Name: use of single chain mhc technology to investigate co-agonism in human cd8+ t cell activation
Uploaded: 2019-02-28T15:00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Single Chain MHC Technology to Investigate Co-agonism in Human CD8+ T Cell Activation at JoVE.com

Denna forskning stöddes av Singapore hälsoministeriets nationella medicinska forskningsrådet under dess CBRG/0064/2014 till N.R.J.G., genom att skapa under dess R571-002-012-592 till pam., National Research Foundation Investigatorship R571-000-272-281 till pam ., och genom en Singapore translationell forskning (STaR) Investigator Award (NMRC-stjärnigt-013/2012) att A.B. Vi är tacksamma att Dr. Paul Hutchinson och Mr Teo Guo Hui från NUS immunologi programmet Flow Core facilitet för expert cell sorteringen. Vi är tacksamma att Elijah Chen för kritisk läsning av manuskriptet.

Obs: Alla åtgärder som innefattar användning av levande, icke-fasta celler bör utföras i en biosäkerhet huva, och någon biologiskt farligt avfall ska kasseras enligt gällande lokala hälsa och säkerhet.
1. CHO Cell Transfection och generering av stabil CHO cellinjer
<ol><li>
CHO cell transfection Obs: det här avsnittet beskriver CHO cell transfection använder polyethylenimine (PEI). Dock kan alternativa metoder användas, som CHO celler är relativt lätt att transfect använder kommersiellt tillgängliga lipid transfection reagenser.<ol>
<li>Kultur CHO-celler i komplett F12 (cF12, F12 kompletteras med 5% FBS, 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin och 10 µg/mL blasticidin att upprätthålla uttryck för den tetracyklin repressor). Passagen cellerna varje 3-4 dagar på en 1:10 baserat.</li>
		<li>En dag innan transfection, förbereda CHO cellsuspension. Tvätta CHO-celler i kolven med PBS (10 mL till PBS för en T75 kolv, 5 mL PBS för en T25 kolv). Lägg till 0,05% Trypsin/0.02% EDTA i PBS (2 mL för en T75 kolv, 1 mL för en T25 kolv) till kolven och inkubera i 5-10 min i rumstemperatur (RT). Kontrollera med hjälp av ett ljusmikroskop att cellerna har lossnat, och stoppa trypsinization genom att lägga till cF12 till kolven (8 mL för en T75 kolv, 4 mL för en T25 kolv).</li>
		<li>Överföra CHO cellsuspensionen till en 15 mL rör och centrifugera vid 300-400 x g under 5 minuter vid 4 ° C eller RT. ta bort supernatanten, återsuspendering i cF12 (10 mL till en T75 kolv, 5 mL för en T25 kolv) och räkna med en hemocytometer.</li>
		<li>Justera cell koncentration till 60.000-100.000 CHO celler/mL. Tillsätt 5 mL av CHO cellsuspension (300.000-500.000 CHO-celler) per brunn i en 6 väl platta. Inkubera över natten vid 37 ° C, 5% CO2.</li>
		<li>På dagen för transfection, tillsätt 400 μL i serumfritt F12 media eller lågt serum media en 1,5 mL tub. Lägga till 3 μg av Plasmiden 400 μL av media. Blanda genom pipettering. Lägga till 6 μg av PEI (6 μL 1 mg/mL PEI lösning) till media/DNA mix och vortex omedelbart för 10 s.</li>
		<li>Inkubera media/DNA/PEI mixen på RT för 10-15 min. Under denna inkubation, ersätta CHO cell media i 6 väl plattan med 5 mL av färska cF12 media.</li>
		<li>Lägga till media/DNA/PEI lösningen i CHO-celler. Lägg till lösningen droppvis och jämnt över brunnen. Inkubera över natten vid 37 ° C, 5% CO2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Generation av stabil CHO cellinjer
	<ol>
<li>En dag efter transfection, ta bort medier från brunnarna och tillsätt 5 mL av cF12 som innehåller lämpliga val av antibiotika till varje brunn. Använda 0,3 mg/mL hygromycin för pcDNA5TO-baserade plasmider och 1 mg/mL geneticin för pcDNA3-baserade plasmider.</li>
		<li>Om de celler nå mer än 90% konfluens på 24 h bokför transfection, trypsinize cellerna.</li>
		<li>Tvätta brunnarna med 1 mL PBS per väl, tillsätt 1 mL 0,05% trypsin/0.02% EDTA i PBS och inkubera i 5-10 min på RT. med ett ljusmikroskop, kontrollera att cellerna har lossnat och stoppa trypsinization genom att lägga till 3-4 mL cF12 per brunn.</li>
		<li>Överföra CHO cellsuspensionen till en 15 mL rör och centrifugera vid 300-400 x g under 5 minuter vid 4 ° C eller RT. ta bort supernatanten och slamma i 10 mL cF12. Tillsätt 5 mL cellsuspension per brunn i 6 väl plattan. Använd två brunnar för att maximera avkastningen av de transfekterade cellerna.</li>
		<li>Inkubera 6 väl plattorna vid 37 ° C, 5% CO2. Övervaka celldöd och tillväxten av resistenta kolonier med ett ljusmikroskop. Ta bort media och ersätta det med frisk media som innehåller lämpliga antibiotika efter 4-5 dagar, eller när betydande celldöd observeras.</li>
		<li>När den resistenta celler nå mer än 70% confluence, trypsinize celler som beskrivs i steg 1.2.2 och överföra till en T25 kolv för expansion. Antibiotikum av valet tar 1-2 veckor.</li>
		<li>När de antibiotikaresistenta CHO-cellerna i T25 kolven når 70-80% sammanflödet, utföra antikropp färgning för att kontrollera cellen ytbehandlar uttryck för konstruktioner av intresse. En dag innan antikropp färgning, trypsinize celler som beskrivs i steg 1.2.2 och justera cellkoncentrationen till 200 000 celler/mL, och tillsätt 1 mL cellsuspension till 12 väl plattan. För provning av tetracyklin-inducerbara konstruktioner, lägga till 50-60 ng/mL tetracyklin. Inkubera över natten vid 37 ° C, 5% CO2.</li>
		<li>Använd cellen skrapa bort CHO celler från botten av brunnen. Denna metod är att föredra framför trypsinization, eftersom det minskar risken för epitop skador på grund av proteolytisk klyvning.</li>
		<li>Över 1 mL av media som innehåller CHO celler till en FACS röret. Snurra ner vid 300-400 x g, 4 ° C i 5 min. återsuspendering i 100 μl anti-HLA antikroppar utspätt i FWB. Inkubera i 30 minuter vid 4 ° C på is. Utföra denna färgning med anti-A2 antikropp att upptäcka totalt A2 cell surface uttryck nivåer och TCR-liknande antikropp specifik för A2 i komplex med E183 peptid för att upptäcka agonist pMHC-jag cell surface uttrycksnivåerna.</li>
		<li>Efter att kontrollera MHC uttrycket, FACS-sortera de positiva cellerna och underhålla sorterade cellerna i media med antibiotika för att minska transgenens förlust. För CHO-celler som uttrycker agonist pMHC, rekommenderas enstaka cell sortering, att säkerställa jämförbar agonist pMHC uttryck med och utan supertransfection med samtidig agonist pMHC. 2-3 veckor krävs för CHO celltillväxt efter enstaka cell sorteringen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. HBV-specifik CTL kultur
<ol><li>
Beredning av PBMC som matare för HBV-specifika mänskliga CTL re stimulering Obs: för A2-E183-specifika CTL klonen, ny stimulering med nymalen isolerade PBMC, snarare än tinade PBMC, ger bäst resultat. Varning: Skaffa alla nödvändiga etiska tillstånd innan du rekryterar volontärer för blodgivning. För detta arbete, PBMC samlades in från friska frivilliga enligt protokollet godkändes av NUS IRB. Informerat samtycke erhölls från alla givare. Följ alla nödvändiga försiktighetsåtgärder när du arbetar med humant blod att minska risken för överföring av blodburna sjukdomar.<ol>
<li>Innan du börjar, centrifug temperaturen vid 19-20 ° C som före värma täthetlutningen (t.ex. Ficoll) till RT.</li>
		<li>Tillsätt 15 mL rumstemperatur täthetlutning till 50 mL tub. Centrifugera vid 400 x g för 5 min vid 19-20 ° C. Detta är att det finns ingen täthetlutning på sidan av röret.</li>
		<li>Samla in 20 mL blod från friska frivilliga givare genom venpunktion. Tillsätt 15 mL PBS till 20 mL blod i en 50 mL tub. Blanda genom pipettering upp och ner.</li>
		<li>Tillsätt långsamt, den 35 mL blod utspätt i PBS ovanpå de 15 mL av täthetlutningen från steg 2.1.2. Kontrollera att blodet och täthetlutningen inte blanda. Centrifugera rören vid 19 ° C, 1200 x g i 20 min med bromsarna.</li>
		<li>Ta bort ca 70% av lagrets plasma. Aspirera försiktigt lagret som innehåller PBMC (det grumlig lagret ovanpå det tydliga täthet lutning lagret) använder en Pasteur pipett och placera den i en ny 50 mL tub.</li>
		<li>Lägga till PBS PBMC att erhålla en 50 mL totalvolym. Centrifugera röret vid 4 ° C, 300-400 x g för 10 min. Ta försiktigt bort supernatanten med hjälp av vakuum insugningsventil och sterilt glas Pasteur-pipett eller genom dekantering.</li>
		<li>Slamma upp cellerna i 50 mL PBS. Centrifugera röret vid 4 ° C, 300 x g för 10 min. Ta försiktigt bort supernatanten med hjälp av vakuum insugningsventil och sterilt glas Pasteur-pipett eller genom dekantering.</li>
		<li>Resuspendera cellerna i 2 mL komplett mänsklig T cell media (serum gratis media kompletteras med 2% humant serum). Räkna cellerna med hjälp av hemocytometer. Detta protokoll ger i genomsnitt 1-2 x 106 PBMC per 1 mL blod som används.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
