Name: use of single chain mhc technology to investigate co-agonism in human cd8+ t cell activation
Uploaded: 2019-02-28T15:00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Single Chain MHC Technology to Investigate Co-agonism in Human CD8+ T Cell Activation at JoVE.com

Это исследование было поддержано Министерством здравоохранения Сингапура Национальный совет медицинских исследований под его CBRG/0064/2014 до N.R.J.G., на создание под ее R571-002-012-592 абстрагироваться., Национальный исследовательский фонд Investigatorship R571-000-272-281 чтобы абстрагироваться . и премию следователь трансляционного исследования (звезда) Сингапур (NMRC/звезда/013/2012) для а.б. Мы благодарны д-р Пол Хатчинсон и г-н Тео Guo Хуэй из основного потока NUS иммунологии программы фонда для сортировки клеток экспертов. Мы благодарны Чэнь Elijah для критических чтении рукописи.

Авторы заявляют не конкурирующие интересы.

Представленные протокол обеспечивает надежный инструмент для изучения молекулярных взаимодействий во время активации клеток человека CD8 + T. Важным шагом для расследования co агонизмом во время активации клеток человека T является контроль над агонист реализует клеток поверхности выражение для обеспечения равных агонист реализует презентации на БТР с или без совместного агонист реализует выражение. В нашей экспериментальной системы, это достигается с помощью одной ячейки клонов, выражая низкого количества реализует агонист, а затем supertransfection с совместного агонист реализует конструкцию и агонист реализует количественной оценки с использованием антител TCR-как10, 32. как агониста sc реализует выражение может меняться со временем, важно определить количественно агонист реализует поверхности выражение на БТР, используемых в каждом эксперименте с использованием антител TCR-как. Если доступен не конкретные TCR-как антитела, агонист scMHC-я может быть выражено как флуоресцентный белок fusion, и его выражение поверхности клетки затем могут быть количественно с помощью метода чувствительных микроскопии, такие как полное внутреннее отражение микроскопии флуоресцирования 35 , 36. Кроме того, клетки поверхности выражение реализует совместное агонист уменьшается со временем, благодаря Метилировани зависимых и - независимый глушителей ЦМВ промоутер37и должны контролироваться с помощью антитело пятная и потока цитометрии анализа, с неоднократные СУИМ сортировка при необходимости. Мы культивируемых клеток Чо на срок до 5 недель с относительно ограниченной потерей sc реализует выражение. Мы настоятельно рекомендуем, замораживания Чо клетки вскоре после выбора/Сортировка обеспечить надежный запас клеток с известными sc MHC выражение.
Несколько шагов представленных протоколов можно изменить, в зависимости от наличия оборудования, или в зависимости от конкретных научно-исследовательских целей. Например, КСДОР распространения потенциал может быть ингибированный (шаг 3.2.1), с использованием альтернативных методов, которые не требуют гамма (или X-) облучатель, например лечение с митомицин C38. Буферы диссоциации неферментативного ячейки, содержащие металл хелаторов39 может использоваться вместо клеток, соскоб на шаге 3.3.1. Кроме того, антиген представляющих системы могут быть изменены, чтобы сделать его более подходящим для человеческих клонов CTL, выражая различные TCRs. Чо клетки Экспресс хомяка MHC I класса молекул, и хотя эти значения для линии CTL, учился здесь (рисунок 2A и На рисунке 3A, мы наблюдали нет Т-клеток ответов на untransfected Чо клетки), существует возможность, что другие человеческие TCRs может показать некоторые xenoreactivity. В случае, хомяк MHC I класса выражение может быть уменьшена путем стучать вне хомяка β2-microglubulin или КОСНИТЕСЬ помощью ТРИФОСФАТЫ/Cas9; или человеческой линии APC может использоваться после ТРИФОСФАТЫ/Cas9-опосредованной β2-microglubulin или КОСНИТЕСЬ выбить.
Экспериментальная система, представленная здесь позволяет точное управление TCR и CD8 взаимодействия с молекулами MHC, представляя предопределенных пептиды. Например мы ранее показали, что мутации, отмены привязки CD840 до coagonist реализует ликвидировать coagonist опосредованной активации расширения в мышиных и человеческого CD8 + T клетки9,10, тогда как отмены TCR взаимодействие с совместного агонист реализует было не влияет на повышение coagonist опосредованной активации10. Однако использование единой цепи MHC конструкций имеет ряд ограничений. К примеру пришло время и трудоемкость для тестирования нескольких совместно агонист пептид последовательностей с помощью этой экспериментальной системы, как это предполагает поколения несколько плазмидов кодирования sc MHC с различных пептидов и последующей transfections и сортировки клеток. Ранее мы использовали мышиных TAP-недостаточным клеточная линия