Name: construction and use of an electrical stimulation chamber for enhancing osteogenic differentiation in mesenchymal stem/stromal cells in vitro
Uploaded: 2019-01-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro at JoVE.com

بتأييد هذا العمل جزئيا بمنحه بدء مؤسسة AO (ح ق-14-03) ومؤسسة فريدريتششيم (فريدريتششيم Stiftung) مقره في فرانكفورت، ألمانيا.

1-تشييد قاعة الثقافة الخلية التحفيز الكهربائي
<ol><li>لبناء قاعة إستيم، جمع أغطية اثنين من لوحات قياسية 6-جيدا خلية الثقافة؛ سلك البلاتين 99.99 ٪، 60 سم في طول قطرها من 0.5 – 1 مم؛ المغلفة بالفضة الأسلاك النحاسية، 70 سم في طول قطرها 0.6 مم؛ كماشة؛ مجموعة لحام الحديد؛ أنبوب واحد من الغراء فائقة التوصي?...

<ol>
	<li>Oryan, A., Kamali, A., Moshiri, A., Baghaban Eslaminejad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Bone+Regenerative+Medicine:+What+Is+the+Evidence?.">Role of Mesenchymal Stem Cells in Bone Regenerative Medicine: What Is the Evidence?.</a> Cells, Tissues, Organs. 204 (2), 59-83 (2017).</li><li>Mauney, J. R., Volloch, V., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Adult+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Bone+Tissue+Engineering+Applications:+Current+Status+and+Future+Prospects.">Role of Adult Mesenchymal Stem Cells in Bone Tissue Engineering Applications: Current Status and Future Prospects.</a> Tissue Engineering. 11 (5-6), 787-802 (2005).</li><li>Mobini, S., Leppik, L., Thottakkattumana Parameswaran, V., Barker, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+effect+of+direct+current+electrical+stimulation+on+rat+mesenchymal+stem+cells.">In vitro effect of direct current electrical stimulation on rat mesenchymal stem cells.</a> PeerJ. 5, e2821 (2017).</li><li>Leppik, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+electrical+stimulation+and+tissue+engineering+to+treat+large+bone+defects+in+a+rat+model.">Combining electrical stimulation and tissue engineering to treat large bone defects in a rat model.</a> Scientific Reports. 8 (1), S1 (2018).</li><li>Song, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+direct+current+electric+fields+to+cells+and+tissues+in+vitro+and+modulation+of+wound+electric+field+in+vivo.">Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo.</a> Nature Protocols. 2 (6), 1479-1489 (2007).</li><li>Hronik-Tupaj, M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+responses+of+two-+and+three-dimensional+engineered+tissues+to+electric+fields.">A review of the responses of two- and three-dimensional engineered tissues to electric fields.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 18 (3), 167-180 (2012).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+for+isolation+and+culture+of+mesenchymal+stem+cells+from+mouse+bone+marrow.">An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow.</a> Journal of Orthopaedic Translation. 3 (1), 26-33 (2015).</li><li>Nau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineered+vascularized+periosteal+flap+enriched+with+MSC/EPCs+for+the+treatment+of+large+bone+defects+in+rats.">Tissue engineered vascularized periosteal flap enriched with MSC/EPCs for the treatment of large bone defects in rats.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 907-917 (2017).</li><li>Eischen-Loges, M., Oliveira, K. M. C., Bhavsar, M. B., Barker, J. H., Leppik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretreating+mesenchymal+stem+cells+with+electrical+stimulation+causes+sustained+long-lasting+pro-osteogenic+effects.">Pretreating mesenchymal stem cells with electrical stimulation causes sustained long-lasting pro-osteogenic effects.