CTL re stimulering använder PBMC som mataren celler
	<ol>
<li>Bestråla PBMC på 30 Gy till hämma spridning som svar på efterföljande stimulering. Varning: Att adekvat utbildning och överensstämmelse med laboratoriet säkerhetskrav när du använder irradiator.</li>
		<li>Återsuspendering de bestrålade PBMC i komplett mänsklig T cell media på 2 x 106 celler/mL. Lägga till cytokiner och lectin från Phaseolus vulgaris (PHA) för CTL re stimulering vid 2 x koncentration i PBMC suspensionen. Den slutliga cytokin och PHA koncentrationer är: 20 U/mL rekombinant humant IL-2, 10 ng/mL rekombinant IL-7, 10 ng/mL rekombinant humant IL-15 och 1,5 mg/mL PHA.</li>
		<li>Tina frysta CTL injektionsflaskan i 37 ° C vattenbad. Över de upptinade cellerna till en 15 mL tub med 10 mL komplett mänsklig T cell media. Snurra ner vid 300-400 x g vid 4 ° C för 5 min. Ta försiktigt bort supernatanten med hjälp av vakuum insugningsventil och sterilt glas Pasteur-pipett eller genom dekantering.</li>
		<li>Återsuspendering CTL i 2 mL komplett mänsklig T cell media. Räkna cellerna med hjälp av hemocytometer. Lägg till komplett mänsklig T cell media för att få cell koncentration av 106 celler/mL.</li>
		<li>I en 24 väl plattan, tillsätt 0,5 mL av bestrålade PBMC (106 celler) med 2 x cytokines och PHA (steg 2.2.2) och 0,5 mL av CTL (0,5 x 106 celler) per brunn. Antalet brunnar som används beror på det totala antalet CTL eller PBMC tillgängliga. Inkubera vid 37 ° C, 5% CO2.</li>
		<li>Efter 4-5 dagar, när CTL Blaster är synliga och media blir gul, överföra kulturerna i 6 plattor, och komplettera den inledande 1 mL volymen med 4 mL komplett mänsklig T cell medier med 20 U/mL IL-2, 10 ng/mL IL-7 och 10 ng/mL IL-15 (ingen PHA).</li>
		<li>Efter 2-3 dagar, överför kulturer till en T75 mätkolv, tillsätt 40 mL komplett mänsklig T cell medier med cytokiner (steg 2.2.2, ingen PHA) och kultur i upprätt läge.</li>
		<li>Bibehålla CTL vid en koncentration på 1-2 x 106 celler/mL genom att lägga till färska media kompletteras med cytokiner (steg 2.2.2, ingen PHA) på en volym lika stor som den befintliga kultur volymen vid varannan dag. Listor över betrodda certifikat kan användas för experiment 7-14 dagar efter förnyad stimulering.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. T-cells aktivering experiment
Obs: En typisk experiment kräver flera olika T-RExCHO rader: untransfected T-REx CHO-celler (negativ kontroll), T-REx CHO celler uttrycker icke-stimulerande pMHC endast (scA2-GAG, negativ kontroll), T-REx CHO celler uttrycker låga mängder agonist pMHC-jag () scA2-ENV utan tetracyklin, experimental prov), T-REx CHO celler uttrycker låga mängder agonist pMHC och höga halter av icke-stimulerande samarbete agonist pMHC (scA2-ENV och scA2-GAG, utan tetracyklin, experimental prov), och T-REx CHO celler att uttrycka höga mängder av agonist pMHC-jag scA2-ENV med tetracyklin, positiv kontroll), som visas på figur 1 cD.
<ol><li>
Plätering CHO celler som antigen presenterande celler
	<ol>
<li>Kultur CHO-celler i T75 kolv, som beskrivs i steg 1.1.1. Använd celler på 70-90% confluence för bästa resultat. En dag innan T-cellsaktivering experiment, trypsinize celler som beskrivs i avsnitt 1.1.2. Efter trypsinization, överföra cellsuspensionen i en 15 mL tub, Centrifugera vid 400 x g under 5 minuter vid 4 ° C eller RT, avlägsna supernatanten genom pipettering eller dekantering.</li>
		<li>Återsuspendering cellpelleten i 5 mL cF12. Räkna CHO celler med hjälp av en hemocytometer.</li>
		<li>Justera cell koncentration till 2 x10/5ml med hjälp av cF12. Lägga till 50-60 ng/mL tetracyklin till agonist bara prover för att framkalla stora mängder agonist pMHC-jag uttryck som positiv kontroll (figur 1 c). CHO-celler kommer att bosätta sig i 15 mL rör, så se till att blanda dem genom pipettering eller omskakas före plätering.</li>
		<li>T-cells aktivering assay, tillsätt 100 μL av CHO cellsuspensionen per brunn till U-botten 96 väl plattan, och använda exemplar per CHO cellinje. CHO cell anti-MHC färgning, tillsätt 1 mL cellsuspension till 12 väl plattan, och använda exemplar per cell fodrar. Inkubera över natten vid 37 ° C, 5% CO2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
T-cells aktivering assay Obs: denna T-cells aktivering analys tillåter samtidiga kvantifiering av T-cell degranulering (CD107a färgning, ett mått på T-cell cytotoxicitet) och cytokin produktion.<ol>
<li>Dagen innan experimentet, Centrifugera CTL celler vid 400 x g vid 4 ° C i 5 min, räkna med hemocytometer och slamma upp cellerna på 106 celler/mL i komplett mänsklig T cell media utan cytokiner eller PHA. Inkubera vid 37 ° C, 5% CO2. Syftet med denna resten steg är att minska CTL känslighet, som vi har observerat maximal aktivering som svar på låga mängder antigen utan detta steg.</li>
		<li>På dagen av experimentet, centrifugen T celler vid 400 x g vid 4 ° C i 5 min, ta bort supernatanten genom dekantering eller pipettering och slamma upp cellerna i 2 mL komplett serum-fria medier (utan cytokiner eller PHA). Räkna live T-celler med hjälp av en hemocytometer, och justera T cell koncentration 106 levande celler/ml med hjälp av komplett mänsklig T cell media (utan cytokiner eller PHA).</li>
		<li>Lägga Anti-humant CD107a antikropp vid en spädning 1: 100 (slutlig koncentration på 2,5 μg/mL), lägga brefeldin A på en 1: 1000 utspädning (slutlig koncentration på 1 μg/mL).</li>
		<li>Ta bort medier från CHO celler i 96 väl plattan genom att aspirera med glas Pasteur-pipett eller snärta plattan. Per brunn, tillsätt 200 μl av T-cell suspension (0,2 x 106 celler) som innehåller anti-CD107a och brefeldin A. samtidig kultur T cellerna med CHO-celler för 3-4 h.</li>
		<li>I slutet av samtidig kultur, utföra T cell ytantigen färgning. Snurra ner 96 väl plattan vid 300-400 x g, 5 minuter vid 4 ° C och ta bort supernatanten genom aspirera eller snärta. Lägga till 2,5 μl av CD3 och 2,5 μl av CD8 antikroppar i 0,5% BSA i PBS (flöde tvättbuffert, FWB) 50 μL per brunn för cell ytantigen färgning. Inkubera prover på is i 30 min i mörker.</li>
		<li>Tvätta prover genom att lägga till FWB 150 μl per brunn. Snurra ner 96 väl plattan vid 300-400 x g, 5 minuter vid 4 ° C och ta bort supernatanten genom aspirera eller snärta.</li>
		<li>Utför fixering/permeabilisering steg med en fixering/permeabilisering kit. Tillsätt 100 µL av fixering/permeabilisering lösning (från fixering/permeabilisering kit) per brunn, blanda genom pipettering. Inkubera i isen i 20 min.</li>
		<li>Centrifugera vid 300-400 x g och 4 ° C i 5 min, och ta bort supernatanten genom aspirera eller snärta. Tillsätt 200 μl av 1 x perm/tvättbuffert (Späd 10 x lager perm/tvättbuffert från kit innan du använder) per brunn. Upprepa detta steg.</li>
		<li>Återsuspendering cellpelleten i 50 μL 1 x perm/tvättbuffert som innehåller anti-IFN-γ antikroppar på 0,3 μg/mL. Inkubera i isen i 30 min i mörker.</li>
		<li>Tillsätt 150 μl 1 x perm/tvättbuffert. Centrifugera vid 300-400 x g för vid 4 ° C i 5 min, och ta bort supernatanten genom aspirera eller snärta. Lägga till 200 μL 1 x perm-och/eller tvättbuffert, Centrifugera 300-400 x g för vid 4 ° C i 5 minuter och ta bort supernatanten genom aspirera eller snärta.</li>
		<li>Återsuspendering varje prov i 200 μL av FWB. Fortsätt med flöde flödescytometrisk analys.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
CHO cell MHC klass I färgning Obs: är det viktigt att kontrollera scMHC-jag cell surface nivåer på celler som används på varje experiment som cellinjer kan förlora transgenens uttryck. När du förbereder 96 väl plattan för T-cell stimulering, ställa in 12 väl platta för CHO cell färgning, som beskrivs i avsnitt 3.1.4.<ol>
<li>Använda en cell-skrapa bort CHO-celler från botten av brunnen. Denna metod är att föredra framför trypsinization, eftersom det minskar risken för epitop skador på grund av proteolytisk klyvning.</li>
		<li>Över 1 mL av media som innehåller CHO celler till FACS röret. Snurra ner vid 300-400 x g vid 4 ° C i 5 min. återsuspendering i 100 μl anti-HLA antikroppar utspätt i FWB. Inkubera i 30 minuter vid 4 ° C på is.<ol>
<li>Utföra denna färgning med anti-A2 antikropp att upptäcka totalt A2 cell surface uttryck nivåer och TCR-liknande antikropp specifik för A2 i komplex med E183 peptid32 att upptäcka agonist pMHC-jag cell surface uttrycksnivåerna.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Tillsätt 1 mL FWB till varje CHO prov, snurra ner vid 300-400 x g, 4 ° C, 5 min, och sedan åter avbryta provet i 0,3 mL av FWB. Fortsätt med flödescytometri flödesanalys.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Författarna förklarar inget konkurrerande intressen.