RMA-S для проверки нескольких совместно агонист пептидов в мыши Т-клеток активации8,9, но этот подход не был успешным с TAP-недостаточным человека T2 клеток линии10, скорее из-за представление TAP-независимые пептиды41. Еще одно ограничение нашей экспериментальной системы является не обеспечивает быстрый метод для изменения количества молекул реализует совместное агониста для целей определения критических количество реализует совместное агонист, необходимых для запуска активации Т-клеток. Кроме того тетрациклин индуцибельной система, используемая не позволяют титрования агониста реализует количество на уровне отдельной ячейки путем изменения концентрации тетрациклинов, как различной концентрации тетрациклинов изменяет доли положительных клеток HLA-A2, Вместо того чтобы HLA-A2 уровнях на основе за клеток. Альтернативный подход, который мы изучаем в настоящее время является использование поддерживаемых липидных бислоев42, ранее использовались для изучения co агонизмом во время активации клеток мышиных CD4 + T4 или бисер представляет фиксированное количество агонист реализует в наличие различную реализует совместное агониста. При использовании в сочетании с УФ горные пептид технология4,43, этих альтернативных экспериментальных систем должно позволить быстро тестирование нескольких совместно агонист пептида последовательности, а также различное количество совместно агонист реализует .
Sc MHC технология может быть также применимо к расследованию co агонизмом в человека или мышиных CD4 Т-клеток, как единая цепь MHC класса II молекул представляя предопределены пептиды были успешно выразили на поверхности клеток млекопитающих44. Кроме того использование технологии sc MHC может быть расширен для расследования неклассических MHC молекул, таких как HLA-E. SC HLA-E было описано ранее, и его выражение было показано, что подавляют активацию клеток человека Т45. CD1, который представляет липиды вместо пептиды46другой неклассических MHC молекулы интерес. SC конструкции, состоящей из тяжёлой цепи CD1 и β2-МИКРОГЛОБУЛИНА было показано выражаться на поверхности клеток и для связывания соответствующих липидов лигандов47. Одной цепи MHC технологии обладает большим потенциалом как средство исследования для изучения молекулярных взаимодействий во время активации T и NK клеток.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aim-V (serum free media)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12055091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blasticidin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm (fixation/permealibisation kit)</td>
			<td>BD</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH3007103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>geneticin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10131035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GolgiPlug (Brefeldin A)</td>
			<td>BD</td>
			<td>555029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hygromycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10687010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (low serum media)</td>
			<td>Bibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 X PBS</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>PB0344 &#8211; 1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>408727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant human IL2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>202-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant human IL7</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>207-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant human IL15</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>247-ILB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetracycline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-REx CHO cell line</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R71807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 x Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BD</td>
			<td>347347</td>
			<td>Clone SK7, RRID:AB_400287</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8&#945;</td>
			<td>BD</td>
			<td>563795</td>
			<td>Clone RPA-T8, RRID:AB_2722501</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD107a</td>
			<td>BD</td>
			<td>566261</td>
			<td>Clone H4A3, RRID:AB_2739639</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-A2</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-9876-41</td>
			<td>Clone BB7.2, RRID:AB_11151522</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-&#947;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-7319-41</td>
			<td>Clone 4S.B3, RRID:AB_1311250</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of single chain mhc technology to investigate co-agonism in human cd8+ t cell activation