</a> PeerJ. 6, 4959 (2018).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Curtis, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EF1alpha+and+RPL13a+represent+normalization+genes+suitable+for+RT-qPCR+analysis+of+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells.">EF1alpha and RPL13a represent normalization genes suitable for RT-qPCR analysis of bone marrow derived mesenchymal stem cells.</a> BMC Molecular Biology. 11, 61 (2010).</li><li>Wang, L., Li, Z. -. y., Wang, Y. -. p., Wu, Z. -. h., Yu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Expression+Profiles+of+Marker+Genes+in+Osteogenic+Differentiation+of+Human+Bone+Marrow-derived+Mesenchymal+Stem+Cells.">Dynamic Expression Profiles of Marker Genes in Osteogenic Differentiation of Human Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Chinese Medical Sciences Journal (Chung-kuo i hsueh k'o hsueh tsa chih). 30 (2), 108-113 (2015).</li><li>Kim, H. B., Ahn, S., Jang, H. J., Sim, S. B., Kim, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+corrosion+behaviors+and+surface+profiles+of+platinum-coated+electrodes+by+electrochemistry+and+complementary+microscopy:+biomedical+implications+for+anticancer+therapy.">Evaluation of corrosion behaviors and surface profiles of platinum-coated electrodes by electrochemistry and complementary microscopy: biomedical implications for anticancer therapy.</a> Micron. 38 (7), 747-753 (2007).</li><li>Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+field-induced+migration+and+intercellular+stress+alignment+in+a+collective+epithelial+monolayer.">Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer.</a> Molecular Biology of the Cell. , mbcE18010077 (2018).</li><li>Tai, G., Tai, M., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrically+stimulated+cell+migration+and+its+contribution+to+wound+healing.">Electrically stimulated cell migration and its contribution to wound healing.</a> Burns &amp; Trauma. 6, 20 (2018).</li><li>Love, M. R., Palee, S., Chattipakorn, S. C., Chattipakorn, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+electrical+stimulation+on+cell+proliferation+and+apoptosis.">Effects of electrical stimulation on cell proliferation and apoptosis.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (3), 1860-1876 (2018).</li><li>Adams, D. S., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+principles+for+measuring+resting+membrane+potential+and+ion+concentration+using+fluorescent+bioelectricity+reporters.">General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 385-397 (2012).</li><li>Jin, G., Li, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electrically+conductive+scaffold+as+the+skeleton+of+stem+cell+niche+in+regenerative+medicine.">The electrically conductive scaffold as the skeleton of stem cell niche in regenerative medicine.</a> Materials Science &amp; Engineering. C, Materials for Biological Applications. 45, 671-681 (2014).</li><li>Hronik-Tupaj, M., Rice, W. L., Cronin-Golomb, M., Kaplan, D. L., Georgakoudi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblastic+differentiation+and+stress+response+of+human+mesenchymal+stem+cells+exposed+to+alternating+current+electric+fields.">Osteoblastic differentiation and stress response of human mesenchymal stem cells exposed to alternating current electric fields.</a> Biomedical Engineering Online. 10, 9 (2011).</li></ol>

