fortynning, og Brefeldin A på en en til 1000 fortynning. Deretter henter du 96-brønnsplaten som inneholder CHO-cellene. Ved hjelp av et glass Pasteur pipette, aspirere media fra CHO cellene.
Tilsett 200 mikroliter av T-cellefjæringen til hver brønn. Co-kultur T-cellene med CHO celler på 37 grader Celsius med 5% karbondioksid i tre til fire timer. På slutten av co-kulturen, sentrifugere 96-brønnsplaten på 400 ganger G og fire grader Celsius i fem minutter.
Fjern det overnaturlige ved å aspirere eller sveipe. Tilsett deretter 2,5 mikroliter CD3-antistoffer og 2,5 mikroliter CD8-antistoffer i 50 mikroliter på 5 % BSA i PBS til hver brønn, for celleoverflateantigenfarging, og bland ved pipettering. Inkuber prøvene i mørket, og på is, i 30 minutter.
Etter dette legger du til 150 mikroliter vaskebuffer til hver brønn for å vaske prøvene. Sentrifuger prøvene ved 400 ganger G og ved fire grader Celsius i fem minutter. Fjern det overnaturlige ved å aspirere eller sveipe.
Sett ut et fikserings-/permeabiliseringssett, og legg til 100 mikroliter fikserings-/permeabiliseringsløsning til hver brønn, og pipette å blande. Inkuber på is i 20 minutter. Deretter sentrifuger platen ved 400 ganger G ved fire grader Celsius i fem minutter.
Kast det supernaturlige og tilsett 200 mikroliter 1X perm / vaskebuffer til hver brønn. Gjenta denne prosessen fra sentrifugering til å legge til perm / vaskbufferen en gang. Etter dette, re-suspendere cellene i 50 mikroliter perm / vask buffer som inneholder anti-interferon-gamma i en konsentrasjon på 3 mikrogram per milliliter.
Inkuber på is i mørket i 30 minutter. Deretter legger du til 150 mikroliter 1X perm / vaskebuffer. Sentrifuge på 400G, fire grader Celsius, i fem minutter.
Fjern supernatanten og tilsett 200 mikroliter 1X perm/vaskebuffer. Sentrifuger platen igjen ved 400 ganger G, fire grader Celsius, i fem minutter, og fjern supernatanten ved å aspirere eller knipse. Suspender prøven på igjen i 200 mikroliter vaskebuffer og fortsett med cytometrisk analyse.
En dag før eksperimentet, bland CHO-cellene enten ved vortexing eller pipettering. Deretter legger du til en milliliter cellefjæring til hver brønn på en 12-brønns plate. Inkuber over natten ved 37 grader Celsius med 5%karbondioksid.
På dagen for eksperimentet, bruk en celleskraper for å løsne CHO-cellene fra bunnen av hver brønn. Overfør en milliliter medier som inneholder cellene fra hver brønn til FACS-rør. Sentrifuge ved 400 ganger G og ved fire grader Celsius i fem minutter.
Re-suspendere i 100 mikroliter anti-HLA antistoff fortynnet i vaskebuffer. Inkuber på is i 30 minutter. Tilsett deretter en milliliter vaskebuffer i hver CHO-prøve.
Sentrifuge ved 400 ganger G og ved fire grader Celsius i fem minutter, og kast supernatanten. Re-suspendere hver prøve i 3 milliliter vaskebuffer, og fortsett å flyte cytometri analyse. I denne studien presenteres et robust verktøy for undersøkelse av molekylær interaksjon under menneskelig CD8 positiv T-celleaktivering.
Et konstruert xenogent system genereres som presenterer lave nivåer av agonist pMHC i nærvær eller fravær av co-agonist pMHC. Disse konstruerte APCene brukes deretter til å stimulere en E183-spesifikk menneskelig CD8 positiv T-celleklone. Uover infiserte CHO-celler og CHO-celler som uttrykker det ikke-stimulerende, enkeltkjedede Gag-MHC-komplekset, induserer ikke aktivering.
Uttrykk for høye nivåer av det agonistiske enkeltkjedede E183-MHC-komplekset, som er den positive kontrollen, anses å indusere svært effektiv interferon-gammaproduksjon, og degranulering, som viser at enkeltkjedet E183-konstruksjon kan gjenkjennes av en bestemt TCR for å aktivere T-celleeffektorfunksjoner. Uttrykk for lave nivåer av enkjedet E183-MHC-kompleks induserer lavere nivåer av interferon-gammaproduksjon og degranulering, som ble forbedret ved tilstedeværelse av et ikke-stimulerende Gag-MHC-kompleks. Merk at svært høye prosentandeler av CD107a + T-celler observeres selv som svar på lave nivåer av antigen pMHC, som er i samsvar med tidligere studier.
Tilstedeværelse av ikke-stimulerende Gag-MHC kompleks øker imidlertid CD107a MFI. Under denne prosedyren er det avgjørende å kontrollere agonist peptid MHC uttrykk for å sikre lik agonistisk presentasjon med eller uten ikke-stimulerende peptid. Det er viktig å kvantifisere agonist peptid MHC uttrykk ved hjelp av TCR-lignende antistoffer i hvert eksperiment.
En alternativ tilnærming er å bruke støttede lipid bilayers, eller perler, presentere fast mengde agonist peptid MHC i nærvær av ikke-stimulerende peptid MHC. De eksperimentelle systemet bør tillate testing av flere ikke-stimulerende peptid sekvenser for co-agonism. Den enkjedede MHC-teknologien kan brukes til å undersøke molekylære interaksjoner i CD4 T-celleaktivering, samt for å undersøke ikke-klassiske MHC-molekyler.
Denne protokollen bruker menneskelig blod og menneskelige celler. Følg alle nødvendige forholdsregler når du arbeider med menneskelig blod for å redusere risikoen for overføring av blodbårne sykdommer.