Non стимулирующее самостоятельной пептидных комплексов MHC (реализует) не вызывают функции активации и эффекторных клеток T, но может повысить Т-клеток ответов реализует агонист, через процесс называется co агонизмом. Этот протокол описывает экспериментальной системы расследования co агонизмом во время активации клеток человека CD8 + T, выразив человека MHC I класса молекул, представив заранее пептидов как сингл полипептидов (одной цепи MHC) в линии культивированная клетки. Мы выразили единую цепь MHCs в условиях, где низкий уровень агонист единой цепи p-MHC комплексов и высокий уровень не стимулирующее одной цепи p-MHC комплексов были выражены. Использование этой экспериментальной системы позволило нам сравнить CD8 + Т-клеток ответов агонист реализует в наличие или отсутствие не стимулирующее реализует. Протокол описывает transfection клетки линии с одной цепи MHC конструкциями, поколение стабильной клеток линии, культуры клеток человека CD8 + T гепатитом вирус специфических и активация Т-клеток экспериментов одновременно количественного определения производство цитокинов и дегрануляции. Представленные методы могут использоваться для проведения исследований по различным аспектам CD8 + Т-клеток активации в системах человека Т-клеток с известных пептид MHC специфичности.

Гистосовместимости технологии используются здесь sc позволяет точный контроль поверхности выражения ячейки MHC класса I с известными, ковалентно связанного пептиды, чтобы побудить активация Т-клеток. Мы породили инженерии культивированная APC системы (рис. 1A, B, C), позволяющий презентация низкий уровень агонист реализует в присутствии или отсутствии реализует совместное агонистов (рис. 1 d, E). Критически мы использовали TCR-как антитела специфические для HLA-A2, представляя Е183 пептид чтобы показать, что презентация агонист sc, которую Е183-HLA-A2 не изменено выражением Сопредседатель Сопредседатель агонист sc кляп-HLA-A2 (Рисунок 1E). Необходимо, однако, отметить, что конкретные TCR-как антитела Е183-HLA-A2 показывает некоторые привязки к HLA-A2, представляющие кляп пептида (Рисунок 1E). Подобные инженерии антиген представляющих клеток систем могут быть построены с использованием различных пептидов или MHC молекулы для изучения молекулярных требования к TCR и/или coreceptor взаимодействий в клетках человека T с различными особенностями.
Мы использовали эти инженерии АСУТП для стимулирования Е183-HLA-A2-определенного человека CD8 + Т-клеток клон. Были использованы три негативный контроль: T клетки только, untransfected T-REx Чо клетки и клетки T-REx Чо, выражая большое количество совместно агонист sc кляп-HLA-A2 для проверки потенциальных T Сотовый активации любой молекул, выраженные на клетки T-REx Чо (untransfected T-REx Чо клетки, по сравнению с Т-клеток) и для активации клеток T, sc кляп-HLA-A2 (T-REx Чо клетки, выражая высокий уровень sc кляп-HLA-A2 по сравнению с untransfected клеток T-REx CHO). Untransfected T-REx Чо клетки или клетки T-REx Чо, выражая sc кляп-HLA-A2 не побудить активации Е183 HLA-A2-специфичные CD8 + CTL клона, как определяется количественного производства ИФН γ и выражения дегрануляции маркера CD107a как мера Т-клеток цитотоксичность (рисунок 2AB). Проявление высокого уровня агонист sc Е183-HLA-A2, используется как положительный контроль, индуцированная очень эффективное производство ИФН γ и дегрануляции (Рисунок 2аБ), демонстрируя, что sc HLA-A2 конструкции могут быть признаны конкретные TCR активировать Т-клеток эффекторных функций. Выражение низкий уровень sc Е183-HLA-A2 индуцированной более низкие уровни ИФН γ производства и дегрануляции, и это способствовало присутствие Сопредседатель агонист sc кляп-HLA-A2 (рисунок 2AB). Необходимо отметить, что весьма высокий процент CD107a + Т-клеток наблюдалось даже в ответ на низкий уровень антигенных реализует (Рисунок 2Б), в соответствии с предыдущими докладами относительно низкие требования на сумму агонист реализует для индукции клетки T цитотоксичность33. МФО CD107a, указывающий количество дегрануляции на основе одной ячейки, обеспечивает лучше динамический диапазон (рис. 2B). Assay активация Т-клеток используется позволяет одновременное количественная оценка двух основных эффекторных функций: цитокина производства и цитотоксичность и обеспечивает очень чувствительной индикация с хорошим динамическим диапазоном.