Presenterade protokollet ger ett robust verktyg för utredning av molekylära interaktioner under mänskliga CD8 + T cellaktivering. Ett avgörande steg för utredning av co-agonism under mänsklig T cellaktivering är kontroll över agonist pMHC cell surface uttryck för att säkerställa lika agonist pMHC presentation på trupptransportfordon med eller utan samtidig agonist pMHC uttryck. I våra experimentella system, detta uppnås genom att använda en enda cell klon uttrycker låga mängder agonist pMHC, följt av supertransfection med samtidig agonist pMHC konstruera och agonist pMHC kvantifiering använder TCR-liknande antikropp10, 32. som agonist sc pMHC uttryck kan förändras över tid, är det kritiskt att kvantifiera agonist pMHC yta uttryck på trupptransportfordon som används i varje experiment med TCR-liknande antikroppar. Om inga specifika TCR-liknande antikropp är tillgänglig, agonist scMHC-jag kan uttryckas som fluorescerande protein fusion, och dess cell surface uttryck kan då kvantifieras med en känslig mikroskopi metod, såsom Totalreflexion fluorescensmikroskopi 35 , 36. Dessutom cell surface uttryck för samtidig agonist pMHC minskar med tiden, på grund av metylering-beroende och -oberoende ljuddämpning av CMV arrangören37, och bör övervakas med antikropp färgning och flöde flödescytometri analys, med upprepade FACS-sortering när det behövs. Vi har odlade CHO celler för upp till 5 veckor med relativt begränsad förlust av sc pMHC uttryck. Vi rekommenderar frysning CHO celler snart efter urval/sortering att säkerställa en tillförlitlig lager av celler med kända sc MHC uttrycket.
Flera steg i protokoll som presenteras kan ändras, beroende på tillgången på utrustning eller beroende på syftet specifik forskning. Till exempel PBMC spridning potentiella kan vara hämmade (steg 3.2.1) med alternativa metoder som inte kräver en gamma (eller X-) irradiator, såsom behandling med mitomycin C38. En icke-enzymatiska cell dissociation buffertar som innehåller metall kelater39 kan användas i stället för cell skrapning i steg 3.3.1. Dessutom den antigenpresenterande system kan ändras för att göra den mer lämplig för mänskliga CTL kloner att uttrycka olika TCRs. CHO celler express hamster MHC klass I molekyler, och även om dessa är irrelevant för CTL raden utstuderat här (figur 2A och Figur 3A, vi observerade inga T-cell svar till untransfected CHO-celler), det finns en möjlighet att andra mänskliga TCRs kan visa vissa xenoreactivity. I att fallet, hamster MHC klass I uttryck kan minskas genom att slå ut hamster β2-microglubulin eller tryck med hjälp av CRISPR/Cas9; eller en mänsklig APC-linje kan användas efter CRISPR/Cas9-medierad β2-microglubulin eller peka på slå ut.
Den experimentella system presenteras här tillåter exakt kontroll av TCR och CD8 interaktioner med MHC molekyler presentera fördefinierade peptider. Till exempel, har vi tidigare visat att mutationer att avskaffa CD8 bindande40 till coagonist pMHC elimineras coagonist-medierad aktivering enhancement i murina och mänskliga CD8 + T celler9,10, medan om upphävande av TCR interaktion med samtidig agonist pMHC hade ingen effekt på coagonist-medierad aktivering enhancement10. Användning av enda kedja MHC konstruktioner har dock flera begränsningar. Exempelvis är det dags och tidskrävande arbete att testa flera samtidig agonist peptid sekvenser med detta experimentella system, eftersom detta innebär generering av flera plasmider kodning sc MHC med olika peptider, och efterföljande transfections och cell sortering. Tidigare använde vi den murin cellinje från TAP-brist RMA-S för att testa flera samtidig agonist peptider i musen T cell aktivering8,9, men detta tillvägagångssätt var inte framgångsrik med TAP-brist mänskliga T2 cell linje10, troligen på grund av presentation av TAP-oberoende peptider41. En annan begränsning av våra experimentella system är som är inte ger en snabb metod för att ändra mängden co agonist pMHC molekyler för att fastställa kritiska mängden co agonist pMHC krävs för att utlösa T-cellsaktivering. Dessutom tillåter tetracyklin-inducerbara systemet används inte titrering av agonist pMHC kvantitet på nivån enda cell genom att ändra tetracyklin koncentrationen, eftersom varierande tetracyklin koncentration förändrar andelen av HLA-A2 positiva celler, snarare än HLA-A2 nivåer per cell utifrån. Ett alternativt tillvägagångssätt som vi undersöker för närvarande är att använda stöds lipid lipidmonolager42, tidigare använde för att undersöka co-agonism under murina CD4 + T cell aktivering4 eller pärlor presentera fast mängd agonist pMHC i den närvaro av varierande mängder av samtidig agonist pMHC. När används i kombination med UV-cleavable peptid teknik4,43, bör dessa alternativa experimentella system möjliggör snabb testning av flera samtidig agonist peptid sekvenser samt olika mängder co agonist pMHC .
Sc MHC tekniken kan tillämpas också på utredning av co-agonism i mänskliga eller murina CD4 T-celler, som enda kedja MHC klass II molekyler presentera förutbestämda peptider har uttryckts framgångsrikt på däggdjursceller ytor44. Dessutom kan användningen av sc MHC-teknik förlängas till utredning av icke-klassisk MHC molekyler såsom HLA-E. SC HLA-E har beskrivits tidigare, och dess uttryck har visats hämma mänsklig T cell aktivering45. En annan icke-klassisk MHC-molekyl av intresse är CD1, som presenterar lipider i stället för peptider46. SC konstruktioner som består av CD1 tung kedja och β2-mikroglobulin har visat att uttryckas på cellytan och binda relevanta lipid ligander47. Enda kedja MHC-tekniken har stor potential som ett verktyg för forskning för att undersöka molekylära interaktioner under T- och NK cellaktivering.