هنا يصف لنا بناء غرفة وأسلوب لعلاج الخلايا الجذعية الوسيطة مع إستيم التي ينتج عنها تعزيز التمايز أوستيوجينيك.
الإعداد إستيم قدم لا تتطلب معدات خاصة والمعرفة، ويمكن أن يؤديها الباحثين المبتدئين في مختبر علم الأحياء/الكيمياء حيوية لخلايا الجذعية قياسية. ومع ذلك، عند بناء وا...

زيادة في الصدمات النفسية و/أو تشوهات العظام التي يسببها المرض يعالجون باستخدام تركيبات مختلفة من العلاج بالخلايا وتقنيات الطب التجديدي. MSCs هي الخلية المختارة في هذه العلاجات، بسبب نشاط osteogenic عالية نسبيا، والعزلة وكفاءتها التوسع، وسلامة1. لتحقيق أقصى قدر من النشاط أوستيوجينيك، وهكذا، تحسين فعاليتها العلاجية، أدخلت عدة أساليب للتلاعب MSCs قبل استخدامها في هذه العلاجات (كما استعرضها موني et al.2). أحد هذه الأساليب هو إستيم، التي أبدت تعزيز التمايز أوستيوجينيك ماجستير في المختبر3 وتعزيز العظام شفاء المجراة في4. وعلى الرغم من تزايد عدد الدراسات التي تركز على علاج MSCs مع إستيم، نظام أمثل لتحقيق أقصى قدر من التأثير برو osteogenic إستيم في لم تتحدد.
استخدام أساليب أخرى في المختبر باستخدام إستيم الملح الجسور مغمورة في الأجلين المتوسط والثقافة، الذي يفصل بين الخلايا من أقطاب معدنية5. وميزة هذا هو أن إيصال إستيم عبر الجسور الملح يزيل إدخال مشتقات كيميائية (مثلاً، التآكل من أقطاب معدنية) التي قد تكون سامة للخلايا. وعلى الرغم من هذه الميزة، الجسور الملح مرهقة للعمل مع، واستيم وهي إيصال تختلف عن التي تم تسليمها في النماذج الحية، مما يجعل من الصعب على الربط بين النتائج التي تم الحصول عليها عند استخدام هذين النظامين. الأجهزة التي تقدم إستيم عبر أقطاب معدنية أو الكربون ثابتة داخل الآبار ثقافة الخلية (كما استعرضها توباي هرنيك وكابلان6) أفضل محاكاة الأجهزة المستخدمة في فيفو؛ ومع ذلك، هذه الأجهزة صعبة لتنظيف/تعقيم بين الاستخدامات وعدد الخلايا التي يمكن دراستها بكل تجربة محدودة. لقد قمنا بتصميم قاعة إستيم المقدمة هنا على وجه التحديد لمعالجة أوجه القصور في هذه الأجهزة الأخرى. في حين كان معظم من تجربتنا باستخدام هذه الدائرة إستيم مع 2D والثقافات ثلاثية الأبعاد تحتوي على نخاع العظام والدهنية-الأنسجة-المستمدة من MSCs3،4، فائدة كبيرة من هذه الدائرة أن من تنوعاً ومع طفيفة نسبيا التغييرات، يمكن تكييفها لدراسة أنواع الخلايا الأخرى ضمن مجموعة متنوعة من الظروف المختلفة.
هنا يمكننا وصف بناء دائرة الثقافة الخلية إستيم؛ ثم، علينا أن نظهر استخدام MSCs معاملة مع أنظمة مختلفة من إستيم وقياس أثر على التمايز أوستيوجينيك. يتم تقييم التمايز osteogenic لجنة السلامة البحرية عن طريق ترسب الكالسيوم والنشاط الفوسفاتيز القلوية، وعلامة أوستيوجينيك التعبير الجيني. الأهم من ذلك، في الماضي التجارب التي تستخدم هذا الإعداد، لاحظنا أن تستمر هذه الآثار برو أوستيوجينيك بعد فترة طويلة من توقف العلاج إستيم.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Estim fabrication</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Banana connector/Jack adaptor</td>
			<td>Poppstars</td>
			<td>1008554</td>
			<td>2 pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutting pliers</td>
			<td>Knipex</td>
			<td>78 03 125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC power supply (0-30V/0-3A)</td>
			<td>B&#38;K Precision</td>
			<td>Model 9130B</td>
			<td>Any simular model could be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulated flexible wires (0.14 mm2)</td>
			<td>Conrad Electronic International</td>
			<td>604794, 604093</td>
			<td>2 pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-corrosive silicone rubber</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3140 RTV</td>
			<td>*could be purchased by many stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Wire (999,5/1000; 1mm &#248;)</td>
			<td>Junker Edelmetalle</td>
			<td>00D-3010</td>
			<td>0.6 m needed for 1 Estim chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol solution</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td>Sterilisation of Estim chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver coated copper wire (0.6 mm &#248;)</td>
			<td>Conrad Electronic International</td>
			<td>409334 - 62</td>
			<td>&#8776;70 cm needed for 1 Estim device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering iron Set</td>
			<td>Conrad Electronic International</td>
			<td>1611410 - 62</td>
			<td>Any simular model could be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP 6-well plate lid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z707759-126EA</td>
			<td>2 lids for Estim chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.2V wired circular LEDs</td>
			<td>Conrad Electronic International</td>
			<td>599525 - 62</td>
			<td>6 pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UHU Super glue</td>
			<td>UHU GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>n/a</td>
			<td>*could be purchased by many stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Glycerophosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td>osteogenic cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>21885025</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td>osteogenic cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Falcon tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,547,004</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td>osteogenic cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague-Dawley (SD) rat mesenchymal stem cells, bone marrow origin</td>
			<td>Cyagen</td>
			<td>RASMX-01001</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell detachment solution</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>cell culture, cell detachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Flask, T75</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833911302</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP 6-well plates</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z707759-126EA</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Dye, 0.4% solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1450021</td>
			<td>cell count</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction and use of an electrical stimulation chamber for enhancing osteogenic differentiation in mesenchymal stem/stromal cells in vitro