Мы использовали технологию единая цепь для проверки ли TCR привязка реализует совместное агонист требуется для совместного агонист реализует зависимой активации расширения. Мы мутировал валин в позиции 152 на краю HLA-A2 пептид привязки паз (рис. 3B) глутаминовая кислота для создания V152E мутант, как эта мутация уже сообщалось об отмене привязки TCR HLA-А234. Затем мы тестировали, если V152E мутация может отменить TCR привязки для CTL Е183-HLA-A2 клон используется, представляя такой мутации в агонист sc Е183-HLA-A2 и выражая мутант агонист sc конструкции в клетки T-REx Чо. Дикого типа, но не V152E, sc Е183-HLA-A2 индуцированной активации CTL Е183-HLA-A2-определенного клона используется (рис. 3A). Необходимо отметить, что любой TCR-привязки мутации на MHC класса я должен испытываться отдельно для каждого индивидуального клона клеток TCR/T используется, как эффект мутаций будет зависеть от точной молекулярных взаимодействий между TCR и реализует комплекс, и они будут отличаться между различные TCRs. К примеру мы протестировали восемь мутации, либо сообщалось ранее TCR-привязки мутации или мутации, предсказал сорвать TCR привязки без отмены привязки пептида в HLA-A2. Из них V152E был единственным мутации, которая отменили активации Е183 специфичных Т-клеток клона используется10. Мы затем представил V152E мутации в совместное агонист sc кляп-HLA-A2 и совместно выразили sc кляп-HLA-A2 WT или V152E с низким уровнем агонист sc Е183-HLA-A2. WT и V152E sc кляп-HLA-A2 расширение производства ИФН γ и дегрануляции (рис. 3 cD), предположить, что TCR привязка реализует совместное агонист не требуется для совместного агонист реализует зависимых CD8 + T клетки активации расширения. Одной цепи MHC класса I технологии, как представленные здесь, может быть использована для изменения TCR и/или coreceptor привязки к MHC класса я с известными пептид расследовать молекулярных требования для признания антигена Т-клеток и активации.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59126/59126fig1.jpg"> Рисунок 1: одной цепи, HLA-A2 конструкции используется расследовать совместно агониста в активации клеток человека CD8 + Т. (A) принципиальная схема scHLA-A2 конструкции, состоящей из ковалентно последовательность сигнала из плавленого человека β2 микроглобулин, пептид выбора, гибкие глицин Серина компоновщик (GGGGSGGGGS GGGGS),2 микроглобулина человека β, гибкие Глицин Серина компоновщик и HLA-A2 тяжелые цепи. (B) схема плазмид, используемый для создания инженерных антиген представляющих клеток расследовать co агонизмом в активации клеток человека CD8 + T: Репрессор тетрациклин, агонист sc Е183-HLA-A2 под контролем промотора тетрациклин индуцибельной, не стимулирующее сотрудничество агонист sc кляп-HLA-A2 под контролем промотора конститутивно активных. (C) схема инженерных антиген представляющих клеток, используются для изучения co агонизмом: T-REx Чо клетки (выражение не человека MHC), T-REx Чо клетки, выражая конститутивно высокий уровень sc кляп-HLA-A2 (не стимулирующее сотрудничество агонист реализует), Клетки T-REx Чо выражения «Дырявый» низкий СК Е183-HLA-A2 в отсутствие Тетрациклин (низкий уровень агонист пептида), T-REx Чо клетки, выражая высокий уровень sc Е183-HLA-A2 присутствии Тетрациклин (высокий уровень агонист