MHC klass I (MHC-jag) molekyler presentera kort (8-10 aminosyror) peptider härrör från proteiner som syntetiseras av varje cell. MHC-jag molekyler på friska celler presentera själv peptider härrör från endogena proteiner. Virusinfektion som leder till presentation av icke-jaget virus-derived peptider på MHC-jag, men även infekterade celler närvarande icke-jaget peptider i närvaro av stora mängder själv peptid-MHC (pMHC). MHC-jag är erkänt av T-cell receptorn (TCR) och CD8 samtidig receptorn på T-celler. TCR affinitet till peptid pMHC är starkt beroende av sekvensen av presenterade peptider, medan CD8 bindande är peptid-oberoende. TCR bindning till icke-jaget agonist pMHC komplex leder till T cell aktivering och effektor funktioner. Icke-stimulerande själv pMHC-komplex framkalla inte T cell aktivering och effektor funktioner, men kan förbättra T-cell svar på agonist pMHC, genom en process som kallas co-agonism1,2,3. Co-agonism har observerats i mus CD4 + T celler4,5,6 samt mus och mänskliga CD8 + T celler7,8,9,10, 11 , 12 , 13. under fysiologiska betingelser, T-celler måste erkänna begränsade mängder agonist pMHC på antigenpresenterande celler (APC) Co presenterar höga halter av icke-stimulerande pMHC komplex, vilket tyder på att co-agonism bidrar till optimal T cell Svaren Invivo. Totala cell surface MHC klass jag nivåer är ofta nedreglerade vid virusinfektioner14 och på tumörer15. Denna immune evasion strategi minskar agonist pMHC presentation, men minskar också mängden co agonist pMHC jag tillgänglig för T-cells aktivering förbättring. Dessutom klass hög cell surface uttrycksnivåerna för MHC I molekylen HLA-C har visats korrelera med förbättrad HIV kontroll16, vilket tyder på en avgörande roll för totala MHC klass I uttryck i T-cellsaktivering. Trots den fysiologiska betydelsen av co-agonism, är dess molekylära mekanism fortfarande ofullständigt förstås. Detta beror till stor del på tekniska utmaningar av experimentellt styra mängden presenterade samtidig agonist pMHC samtidigt hålla agonist pMHC konstant.
Vi utvecklade en experimentell system att undersöka co-agonism under mänskliga CD8 + T cellaktivering genom att uttrycka mänskliga MHC klass I molekyler presentera förutbestämda peptid som enda polypeptid (enda kedja MHC-I, figur 1A) i en xenogena cell linje9,10. Enda kedja (sc) agonist pMHC uttrycktes under kontroll av tetracyklin-inducerbara arrangören i den hamster-derived T-REx CHO cellinje uttrycker tetracyklin repressor; Detta tillåter mycket låg ”läckande” uttryck för sc agonist pMHC i avsaknad av tetracyklin och hög sc agonist pMHC uttryck efter tillägg av tetracyklin (figur 1BC). Sc-agonist pMHC-uttryckande T-REx CHO cellerna var sedan supertransfected med icke-stimulerande, samtidig agonist sc pMHC-jag under kontroll av en konstitutivt aktiv promotor (figur 1BC). Användning av detta experimentella system tillät oss att jämföra CD8 + T cell Svaren till agonist pMHC i närvaron eller frånvaron av höga halter av icke-stimulerande pMHC. Kritiskt, sedan peptid och MHC-jag tung kedja är kovalent bundna i scMHC-jag format, detta tillåter introduktioner av mutationer i MHC molekyler presentera förutbestämda peptider. Användning av scMHC-jag teknik därmed tillät oss modulerar TCR eller CD8-bindande egenskaper av agonist eller samtidig agonist pMHC.
Co-agonism i CD8 + T cellaktivering har observerats med renat MHC-jag komplex presenterar agonist och samtidig agonist peptider i form av heterodimerer11,17 eller presenteras på quantum dots12,13. Tidiga arbete på co-agonism i CD8 + T cellaktivering inom ramen av agonist pMHC erkännande på APC används TAP2-brist cellinjer som trupptransportfordon. Tryck krävs peptid transport från cytoplasman till endoplasmatiska retiklet och TAP-brist minskar kraftigt poolen av tillgängliga MHC klass I-bindande peptider. I avsaknad av peptider, begynnande komplex av MHC klass I tung kedja och β2- mikroglobulin är instabil, vilket resulterar i mycket låg MHC-jag cell surface uttryck. Inledningsvis, visade jämförelse av T-celler stimuleras med antigen lastas på TAP-tillräcklig och - bristfällig mus RMA och RMA-S cellinjer, respektive, som trupptransportfordon, inte några bevis för co-agonism under musen T cell aktivering18. Användning av detta experimentella system tillät dock inte exakt kontroll över mängden agonist pMHC presenteras oberoende av icke-stimulerande self pMHC. Dessa två cellinjer kan dessutom också skilja sig i uttryck av andra molekyler som modulerar T-cellsaktivering, såsom ligander till T-cell co-stimulatory eller hämmande receptorer eller adhesionsmolekyler.
Därefter utvecklade vi ett protokoll för lastning TAP2-brist RMA-S celler med exogena peptider så att presentationen av en fast mängd agonist pMHC i närvaron eller frånvaron av icke-stimulerande pMHC. Detta uppnåddes genom följande: inkubation av TAP2-brist RMA-S celler vid lägre temperaturer (28 ° C, i stället för den vanliga 37 ° C) för att stabilisera Tom MHC klass I tung kedja/β2 mikroglobulin komplex19; inkubation vid 28 ° C med exogena agonist peptid; inkubation vid 28 ° C i närvaro eller frånvaro av exogena icke-stimulerande peptid; och inkubation vid 37 ° C att minska cell surface uttryck för tomma MHC klass I komplex8,9. Användning av denna experimentella set-up visade att förekomsten av icke-stimulerande pMHC förbättrad aktivering av mus tymocyter, naiva perifera CD8 + T-celler och CTL8. Slentrianmässigt, förekomsten av icke-stimulerande pMHC kan inducera CD8 rekrytering till T cell: APC immun synapsen även i avsaknad av agonist pMHC, och icke-stimulerande pMHC kan förbättra TCR interaktion med CD8 coreceptor7,8. Detta experimentella system tillåter dock inte testa de relativa bidragen av TCR och CD8 coreceptor bindningen till agonist och samtidig agonist pMHC i medla aktiveringen förbättring, som alla ändringar som att ändra TCR eller CD8 bindning till MHC klass skulle jag påverka alla MHC molekyler, oavsett presenterade peptiden. Därför använde vi MHC klass jag enda kedja teknik för att lösa detta problem.
Den enda kedja (sc) MHC klass jag format har använts innan att förbättra antigena pMHC presentation för terapeutiska strategier, och att besvara grundläggande frågor om mekanismer av TCR och NK cell receptor aktiveringen och fungera20,21 . scMHC-jag består av peptid, β2- mikroglobulin och MHC-jag tung kedja sällskap av två flexibla serin/glycin-rika linkers (figur 1A), flera olika linker sekvenser har utvecklats och testats22. scMHC-jag kan vika oberoende av kranen komplexa och förkläde proteiner krävs för konventionella pMHC komplex sammansättning20. scMHC-jag har blivit visad att vika korrekt, som bestämts med konformation-specifika antikroppen färgning22 och lösa sc struktur med röntgenkristallografi23. Den grundläggande scMHC-jag design har ändrats för att förbättra bindningen av låg affinitet peptider24,25.