وقد استخدمت على نطاق واسع الخلايا الجذعية الوسيطة/stromal (MSCs) التئام العظام في الأنسجة الهندسة النهج. التحفيز الكهربائي (إستيم) قد ثبت لزيادة التمايز أوستيوجينيك ماجستير في المختبر وتعزيز العظام شفاء في إعدادات السريرية. هنا يمكننا وصف بناء دائرة الثقافة الخلية إستيم واستخدامها في علاج الفئران MSC المشتقة من نخاع العظام لتعزيز التمايز أوستيوجينيك. لقد وجدنا أن علاج MSCs مع إستيم لمدة 7 أيام يؤدي إلى زيادة كبيرة في التفريق بين أوستيوجينيك، والأهم من ذلك، يستمر هذا التأثير برو أوستيوجينيك بعد فترة طويلة من توقف إستيم (7 أيام). يمكن استخدام هذا النهج لتقشير MSCs مع إستيم لتعزيز التمايز أوستيوجينيك لتحسين نسيج العظام الهندسة نتائج العلاج، وهكذا، تساعدهم على تحقيق إمكاناتهم الكاملة العلاجية. وبالإضافة إلى هذا التطبيق، يمكن أيضا استخدام هذا إستيم خلية دائرة الثقافة والبروتوكول للتحقيق في السلوكيات خلية إستيم الحساسة الأخرى، مثل الهجرة والانتشار والمبرمج ومرفق السقالة.

لتقييم تأثير 100 mV/مم من إستيم على التفريق بين osteogenic MSCs، الخلايا تعامل مع إستيم 3، 7، و 14 يوما أو نونتريتيد (مراقبة) حللت في يوم 14 من استزراع بتقييم التغييرات الشكلية وترسب الكالسيوم (الشكل 2 ). وقد تم ذلك بتصوير الخلايا باستخدام مشرق الميدان مجهرية (تغيرات مور?...

Watch this Scientific Journal Video about Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro at JoVE.com

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

نقدم هنا بروتوكولا لبناء دائرة الثقافة الخلية مصممة للكشف عن خلايا لأنواع مختلفة من التحفيز الكهربائي، واستخدامها في علاج الخلايا الجذعية الوسيطة لتعزيز التمايز أوستيوجينيك.

بناء واستخدام دائرة التحفيز الكهربائي لتعزيز Osteogenic التمايز في الخلايا الجذعية الوسيطة/اللحمية في المختبر