пептида), T-REx Чо клетки выражая низкий уровень sc Е183-HLA-A2 и высокий уровень sc кляп-HLA-A2 (низкий уровень агонист пептида) и высокий уровень сотрудничества агонист пептида. (D) клеток поверхности окрашивание инженерных антиген представляющих клеток линии с использованием антител анти HLA-A2. Номера, указанные обозначения МФО значения для MHC пятно в ворота живой клетки. Данные представителя 5 независимых экспериментов (E) клеток поверхности окрашивание инженерных антиген представляющих клеточных линий, используя конкретные TCR-как антитела против HLA-A2, представляя Е183 пептид. Номера, указанные обозначения МФО значения для MHC пятно в ворота живой клетки. Данные представителя 5 независимых экспериментов. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59126/59126fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59126/59126fig2v3.jpg"> Рисунок 2: наличие совместного агонист реализует расширение производство цитокинов и дегрануляции Е183-HLA-A2-определенного человеческого клона CD8 + CTL. (A) внутриклеточных ИФН γ окрашивание HLA-A2-определенного человека CD8 + CTL клон после 3 h стимуляции с указанного инженерии антиген представляющих клеток. Номера, указанные обозначения процент положительных для окрашивания ИФН γ. Данные представителя 3 независимых экспериментов, каждый выступал с технической triplicates. (B) клеток поверхности, CD107a окрашивание HLA-A2-определенного человека CD8 + CTL клон после 3 h стимуляции с указанного инженерии антиген представляющих клеток. Номера, указанные обозначения процент положительных для окрашивания CD107a или CD107a МФО для популяции клеток CD8 + T. Данные представителя 3 независимых экспериментов, каждый выступал с технической triplicates. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59126/59126fig2v3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59126/59126fig3.jpg"> Рисунок 3: Сопредседатель агонист-опосредованной Т-клеток активации расширения не требует TCR привязки для совместного агонист реализует комплекс. (A) V152E мутации в sc Е183-HLA-A2 отменяет активацию Е183-HLA-A2-определенного человеческого клона CD8 + CTL. T-REx Чо клетки, выражая высокий уровень (всасывание тетрациклина) WT или V152E мутант sc Е183-HLA-A2 были использованы для стимулирования Е183-HLA-A2-определенного человека CD8 + CTL клон за 3 ч. Активация т-клеток было количественно с помощью внутриклеточных ИФН γ пятнать. Номера, указанные обозначения процент положительных для окрашивания ИФН γ. Данные представителя 3 независимых экспериментов, каждый выступал с технической triplicates. (B) местоположение V152E мутации в паз привязки пептид HLA-A2. (C) V152E мутации на sc кляп-HLA-A2 Сопредседатель агонист реализует комплекс не отменить повышение co agonist зависимой активации. Внутриклеточные ИФН γ пятнать HLA-A2-определенного человеческого клона CD8 + CTL после 4 ч стимуляции с указанного инженерии антиген представляющих клеток. Номера, указанные обозначения процент положительных для окрашивания ИФН γ. Данные представителя 3 независимых экспериментов, каждый выступал с технической triplicates. (D) V152E мутации на sc кляп-HLA-A2 Сопредседатель агонист реализует комплекс не отменить повышение co agonist зависимой активации. Ячейки, поверхности CD107a окрашивание HLA-A2-определенного человека CD8 + CTL клон после 3h стимуляции с указанного инженерии антиген представляющих клеток. Номера, указанные обозначения процент положительных для окрашивания CD107a или CD107a МФО для популяции клеток CD8 + T. Данные представителя 3 независимых экспериментов, каждый выступал с технической triplicates. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59126/59126fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Use of Single Chain MHC Technology to Investigate Co-agonism in Human CD8+ T Cell Activation at JoVE.com