Det här protokollet beskriver användningen av mänskliga scMHC-jag att undersöka co-agonism under mänskliga CTL klona aktivering. Protokollet har optimerats för mänskliga CTL-klon som är specifika för en epitop av hepatit B virus (HBV). HBV är en allvarlig hälso-och börda över hela världen, eftersom det finns 350 miljoner personer infekterade med HBV och kronisk HBV-infektion kan leda till utveckling av hepatocellulär cancer (HCC). HCC celler som härrör från HBV-infektion kan vanligtvis presentera HBV-derived epitoper och kan kännas igen av specifika mänskliga T celler. HBV- och HCC clearance är beroende av den mänskliga T-cell svar26, men HCC patienter lider ofta av T-cell utmattning och nedsatt T-cell svar27. Införandet av HBV-specifika TCR i T-celler av HBV har prövats som en potentiell immunterapi strategi att eliminera kronisk HBV-infektion28. Det är dock okänt om denna metod kommer att vara effektiv i en klinisk miljö, på grund av de låga nivåerna av surface MHC-I i humana hepatocyter29. Därför kan förstå mekanismen av coagonism ge alternativa perspektiv för immunterapi av HBV, möjligen genom att förbättra presentationen av endogena pMHC att framkalla co-agonism-medierad T-cell svar. Protokollet omfattar alla åtgärder som behövs för forskning på mänskliga co-agonism: transfection av T-REx CHO celler med agonist och samtidig agonist sc pMHC, generation av stabil T-REx CHO cellinjer, kultur av HBV-specifika mänskliga CTL CD8 + T cell fodrar och CTL aktivering experiment kvantifiera cytokin produktion och degranulering svar till T-REx CHO celler. Även om vi fokuserar på att använda den sc MHC klass I teknik för att undersöka co-agonism under HBV T cellaktivering, det måste noteras att de presenterade metoderna kan enkelt anpassas för forskning om andra aspekter av T-cellsaktivering i mänsklig T cellsystem med kända pMHC-jag specificitet.
Detta protokoll används en mänskliga CD8 + CTL linje specifikt för HBV-derived peptid E183-91 (FLLTRILTI: ”E183”)30 presenteras på HLA-A2. SC HLA-molekyler som består av en signal sekvens från mänskliga β2-mikroglobulin, ett HLA-A2 bindande peptid av intresse, en glycin/serin länkare, en mänsklig β2-mikroglobulin, en glycin/serin länkare och en A2 tung kedja kan vara kommersiellt syntetiseras (figur 1A ). Plasmider kodning scA2 konstruktioner med agonist E183 peptid eller coagonist HIV GAG (SLYNTVATL)31 peptider är tillgängliga från författarna på begäran. Peptid sekvensen kan ändras med webbplatsen regi-mutagenes. En tetracyklin-inducerbara vektor användes pcDNA5/att för att uttrycka agonist enda kedjan HLA-A2 med E183 peptid (sc E183-HLA-A2). I närvaro av tetracyklin repressor, pcDNA5/till plasmid tillåter endast mycket låga, ”läckande” uttryck av proteinet av intresse. hög uttryck kan induceras genom tillsats av tetracyklin (figur 1BC). Användning av tetracyklin-inducerbara uttryck system tillåter kontroll över mängden cell surface agonist pMHC uttryck. Ett konstitutivt uttryck plasmiden pcDNA3.1 användes för att uttrycka coagonist scA2 med GAG peptid (sc GAG-HLA-A2). Tetracyklin-reglerade uttrycket (T-REx) CHO cell (linje hamster cell, ingen endogena mänskliga MHC) användes för att uttrycka agonist och samtidig agonist sc-HLA-A2 konstruktioner. Detta experimentella system möjliggör exakt kontroll över pMHC presentation (figur 1 c): ingen pMHC presentation (untransfected T-REx), en stor mängd co agonist pMHC presentation (konstituerande sc GAG-HLA-A2 uttryck), en låg mängd agonist pMHC presentation (sc E183-HLA-A2 i avsaknad av tetracyklin), en stor mängd agonist pMHC presentation (sc E183-HLA-A2 i närvaro av tetracyklin), en låg mängd agonist pMHC presentation och hög uttryck för samtidig agonist pMHC (sc E183-HLA-A2 i den frånvaron av tetracyklin och konstituerande sc GAG-HLA-A2 uttryck). Användning av detta experimentella system tillåter exakt kontroll av cell surface mängder agonist och coagonist pMHC.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aim-V (serum free media)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12055091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blasticidin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm (fixation/permealibisation kit)</td>
			<td>BD</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH3007103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>geneticin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10131035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GolgiPlug (Brefeldin A)</td>
			<td>BD</td>
			<td>555029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hygromycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10687010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (low serum media)</td>
			<td>Bibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 X PBS</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>PB0344 &#8211; 1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>408727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant human IL2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>202-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant human IL7</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>207-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant human IL15</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>247-ILB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetracycline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-REx CHO cell line</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R71807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 x Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BD</td>
			<td>347347</td>
			<td>Clone SK7, RRID:AB_400287</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8&#945;</td>
			<td>BD</td>
			<td>563795</td>
			<td>Clone RPA-T8, RRID:AB_2722501</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD107a</td>
			<td>BD</td>
			<td>566261</td>
			<td>Clone H4A3, RRID:AB_2739639</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-A2</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-9876-41</td>
			<td>Clone BB7.2, RRID:AB_11151522</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-&#947;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-7319-41</td>
			<td>Clone 4S.B3, RRID:AB_1311250</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of single chain mhc technology to investigate co-agonism in human cd8+ t cell activation

