Nonstimulatory peptid MHC-komplex aktiverar inte T-celler men kan förstärka T-cellens svar på agonistpeptid MHC. Detta protokoll beskriver ett experimentellt system för att undersöka co-agonism under mänskliga CD8 T cell aktivering. Vi uttrycker MHC-molekyler som enkelkedjade komplex med kovalent-linked tung kedja, beta-2-mikroglobulin, och peptiden.
Detta gör det möjligt att införa mutationer i MHC molekyler presentera förutbestämda peptider. Detta protokoll använder mänskliga CTN klon, en specifik för en epitop av hepatit B-virus. Förstå mekanismen för co-agonism under T-cell svar mot hepatit kan bidra till utveckling av immunotropics mot denna virusinfektion.
De presenterade metoderna kan användas i forskning och andra fundamentala aspekter av T-cellaktivering i humana T-cellsystem med känd peptid MHC-specificitet. Detta protokoll använder single-chain mänskliga MHC klass I molekyler, bestående av signalsekvens, peptid av intresse, länkaren, mänskliga beta-2-microglobulin linker, och MHC tung kedja. E1A3 peptid från hepatit B används som agonist peptid.
Gag från HIV används som nonstimulatory peptid. De enkedsiga mänskliga MHC-molekylerna uttrycks i en hamster cellinje som innehåller tetracyklin förtryckare. Agonist single-chain MHC uttrycks med hjälp av tetracyklin-inducerbara plasmid, vilket resulterar i mycket låga uttrycksnivåer i avsaknad av tetracyklin, och höga uttrycksnivåer i närvaro av tetracyklin.
CHO-celler som uttrycker låga nivåer av agonist peptid MHC är transfekterade med constitutively uttryckt nonstimulatory peptid MHC. Användning av detta experimentella system möjliggör jämförelse T-cell svar till agonist peptid MHC i närvaro eller frånvaro av nonstimulatory peptid MHC. För att påbörja detta förfarande, odla CHO-celler i en T-75 kolv, som beskrivs i textprotokollet.
Dagen före T-cellens aktiveringsexperiment tvättar du cellerna i kolven med PBS. Lägg till en lösning som innehåller 05%trypsin och 2%EDTA i PBS, och inkubera i fem till tio minuter vid rumstemperatur. Med hjälp av ett ljusmikroskop observerar du cellerna för att se till att de har lossnat.
Lägg sedan till komplett F12 i kolven för att stoppa trypsinizationen. Överför cellupphängningen till ett 15 milliliterrör. Centrifugera vid 400G i fem minuter, och ta bort supernatanten genom antingen pipettering eller dekantera.
Åter upphäva cell pelleten i fem milliliter av komplett F12. Använd en hemocytometer för att räkna cellerna, och justera cellkoncentrationen till 200, 000 celler per milliliter i CF12. Tillsätt 50 till 60 nanogram per milliliter tetracyklin till agonist-bara prover för att framkalla stora mängder agonist pMHC klass I uttryck som en positiv kontroll.
Efter detta, blanda CHO-cellerna antingen genom att vortexa eller pipettering. Tillsätt 100 mikroliter av cellupphängningen till varje brunn av en U-botten 96-brunnsplatta. Inkubera över natten vid 37 grader Celsius med 5%koldioxid.
Dagen före experimentet, centrifug CTLS celler vid 400 gånger G och vid fyra grader Celsius i fem minuter. Använd en hemocytometer för att räkna cellerna, och åter avbryta dem med en densitet av en miljon celler per milliliter i kompletta mänskliga T-cell media utan cytokiner eller PHA. Inkubera CTLs natten på 37 grader Celsius med 5%koldioxid.
Nästa dag centrifug T-cellerna vid 400 gånger G och vid fyra grader Celsius i fem minuter. Kasta supernatanten och dra tillbaka cellerna i 2 milliliter av kompletta serumfria medier. Använd en hemocytometer för att räkna T-cellerna och justera deras densitet till en miljon levande celler per milliliter i kompletta mänskliga T-cellmedier.
Tillsätt anti-human CD107a antikropp vid en en till 100 utspädning, och Brefeldin A vid en en till 1000 utspädning. Därefter hämtar du 96-brunnsplattan som innehåller CHO-cellerna. Med hjälp av en pasteurpipett av glas aspirerar du media från CHO-cellerna.
Tillsätt 200 mikroliter av T-cellsupphängningen till varje brunn. Samkultur T-cellerna med CHO-celler vid 37 grader Celsius med 5%koldioxid i tre till fyra timmar. I slutet av samkulturen centrifugerar 96-brunnsplattan vid 400 gånger G och fyra grader Celsius i fem minuter.
Ta bort supernatanten genom att aspirera eller snärta. Lägg sedan till 2,5 mikroliter av CD3-antikroppar och 2,5 mikroliter av CD8-antikroppar i 50 mikroliter av 5%BSA i PBS till varje brunn, för cellyta antigenfärgning, och blanda genom pipettering. Inkubera proverna i mörker, och på is, i 30 minuter.