Use of Single Chain MHC Technology to Investigate Co-agonism in Human CD8+ T Cell Activation

Использование единой цепи MHC технологии расследовать Co агонизмом в человека CD8 + Т-клеток активации

Этот протокол описывает использование одной цепи гистосовместимости комплексы для изучения молекулярных взаимодействий в активации клеток человека CD8 + T: поколение инженерии антиген представляющих клеток, выражая единую цепочку конструкции, культуры человеческого клона клеток CD8 + T и активация Т-клеток экспериментов.

Non-stimulatory self peptide MHC (pMHC) complexes do not induce T cell activation and effector functions, but can enhance T cell responses to agonist ...

Нестимуляторные пептидные комплексы MHC не активируют Т-клетки, но могут усилить реакцию Т-клеток на агонистный пептид MHC. Этот протокол описывает экспериментальную систему для исследования коагонизма во время активации Т-клеток ЧЕЛОВЕКА CD8. Мы выражаем молекулы MHC как одноколесные комплексы с ковалентно-связанной тяжелой цепью, бета-2-микроглобулином и пептидом.Это позволяет вводить мутации в молекулы MHC, представляя предопределенные пептиды. В этом протоколе используется клон CTN человека, специфичный для эпитопа вируса гепатита В. Понимание механизма коагонизма при реакциях Т-клеток против гепатита может способствовать развитию иммунотропов против этой вирусной инфекции.Представленные методы могут быть использованы в исследованиях и других фундаментальных аспектах активации Т-клеток в Т-клеточных системах человека с известной специфичностью пептида MHC. В этом протоколе используются одноко цепи молекул MHC класса I человека, состоящие из последовательности сигналов, пептида интереса, связующих звенья, человека бета-2-микроглобулина linker, и MHC тяжелой цепи. Пептид E1A3 от гепатита В используется в качестве агонистного пептида.Gag от ВИЧ используется в качестве нестимуляторного пептида. Однококлеточные молекулы МХК человека выражаются в линии клеток хомяка, содержащей тетрациклин-репрессор. Агонист однокоголовый MHC выражается с использованием тетрациклин-индуцированных плазмид, в результате чего очень низкий уровень экспрессии в отсутствие тетрациклина, и высокий уровень экспрессии в присутствии тетрациклина.Клетки CHO, выражаюющие низкий уровень агонистного пептида MHC, трансфицированы составно выраженным нестимуляторным пептидом MHC. Использование этой экспериментальной системы позволяет сравнивать реакции Т-клеток с агонистным пептидом MHC при наличии или отсутствии нестимуляторного пептида MHC. Чтобы начать эту процедуру, культивировать CHO клетки в колбе Т-75, как указано в текстовом протоколе.За день до эксперимента по активации Т-клеток, мыть клетки в колбе с PBS. Добавьте раствор, содержащий 05%трипсина и 2%EDTA в PBS, и инкубировать в течение пяти-десяти минут при комнатной температуре. Используя световой микроскоп, наблюдайте за клетками, чтобы убедиться, что они отделились.Затем добавьте полный F12 в колбу, чтобы остановить трипсинизацию. Перенесите подвеску клетки в 15-миллилитровую трубку. Центрифуга при 400G в течение пяти минут, и удалить супернатант либо трубопроводов или декантирования.Повторно приостанавливайте гранулы ячейки в пяти миллилитров полного F12. Используйте гемоцитометр для подсчета клеток и корректировки концентрации клеток до 200 000 клеток на миллилитр в CF12. Добавьте от 50 до 60 нанограмм на миллилитр тетрациклина в образцы только агониста, чтобы вызвать большое количество агонистного выражения класса PMHC I в качестве положительного контроля.После этого смешайте клетки CHO либо вихрем, либо пипетки. Добавьте 100 микролитров клеточной подвески к каждому колодец пластины U-bottom 96-well. Инкубировать на ночь при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом.За день до эксперимента центрифуга CTLS клетки при 400 раз G и при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Используйте гемоцитометр, чтобы подсчитать клетки, и повторно приостановить их при плотности одного миллиона клеток на миллилитр в полном человеческих Т-клеток без цитокинов или PHA. Инкубировать CTLs ночь на 37 градусов по Цельсию с 5%углекислого газа.На следующий день центрифуга Т-клеток в 400 раз G и при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте клетки в 2 миллилитров полного без сыворотки мультимедиа. Используйте гемоцитометр для подсчета Т-клеток и корректировки их плотности до одного миллиона живых клеток на миллилитр в полных Т-клеточных средствах массовой информации человека.Добавьте анти-человеческое антитело CD107a при разбавлении от одного до 100, и Brefeldin A при разбавлении от одного до 1000. Затем извлечения 96-хорошо пластины, содержащей клетки CHO. Используя стеклянную пипетку Pasteur, аспирировать средства массовой информации из клеток CHO.Добавьте к каждой колодец 200 микролитров подвески Т-клеток. Со-культура Т-клеток с клетками CHO при 37 градусах по Цельсию с 5%-углеродным диоксидом в течение трех-четырех часов. В конце совместной культуры, центрифуга 96-хорошо пластины на 400 раз G и четыре градуса по Цельсию в течение пяти минут.