Icke-stimulerande själv peptid MHC (pMHC) komplex framkalla inte T cell aktivering och effektor funktioner, men kan förbättra T-cell svar på agonist pMHC, genom en process som kallas co-agonism. Det här protokollet beskriver en experimentell system att undersöka co-agonism under mänskliga CD8 + T cellaktivering genom att uttrycka mänskliga MHC klass I molekyler presentera förutbestämda peptider som enda polypeptider (enda kedja MHC) i en xenogena cellinje. Vi uttryckte enda kedja MHCs under förhållanden där låga nivåer av agonist enda kedja p-MHC komplexen och höga halter av icke-stimulerande enda kedja p-MHC komplexen uttrycktes. Användning av detta experimentella system tillät oss att jämföra CD8 + T cell Svaren till agonist pMHC i närvaron eller frånvaron av icke-stimulerande pMHC. Protokollet beskrivs cell linje transfection med enda kedja MHC konstruktioner, generation av stabil cell linjer, kultur av hepatit B virus-specifika mänskliga CD8 + T celler och T-cellsaktivering experiment samtidigt kvantifiera cytokin produktion och degranulering. De presenterade metoderna kan användas för forskning om olika aspekter av CD8 + T cellaktivering i mänsklig T cellsystem med kända peptid MHC specificitet.