Efter detta, tillsätt 150 mikroliter av tvätt buffert till varje brunn för att tvätta proverna. Centrifugera proverna vid 400 gånger G och vid fyra grader Celsius i fem minuter. Ta bort supernatanten genom att aspirera eller snärta.
Ställ ut en fixering / permeabilization kit, och lägga till 100 mikroliter av fixering / permeabilization lösning till varje brunn, och pipetter att blanda. Inkubera på is i 20 minuter. Sedan centrifug plattan vid 400 gånger G vid fyra grader Celsius i fem minuter.
Kassera supernatanten och tillsätt 200 mikroliter av 1X perm/tvättbuffert till varje brunn. Upprepa denna process från centrifugering genom att lägga till perm/tvättbufferten en gång. Efter detta, åter avbryta cellerna i 50 mikroliter perm/tvätt buffert som innehåller anti-interferon-gamma vid en koncentration av 3 mikrogram per milliliter.
Inkubera på is i mörkret i 30 minuter. Därefter lägger du till 150 mikroliter av 1X perm/tvättbuffert. Centrifugera vid 400G, fyra grader Celsius, i fem minuter.
Ta bort supernatanten och tillsätt 200 mikroliter av 1X perm/tvättbuffert. Centrifugera plattan igen vid 400 gånger G, fyra grader Celsius, i fem minuter, och ta bort supernatanten genom att aspirera eller snärta. Åter avbryta provet i 200 mikroliter av tvättbuffert och fortsätt med cytometrisk analys.
En dag före experimentet, blanda CHO-cellerna antingen genom att virvel eller pipettering. Nästa lägga till en milliliter av cellen suspension till varje brunn av en 12-brunn tallrik. Inkubera över natten vid 37 grader Celsius med 5%koldioxid.
På dagen för experimentet, använd en cell skrapa för att lossa CHO-cellerna från botten av varje brunn. Överför en milliliter av media som innehåller cellerna från varje brunn till FACS rör. Centrifugera vid 400 gånger G och vid fyra grader Celsius i fem minuter.
Återuppskov i 100 mikroliter av anti-HLA-antikropp utspädd i tvättbuffert. Inkubera på is i 30 minuter. Lägg sedan till en milliliter tvättbuffert till varje CHO-prov.
Centrifug vid 400 gånger G och vid fyra grader Celsius i fem minuter, och kasta supernatanten. Åter upphäva varje prov i 3 milliliter tvättbuffert, och fortsätt till flöde cytometry analys. I denna studie presenteras ett robust verktyg för undersökningen av molekylär interaktion under mänskliga CD8 positiva T cell aktivering.
En konstruerad xenogenic system genereras som presenterar låga nivåer av agonist pMHC i närvaro eller avsaknad av co-agonist pMHC. Dessa konstruerade APC används sedan för att stimulera en E183-specifik mänsklig CD8-positiv T-cell klon. Otransfekterade CHO-celler, och CHO-celler som uttrycker det icke-timulatoriska enkedjekomplexet Gag-MHC, inducerar inte aktivering.
Uttryck för höga nivåer av agonist single-chain E183-MHC komplex, som är den positiva kontrollen, ses för att framkalla mycket effektiv interferon-gamma produktion, och degranulation, visar att den enkedje E183 konstruera kan kännas igen av en specifik TCR att aktivera T-cell effector funktioner. Uttryck för låga nivåer av enkedjad E183-MHC komplexa inducera lägre nivåer av interferon-gamma produktion och degranulation, som var förstärkt genom närvaro av en nonstimulatory Gag-MHC komplex. Observera att mycket höga procentsatser av CD107a+T-celler observeras även som svar på låga nivåer av antigen pMHC, vilket är förenligt med tidigare studier.
Förekomsten av nonstimulatory Gag-MHC-komplexet ökar dock CD107a MFI. Under detta förfarande är det avgörande att kontrollera agonist peptid MHC uttryck för att säkerställa lika agonist presentation med eller utan nonstimulatory peptid. Det är viktigt att kvantifiera agonist peptid MHC uttryck med hjälp av TCR-liknande antikroppar i varje experiment.
Ett alternativt tillvägagångssätt är att använda stöds lipid bilayers, eller pärlor, presentera fast mängd agonist peptid MHC i närvaro av nonstimulatory peptid MHC. Dessa experimentella system bör tillåta testning av flera nonstimulatory peptidsekvenser för co-agonism. Den enkedje-MHC-teknologin kan användas för att undersöka molekylära interaktioner i CD4 T-cellaktivering, samt för att undersöka icke-klassiska MHC-molekyler.
Detta protokoll använder mänskligt blod och mänskliga celler. Följ alla nödvändiga försiktighetsåtgärder när du arbetar med humant blod för att minska risken för överföring av blodburna sjukdomar.