Удалите супернатант, аспирируя или стряхивая. Затем добавьте 2,5 микролитров антител CD3 и 2,5 микролитров антител CD8 в 50 микролитров 5%BSA в PBS к каждой хорошо, для окрашивания поверхности клеток антигена, и смешать с помощью пипетки. Инкубировать образцы в темноте, и на льду, в течение 30 минут.После этого добавьте 150 микролитров буфера для мытья к каждому хорошо, чтобы вымыть образцы. Центрифуга образцов в 400 раз G и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут. Удалите супернатант, аспирируя или стряхивая.Установите комплект фиксации/пермеабилизации и добавьте 100 микролитров раствора фиксации/пермеабилизации к каждой колодец и пипетку для смешивания. Инкубировать на льду в течение 20 минут. Затем центрифуга пластины на 400 раз G при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут.Отбросьте супернатант и добавьте 200 микролитров буфера 1X perm/wash к каждой хорошо. Повторите этот процесс от центрифугации через добавление буфера завивки/мытья один раз. После этого повторно приостанавливают клетки в 50 микролитров буфера завивки/мытья, содержащего анти-интерферон-гамму с концентрацией 3 микрограмма на миллилитр.Инкубировать на льду в темноте в течение 30 минут. Далее добавьте 150 микролитров буфера 1X perm/wash. Центрифуга при 400G, четыре градуса по Цельсию, в течение пяти минут.Удалите супернатант и добавьте 200 микролитров буфера 1X perm/wash. Центрифуга пластины снова в 400 раз G, четыре градуса по Цельсию, в течение пяти минут, и удалить супернатант, аспирируя или стряхивая. Повторно приостанавливайте образец в 200 микролитров буфера для мытья и приступайте к цитометрическому анализу.За день до эксперимента смешайте клетки ЧО либо вихрем, либо трубой. Затем добавьте один миллилитр клеточной подвески к каждому колодец из 12-хорошо пластины. Инкубировать на ночь при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом.В день эксперимента используйте клеточный скребок, чтобы отделить клетки CHO от нижней части каждой хорошо. Перенесите один миллилитр средств массовой информации, содержащих клетки из каждой системы, в трубки FACS. Центрифуга при 400 градусах G и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут.Повторно приостановить в 100 микролитров анти-HLA антитела разбавлены в буфере мытья. Инкубировать на льду в течение 30 минут. Затем добавьте один миллилитр буфера стирки в каждый образец CHO.Центрифуга при 400 раз G и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут, и отказаться от супернатанта. Повторно приостанавливайте каждый образец в 3 миллилитров буфера стирки и приступайте к анализу цитометрии потока. В этом исследовании представлен надежный инструмент для исследования молекулярного взаимодействия во время положительной активации Т-клеток человека CD8.Разработанная ксеногенная система генерируется, которая представляет низкие уровни агонистного pMHC при наличии или отсутствии агонистного pMHC. Эти инженерные БТРы затем используются для стимулирования E183-специфического человека CD8 положительный клон Т-клеток. Нетрансфицированные клетки CHO и CHO-клетки, выражают нестимуляторный одноко цепной комплекс Gag-MHC, не вызывают активации.Экспрессия высоких уровней агонистного одномагнитного комплекса E183-MHC, который является положительным элементом управления, как считается, вызывает очень эффективное производство интерферона-гамма и дегрануляцию, демонстрируя, что одночегоночная конструкция E183 может быть распознана конкретным TCR для активации функций эффектора Т-клеток. Выражение низких уровней одноко цепью комплекса Е183-МХК вызывает более низкие уровни интерферон-гамма-производства и дегрануляции, что было усилено наличием нестимуляторного комплекса Gag-MHC. Обратите внимание, что очень высокий процент клеток CD107a-T наблюдается даже в ответ на низкие уровни антигенного pMHC, что согласуется с предыдущими исследованиями.Однако наличие нестимуляторного комплекса Gag-MHC увеличивает CD107a МФО. Во время этой процедуры, очень важно контролировать агонист пептид MHC выражение для обеспечения равной агонистической презентации с или без нестимуляторного пептида. Очень важно количественно агонист пептид MHC выражение с использованием TCR-как антитела в каждом эксперименте.Альтернативный подход заключается в использовании поддерживаемых липидных билейеров, или бисера, представляя фиксированное количество агонистного пептида MHC в присутствии нестимуляторного пептида MHC. Эти экспериментальные системы должны позволить тестирование нескольких нестимуляторных пептидных последовательностей для коагонизма. Одноклеточная технология MHC может быть использована для исследования молекулярных взаимодействий при активации Т-клеток CD4, а также для исследования неклассических молекул MHC.Этот протокол использует человеческую кровь и человеческие клетки. Следуйте всем необходимым мерам предосторожности при работе с человеческой кровью, чтобы уменьшить риск передачи заболеваний, передающихся через кровь.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Ретровирусные трансдукция Т-клеточных рецепторов в мышь Т-клеток