Sc MHC klass I teknik som används här ger exakt kontroll av cell surface uttryck av MHC klass I med kända, kovalent länkade peptider, att inducera T-cellsaktivering. Vi har genererat en konstruerad xenogena-APC-systemet (figur 1A, B, C) som tillåter presentation av låga nivåer av agonist pMHC i närvaron eller frånvaron av samtidig agonist pMHC (figur 1 d, E). Kritiskt, har vi använt en TCR-liknande antikropp specifik för HLA-A2 presenterar E183 peptid för att visa presentationen av agonist sc E183-HLA-A2 inte ändras av samtidig uttryck för samtidig agonist sc GAG-HLA-A2 (figur 1E). Det måste dock noteras att den E183-HLA-A2 specifika TCR-liknande antikroppen visar vissa bindning till HLA-A2 presentera GAG peptid (figur 1E). Liknande bakåtkompilerade antigenpresenterande cellsystem kan konstrueras med hjälp av olika peptider eller MHC molekyler för att undersöka molekylära krav för TCR eller coreceptor interaktioner i human T-celler med olika särdrag.
Vi använde dessa konstruerade trupptransportfordon för att stimulera en E183-HLA-A2-specifika mänskliga CD8 + T cell klon. Tre negativa kontroller användes: T celler endast, untransfected T-REx CHO-celler och T-REx CHO-celler som uttrycker höga halter av co agonist sc GAG-HLA-A2 att testa för potentiella T cell aktivering av alla molekyler som uttrycks på T-REx CHO-celler (untransfected T-REx CHO -celler jämfört med T-cell endast), och T-cells aktivering av sc-GAG-HLA-A2 (T-REx CHO celler som uttrycker höga nivåer av sc-GAG-HLA-A2 jämfört med untransfected T-REx CHO-celler). Untransfected T-REx CHO-celler eller T-REx CHO-celler som uttrycker sc-GAG-HLA-A2 inducerade inte aktivering av E183-HLA-A2-specifika CD8 + CTL klon, som bestäms av kvantifiera IFN-γ-produktion och uttryck av degranulering markör CD107a som ett mått på T-cell cytotoxicitet (figur 2AB). Uttryck för höga nivåer av agonist sc E183-HLA-A2, används som positiv kontroll, inducerad mycket effektiv IFN-γ-produktion och degranulering (figur 2AB), visar att den sc HLA-A2 konstruktionen kan erkännas av en specifik TCR att aktivera T-cell effector funktioner. Uttryck för låga nivåer av sc E183-HLA-A2 inducerad lägre nivåer av IFN-γ-produktion och degranulering, och detta förstärktes av förekomsten av samtidig agonist sc GAG-HLA-A2 (figur 2AB). Det måste noteras att mycket höga procentsatser av CD107a + T celler observerades även i svar på låga nivåer av antigena pMHC (figur 2B), överensstämmer med tidigare rapporter av relativt låga krav för den mängd agonist pMHC för induktion av T-cell cytotoxicitet33. CD107a MFI, som anger mängden degranulering på grundval av enskild cell ger en bättre dynamiskt omfång (figur 2B). T-cells aktivering analysen används tillåter samtidiga kvantifiering av två stora effektor funktioner: cytokin produktion och cytotoxicitet, och ger mycket känsliga avläsning med bra dynamiskt omfång.
Vi använde den enda kedja tekniken för att testa om TCR bindning till samtidig agonist pMHC krävs för samtidig agonist pMHC-beroende aktiveringen förbättring. Vi muterat valin på plats 152 på kanten av HLA-A2 peptid bindande räffla (figur 3B) till glutaminsyra skapa V152E mutant, eftersom denna mutation har rapporterats att avskaffa TCR bindning till HLA-A234. Vi testade sedan om V152E mutationen kan avskaffa TCR bindande för E183-HLA-A2 CTL klonen används, genom att införa denna mutation i agonist sc E183-HLA-A2 och att uttrycka den muterade agonist sc construct i T-REx CHO-celler. Vildtyp, men inte V152E, sc E183-HLA-A2 inducerad aktivering av E183-HLA-A2-specifika CTL klonen används (figur 3A). Det måste noteras att någon TCR-bindande mutation på MHC klass jag behöver testas separat för varje enskild TCR/T cell klon används, eftersom effekten av mutationen beror på de exakta molekylära interaktioner mellan TCR och pMHC komplex, och dessa kommer att variera mellan olika TCRs. Till exempel vi testade åtta mutationer, antingen tidigare rapporterat TCR-bindande mutationer eller mutationer förutspådde för att störa TCR bindande utan om upphävande av peptid bindande till HLA-A2. Av dessa var V152E den enda mutation som avskaffade aktivering av E183-specifika T-cell klonen används10. Vi introducerade V152E mutationen i samtidig agonist sc GAG-HLA-A2, och samtidig uttryckt WT eller V152E sc GAG-HLA-A2 med låga nivåer av agonist sc E183-HLA-A2. Både WT och V152E sc GAG-HLA-A2 förbättrad IFN-γ-produktion och degranulering (figur 3 cD), vilket tyder på att TCR bindning till samtidig agonist pMHC inte krävs för samtidig agonist pMHC-beroende CD8 + T cell aktivering förbättring. Enda kedja MHC klass I teknik, som presenteras här, kan användas för att ändra TCR eller coreceptor bindande till MHC klass I med kända peptid för att undersöka molekylära kraven för T cells antigen erkännande och aktivering.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59126/59126fig1.jpg"> Figur 1: enkel kedja HLA-A2 konstruktioner används för att undersöka samtidig agonist i mänskliga CD8 + T-cellsaktivering. (A) Schematisk bild av en SchlÃ-A2-konstruktion, som består av kovalent Signalera ordnar från smält mänskliga β2 mikroglobulin, peptid val, flexibla glycin-serine länkare (GGGGSGGGGS GGGGS), mänskliga β2 mikroglobulin, flexibel glycin-serine länkare och HLA-A2 tung kedja. (B) Schematisk bild av plasmidsna används för att generera bakåtkompilerade antigenpresenterande celler för att undersöka co-agonism i mänskliga CD8 + T cellaktivering: tetracyklin repressor, agonist sc E183-HLA-A2 under kontroll av tetracyklin-inducerbara arrangören, icke-stimulerande samarbete agonist sc GAG-HLA-A2 under kontroll av konstitutivt aktiv arrangören. (C) Schematisk bild av den konstruerade antigenpresenterande celler används för att undersöka co-agonism: T-REx CHO-celler (ingen mänsklig MHC uttryck), T-REx CHO-celler som uttrycker konstitutivt höga nivåer av sc GAG-HLA-A2 (icke-stimulerande samarbete agonist pMHC), T-REx CHO-celler som uttrycker ”läckande” lågt antal sc E183-HLA-A2 i avsaknad av tetracyklin (låg nivå av agonist peptid), celler T-REx CHO-celler som uttrycker höga nivåer av sc E183-HLA-A2 i närvaro av tetracyklin (hög nivå av agonist peptid), T-REx CHO att uttrycka låga nivåer av sc E183-HLA-A2 och höga nivåer av sc GAG-HLA-A2 (låg nivå av agonist peptid) och hög nivå av co agonist peptid. (D) Cell surface färgning av den konstruerade antigenpresenterande cell linjer med anti-HLA-A2 antikroppen. De nummer som visas beteckna MFI värden för MHC fläcken i utfärda utegångsförbud för levande cell. Data representant 5 oberoende experiment (E) Cell surface färgning av den konstruerade antigenpresenterande cell linjer med TCR-liknande antikropp specifik mot HLA-A2 presenterar E183 peptid. De nummer som visas beteckna MFI värden för MHC fläcken i utfärda utegångsförbud för levande cell. Data representativa 5 oberoende experiment. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59126/59126fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59126/59126fig2v3.jpg"> Figur 2: förekomsten av samtidig agonist pMHC förbättrad cytokin produktion och degranulering av E183-HLA-A2-specifika mänskliga CD8 + CTL klon. (A) intracellulära IFN-γ färgning av HLA-A2-specifika mänskliga CD8 + CTL klon efter 3 h stimulering med indikerad konstruerad antigenpresenterande celler. De nummer som visas betecknar den andel positivt för IFN-γ färgning. Data representativa 3 oberoende experiment, varje utförd med tekniska exemplar. (B) cellen ytbehandlar CD107a färgning av HLA-A2-specifika mänskliga CD8 + CTL klon efter 3 h stimulering med indikerad konstruerad antigenpresenterande celler. De nummer som visas betecknar andelen som är positiva för CD107a färgning eller CD107a MFI för CD8 + T cell befolkningen. Data representativa 3 oberoende experiment, varje utförd med tekniska exemplar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59126/59126fig2v3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59126/59126fig3.jpg"> Figur 3: samtidig agonist – medierad T-cells aktivering förbättring kräver inte TCR bindning till den samtidig agonist pMHC komplexa. (A) V152E mutation i sc E183-HLA-A2 avskaffar aktivering av E183-HLA-A2-specifika mänskliga CD8 + CTL klonen. T-REx CHO-celler som uttrycker höga nivåer (tetracyklin induktion) av WT eller V152E mutant sc E183-HLA-A2 användes för att stimulera E183-HLA-A2-specifika mänskliga CD8 + CTL-klon för 3h. T-cellsaktivering kvantifierades med intracellulära IFN-γ färgning. De nummer som visas betecknar den andel positivt för IFN-γ färgning. Data representativa 3 oberoende experiment, varje utförd med tekniska exemplar. (B) platsen för V152E mutation inom peptid bindande spåret av HLA-A2. (C) V152E mutation på sc GAG-HLA-A2 samtidig agonist pMHC komplexa inte avskaffar co-agonist-beroende aktiveringen förbättring. Intracellulära IFN-γ färgning av HLA-A2-specifika mänskliga CD8 + CTL klon efter 4h stimulering med indikerad konstruerad antigenpresenterande celler. De nummer som visas betecknar den andel positivt för IFN-γ färgning. Data representativa 3 oberoende experiment, varje utförd med tekniska exemplar. (D) V152E mutation på sc GAG-HLA-A2 samtidig agonist pMHC komplexa inte avskaffar co-agonist-beroende aktiveringen förbättring. Cell surface CD107a färgning av HLA-A2-specifika mänskliga CD8 + CTL klon efter 3h stimulering med indikerad konstruerad antigenpresenterande celler. De nummer som visas betecknar andelen som är positiva för CD107a färgning eller CD107a MFI för CD8 + T cell befolkningen. Data representativa 3 oberoende experiment, varje utförd med tekniska exemplar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59126/59126fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Use of Single Chain MHC Technology to Investigate Co-agonism in Human CD8+ T Cell Activation at JoVE.com