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

هنا، نعرض كيفية بناء غرفة التحفيز الكهربائي باستخدام لوحات زراعة الحائط الستة الشائعة، وكيفية استخدامها من أجل تحفيز التمايز العظمي في الخلايا الجذعية الليسينشيمال. هذه الغرفة سهلة وغير مكلفة لبناء، ويمكن إعادة استخدامها في تجارب متعددة. بعد المعالجة المسبقة بالتحفيز الكهربائي في غرفتنا، يمكن استخدام الخلايا الجذعية النخاعية لتحسين النتائج في علاجات هندسة الأنسجة العظمية.ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الغرفة للتحقيق في أنواع الخلايا الأخرى وسلوكيات الخلايا الكهربائية الحساسة مثل الهجرة، والانتشار، والتغيرات في الغشاء المحتملة، المبرمج، والتعلق الدقيق. في غطاء لوحة الآبار الستة، ضع علامة على ثقبين قطرهما ملليمتر واحد، 25 ملليمتراً عن بعضها البعض، بالقرب من الحافة الخارجية لكل بئر من الآبار الستة. بعد ذلك، قطع سلك البلاتين إلى 12 أقسام طولها خمسة سنتيمترات.ينحني يدويا كل مقطع خمسة سنتيمترات في شكل L "، وترك نهاية واحدة ثلاثة سنتيمترات طويلة، والآخرين سنتيمترين طويلة. ثم، قطع السلك المغلفة بالفضة إلى أطوال 35 سنتيمتر. أدخل الطرف الأطول عازمة من سلك البلاتين في حفرة حفر، وترك واحد إلى اثنين ملليمتر جاحظ من خارج الغطاء.ثنيه باستخدام ملقط. بعد ذلك، قم بتأمين الأسلاك البلاتينية في ثقوب الغطاء مع الغراء فائقة موصلة وتركها لتجف لمدة ست ساعات تقريبا. لتحضير الكاثود، لحام نصائح من جميع الأسلاك البلاتينية الستة تبرز من الغطاء إلى أحد الأسلاك المغلفة بالفضة.لإعداد الأنودات، لحام الأسلاك البلاتينية الستة المتبقية إلى أسلاك أخرى مغلفة بالفضة. في وقت لاحق، إضافة المصابيح في الدائرة بين كل من أزواج القطب البلاتينية الستة القطب الأنود-الكاثود لتأكيد الأداء الوظيفي. ضع قطعة من شريط العزل الأسود تحت كل LED لمنع تعريض الخلايا في لوحات الثقافة إلى ضوء LED.بعد ذلك، الغراء موصل كتلة محطة الأسلاك إلى الزاوية اليسرى العليا من غطاء لوحة ستة جيدا، وربط كلا الأسلاك المغلفة بالفضة إلى محطات الإدخال. ثم، قطع 20 ملليمتر من 20 ملم مقطع مربع 20 ملليمتر من الزاوية اليسرى العليا من غطاء لوحة ستة جيدا الثانية، لاستيعاب موصل كتلة المحطة الطرفية على الغطاء الأول. غطي الغطاء الأول، المجهز بالأقطاب الكهربائية، مع الغطاء الثاني، والصقه مع شريط لاصق.قم بتوصيل أحد طرفي السلكين النحاسيين المعزولين القياسيين بمحطات إخراج موصل السلك، وينتهي الآخر بموصلات الموز الذكورية. قم بتشغيل مصدر الطاقة عن طريق الضغط على زر ON-OFF الموجود في اللوحة الأمامية. قم بتنشيط القناة الأولى بالضغط على الزر الأول.بعد ذلك، اضغط على زر أربعة لضبط الجهد. تعيين الإخراج تحميل في 2.5 فولت. ثم اضغط على Enter.في اليوم الذي يتم التعامل مع الخلايا مع الجذعية E، تعقيم الأقطاب الكهربائية في محلول الإيثانول 70٪لمدة 30 دقيقة. ثم جففها تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في خزانة أمان لمدة 30 دقيقة إضافية. في غطاء تدفق لامينر، قم بتغطية لوحة الستة آبار التي تحتوي على MSCs المستزرعة مع الغطاء المجهز بالأقطاب الكهربائية، مع التأكد من أن الأقطاب مغمورة بالكامل في الوسط.ثم، نقل لوحة ستة-جيدا مغطاة مع الخلايا إلى الحاضنة وتوصيل الأسلاك الخاصة به إلى إمدادات الطاقة. المقبل، تعيين إمدادات الطاقة إلى 2.5 فولت تحميل الانتاج وعلاج الخلايا مع الجذعية E لمدة ساعة واحدة. بعد التحفيز، افصل التيار الكهربائي وإزالة غرفة الجذعية E من الحاضنة.في ظل ظروف معقمة، استبدل الغطاء، المجهز بأقطاب كهربائية، مع غطاء لوحة قياسي من ستة آبار. بعد ذلك، إعادة الخلايا إلى الحاضنة، وتركها بين عشية وضحاها. تنظيف الأقطاب الكهربائية، أولا مع برنامج تلفزيوني، ومن ثم مع محلول الإيثانول 70٪.