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Use of Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Использование интерферона-γ энзимных Анализ Immunospot для характеристики Роман Т-клеточных эпитопов вируса папилломы человека

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Индукционная трансплантат против хозяина и<em&gt; В Vivo</em&gt; Т-клеток Мониторинг Использование MHC соответствием мышиной модели

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

PiggyBac транспозонов модификации системы первичной Т-клетках человека

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

Использование флуоресцентных целевых массивов для оценки Т-клеточные ответы<em&gt; В естественных условиях</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flow Cytometric Анализ естественных клеток-киллеров литической активности в человеческой цельной крови

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Анализ обезьяньего вируса иммунодефицита специфических CD8<sup&gt; +</sup&gt; Т-клетки в макак-резусов пептидными-MHC-I тетрамере Окрашивание

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Высоко мультиплексированная, высокоразрешающая визуализация т-клеток с использованием madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

На месте MHC-Тетрамер окрашивание и количественный анализ для определения местоположения, изобилия и фенотип антиген специфические CD8 Т-клеток в тканях

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

Spatial and Temporal Control of T Cell Activation Using a Photoactivatable Agonist

Пространственного и временного управления активации Т-клеток с помощью агонист Photoactivatable

T lymphocytes engage in rapid, polarized signaling, occurring within minutes following TCR activation. This induces formation of the immunological ...