Use of Single Chain MHC Technology to Investigate Co-agonism in Human CD8+ T Cell Activation

Användning av enda kedja MHC-teknik för att undersöka Co-agonism i mänskliga CD8 + T cellaktivering

Det här protokollet beskriver användningen av enda kedja MHC klass I komplex att undersöka molekylära interaktioner i mänskliga CD8 + T cellaktivering: generation av bakåtkompilerade antigenpresenterande celler som uttrycker enda kedja konstruerar, kultur av mänskliga CD8 + T cell klon och T-cells aktivering experiment.

Non-stimulatory self peptide MHC (pMHC) complexes do not induce T cell activation and effector functions, but can enhance T cell responses to agonist ...

Nonstimulatory peptid MHC-komplex aktiverar inte T-celler men kan förstärka T-cellens svar på agonistpeptid MHC. Detta protokoll beskriver ett experimentellt system för att undersöka co-agonism under mänskliga CD8 T cell aktivering. Vi uttrycker MHC-molekyler som enkelkedjade komplex med kovalent-linked tung kedja, beta-2-mikroglobulin, och peptiden.Detta gör det möjligt att införa mutationer i MHC molekyler presentera förutbestämda peptider. Detta protokoll använder mänskliga CTN klon, en specifik för en epitop av hepatit B-virus. Förstå mekanismen för co-agonism under T-cell svar mot hepatit kan bidra till utveckling av immunotropics mot denna virusinfektion.De presenterade metoderna kan användas i forskning och andra fundamentala aspekter av T-cellaktivering i humana T-cellsystem med känd peptid MHC-specificitet. Detta protokoll använder single-chain mänskliga MHC klass I molekyler, bestående av signalsekvens, peptid av intresse, länkaren, mänskliga beta-2-microglobulin linker, och MHC tung kedja. E1A3 peptid från hepatit B används som agonist peptid.Gag från HIV används som nonstimulatory peptid. De enkedsiga mänskliga MHC-molekylerna uttrycks i en hamster cellinje som innehåller tetracyklin förtryckare. Agonist single-chain MHC uttrycks med hjälp av tetracyklin-inducerbara plasmid, vilket resulterar i mycket låga uttrycksnivåer i avsaknad av tetracyklin, och höga uttrycksnivåer i närvaro av tetracyklin.CHO-celler som uttrycker låga nivåer av agonist peptid MHC är transfekterade med constitutively uttryckt nonstimulatory peptid MHC. Användning av detta experimentella system möjliggör jämförelse T-cell svar till agonist peptid MHC i närvaro eller frånvaro av nonstimulatory peptid MHC. För att påbörja detta förfarande, odla CHO-celler i en T-75 kolv, som beskrivs i textprotokollet.Dagen före T-cellens aktiveringsexperiment tvättar du cellerna i kolven med PBS. Lägg till en lösning som innehåller 05%trypsin och 2%EDTA i PBS, och inkubera i fem till tio minuter vid rumstemperatur. Med hjälp av ett ljusmikroskop observerar du cellerna för att se till att de har lossnat.Lägg sedan till komplett F12 i kolven för att stoppa trypsinizationen. Överför cellupphängningen till ett 15 milliliterrör. Centrifugera vid 400G i fem minuter, och ta bort supernatanten genom antingen pipettering eller dekantera.Åter upphäva cell pelleten i fem milliliter av komplett F12. Använd en hemocytometer för att räkna cellerna, och justera cellkoncentrationen till 200, 000 celler per milliliter i CF12. Tillsätt 50 till 60 nanogram per milliliter tetracyklin till agonist-bara prover för att framkalla stora mängder agonist pMHC klass I uttryck som en positiv kontroll.Efter detta, blanda CHO-cellerna antingen genom att vortexa eller pipettering. Tillsätt 100 mikroliter av cellupphängningen till varje brunn av en U-botten 96-brunnsplatta. Inkubera över natten vid 37 grader Celsius med 5%koldioxid.Dagen före experimentet, centrifug CTLS celler vid 400 gånger G och vid fyra grader Celsius i fem minuter. Använd en hemocytometer för att räkna cellerna, och åter avbryta dem med en densitet av en miljon celler per milliliter i kompletta mänskliga T-cell media utan cytokiner eller PHA. Inkubera CTLs natten på 37 grader Celsius med 5%koldioxid.Nästa dag centrifug T-cellerna vid 400 gånger G och vid fyra grader Celsius i fem minuter. Kasta supernatanten och dra tillbaka cellerna i 2 milliliter av kompletta serumfria medier. Använd en hemocytometer för att räkna T-cellerna och justera deras densitet till en miljon levande celler per milliliter i kompletta mänskliga T-cellmedier.Tillsätt anti-human CD107a antikropp vid en en till 100 utspädning, och Brefeldin A vid en en till 1000 utspädning. Därefter hämtar du 96-brunnsplattan som innehåller CHO-cellerna. Med hjälp av en pasteurpipett av glas aspirerar du media från CHO-cellerna.Tillsätt 200 mikroliter av T-cellsupphängningen till varje brunn. Samkultur T-cellerna med CHO-celler vid 37 grader Celsius med 5%koldioxid i tre till fyra timmar. I slutet av samkulturen centrifugerar 96-brunnsplattan vid 400 gånger G och fyra grader Celsius i fem minuter.Ta bort supernatanten genom att aspirera eller snärta. Lägg sedan till 2,5 mikroliter av CD3-antikroppar och 2,5 mikroliter av CD8-antikroppar i 50 mikroliter av 5%BSA i PBS till varje brunn, för cellyta antigenfärgning, och blanda genom pipettering. Inkubera proverna i mörker, och på is, i 30 minuter.Efter detta, tillsätt 150 mikroliter av tvätt buffert till varje brunn för att tvätta proverna. Centrifugera proverna vid 400 gånger G och vid fyra grader Celsius i fem minuter. Ta bort supernatanten genom att aspirera eller snärta.Ställ ut en fixering / permeabilization kit, och lägga till 100 mikroliter av fixering / permeabilization lösning till varje brunn, och pipetter att blanda. Inkubera på is i 20 minuter. Sedan centrifug plattan vid 400 gånger G vid fyra grader Celsius i fem minuter.Kassera supernatanten och tillsätt 200 mikroliter av 1X perm/tvättbuffert till varje brunn. Upprepa denna process från centrifugering genom att lägga till perm/tvättbufferten en gång. Efter detta, åter avbryta cellerna i 50 mikroliter perm/tvätt buffert som innehåller anti-interferon-gamma vid en koncentration av 3 mikrogram per milliliter.Inkubera på is i mörkret i 30 minuter. Därefter lägger du till 150 mikroliter av 1X perm/tvättbuffert. Centrifugera vid 400G, fyra grader Celsius, i fem minuter.Ta bort supernatanten och tillsätt 200 mikroliter av 1X perm/tvättbuffert. Centrifugera plattan igen vid 400 gånger G, fyra grader Celsius, i fem minuter, och ta bort supernatanten genom att aspirera eller snärta. Åter avbryta provet i 200 mikroliter av tvättbuffert och fortsätt med cytometrisk analys.En dag före experimentet, blanda CHO-cellerna antingen genom att virvel eller pipettering. Nästa lägga till en milliliter av cellen suspension till varje brunn av en 12-brunn tallrik. Inkubera över natten vid 37 grader Celsius med 5%koldioxid.På dagen för experimentet, använd en cell skrapa för att lossa CHO-cellerna från botten av varje brunn. Överför en milliliter av media som innehåller cellerna från varje brunn till FACS rör. Centrifugera vid 400 gånger G och vid fyra grader Celsius i fem minuter.Återuppskov i 100 mikroliter av anti-HLA-antikropp utspädd i tvättbuffert. Inkubera på is i 30 minuter. Lägg sedan till en milliliter tvättbuffert till varje CHO-prov.Centrifug vid 400 gånger G och vid fyra grader Celsius i fem minuter, och kasta supernatanten. Åter upphäva varje prov i 3 milliliter tvättbuffert, och fortsätt till flöde cytometry analys. I denna studie presenteras ett robust verktyg för undersökningen av molekylär interaktion under mänskliga CD8 positiva T cell aktivering.En konstruerad xenogenic system genereras som presenterar låga nivåer av agonist pMHC i närvaro eller avsaknad av co-agonist pMHC. Dessa konstruerade APC används sedan för att stimulera en E183-specifik mänsklig CD8-positiv T-cell klon. Otransfekterade CHO-celler, och CHO-celler som uttrycker det icke-timulatoriska enkedjekomplexet Gag-MHC, inducerar inte aktivering.Uttryck för höga nivåer av agonist single-chain E183-MHC komplex, som är den positiva kontrollen, ses för att framkalla mycket effektiv interferon-gamma produktion, och degranulation, visar att den enkedje E183 konstruera kan kännas igen av en specifik TCR att aktivera T-cell effector funktioner. Uttryck för låga nivåer av enkedjad E183-MHC komplexa inducera lägre nivåer av interferon-gamma produktion och degranulation, som var förstärkt genom närvaro av en nonstimulatory Gag-MHC komplex. Observera att mycket höga procentsatser av CD107a+T-celler observeras även som svar på låga nivåer av antigen pMHC, vilket är förenligt med tidigare studier.Förekomsten av nonstimulatory Gag-MHC-komplexet ökar dock CD107a MFI. Under detta förfarande är det avgörande att kontrollera agonist peptid MHC uttryck för att säkerställa lika agonist presentation med eller utan nonstimulatory peptid. Det är viktigt att kvantifiera agonist peptid MHC uttryck med hjälp av TCR-liknande antikroppar i varje experiment.Ett alternativt tillvägagångssätt är att använda stöds lipid bilayers, eller pärlor, presentera fast mängd agonist peptid MHC i närvaro av nonstimulatory peptid MHC. Dessa experimentella system bör tillåta testning av flera nonstimulatory peptidsekvenser för co-agonism. Den enkedje-MHC-teknologin kan användas för att undersöka molekylära interaktioner i CD4 T-cellaktivering, samt för att undersöka icke-klassiska MHC-molekyler.Detta protokoll använder mänskligt blod och mänskliga celler. Följ alla nödvändiga försiktighetsåtgärder när du arbetar med humant blod för att minska risken för överföring av blodburna sjukdomar.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Retroviral Transduction av T-cell receptorer i Mus T-celler

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Use of Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Användning av interferon-γ Enzymkopplad immunospot Analys att karaktärisera nya T-cellsepitoper av humant papillomvirus

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induktion av transplantat-mot-värd-sjukdom och<em&gt; In Vivo</em&gt; T cell övervakning med en MHC-matchade musmodell

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac transposon System Ändring av primära humana T-celler

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

Användning av fluorescerande Target matriser för bedömning av T-cellssvar<em&gt; In vivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flödescytometrisk analys av Natural Killer Cell lytisk aktivitet i humant helblod

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Analys av Simian Immunodeficiency Virus-specifika CD8<sup&gt; +</sup&gt; T-celler i rhesusmakaker av peptid-MHC-I tetramer färgning

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Mycket multiplexerad, superupplösning av T-celler med hjälp av madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

In Situ MHC-tetramer färgning och kvantitativ analys att bestämma plats, överflöd och fenotyp av Antigen-specifika CD8 T-celler i vävnader

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...