ثم، تنظيف المنتجات التآكل المتراكمة من سطح القطب مع الصنفرة غرامة. كرر علاج الجذعية E لمدة ستة أيام متتالية. في اليوم الرابع، قبل تطبيق التحفيز الكهربائي، وتحت ظروف معقمة، تغيير وسيلة الثقافة عن طريق التعرق 1.5 ملليلتر من المتوسطة واستبدالها مع 1.5 ملليلتر من قبل الدافئة، وتمايز العظام الطازجة المتوسطة.بعد تطبيق التحفيز الكهربائي لمدة سبعة أيام متتالية، والحفاظ على الخلايا في الثقافة لمدة سبعة أيام إضافية، وتبادل المتوسطة كل ثلاثة إلى أربعة أيام. عند الانتهاء من العلاج، وتحليل التغيرات مورفولوجيا الخلية تحت المجهر. لتقييم تأثير التحفيز الكهربائي على تمايز العظام MSC، وقياس ترسب الكالسيوم، والنشاط الفوستالوز القلوية، والتعبير الجيني للعلامة العظمية، كما هو موضح في أماكن أخرى.لتقييم تأثير 100 ملليفولت لكل ملليمتر من التحفيز الكهربائي على تمايز العظم MSC، تم تحليل الخلايا المعالجة بالتحفيز الكهربائي لمدة ثلاثة وسبعة و14 يومًا والخلايا غير المعالجة، في اليوم 14 من الثقافة من خلال تقييم التغيرات المورفولوجية وترسب الكالسيوم. وكانت التغيرات الكبيرة في مورفولوجيا الخلية ورواسب الكالسيوم مرئية في الخلايا المعالجة بالتحفيز الكهربائي لمدة سبعة أيام و14 يوماً. تم إجراء تحليل مفصل لتغيرات التعبير الجيني للعلامة العظمية في الأيام الثلاثة والسابعة والـ 14 من الثقافة.في اليوم السابع من الثقافة ، كان التعبير RunX2 أعلى بكثير في الخلايا المعالجة بالتحفيز الكهربائي لمدة سبعة أيام. في حين أن تعبير Colla1 كان أعلى بكثير في الخلايا المعالجة لمدة سبعة أيام، وقياس في اليوم 14 من الثقافة. زاد التعبير عن أوستيوبونتين بشكل كبير في الخلايا المحفزة كهربائيًا في الأيام الثلاثة و7 و14 من الثقافة.كان تعبير أوستريكس غائبًا في خلايا التحكم في جميع النقاط الزمنية ، وشوهد فقط في سبعة أيام و14 يومًا من الثقافة في الخلايا المعرضة للتحفيز الكهربائي. غرفة التحفيز الكهربائي من السهل نسبيا لبناء. ومع ذلك، يجب توخي الحذر خاصة عند التعامل مع الأسلاك البلاتين، وأيضا عند تنظيف وتعقيم الأقطاب الكهربائية.يمكن زرع الخلايا المعالجة مسبقًا للكهرباء في غرفتنا ، بمفردها أو الجلوس على مادة سقالة ، في نماذج حيوانية ، لدراسة كيفية استمرار التأثير الإيجابي للتحفيز الكهربائي في المختبر. هذه التقنية توفر أداة بسيطة ولكنها قوية لدراسة الآلية التي ينظم التحفيز الكهربائي وظائف الخلايا. هذه المعرفة يمكن أن تكون متاحة في خلايا الطب التجديدي.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

مناديل الهندسة العضلات الهيكلية من الفئران الخلايا الاصلية Myoblast وتطبيق تحفيز الكهربائية

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

العين تهيج اختبار (EIT) لتحديد مخاطر العين مهيج للمواد الكيميائية باستخدام يعيد الإنسان القرنية مثل الظهارية (RHCE) الأنسجة نموذج

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

مجمع متضاعف الكتروليتي للهيبارين ربط تسليم عظمية عامل نمو المجال

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

ل<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج الثقافة الجهاز من الفئران فقرات القرص

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

تحسين 3D المائية الثقافات من الخلايا الدبقية الأولية لنمذجة في المختبر نيوروينفلاميشن

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

عزل الخلايا الجذعية الوسيطة من السمحاق السنخية البشرية وآثار فيتامين د على نشاط الخلايا المستمدة من السمحاق أوستيوجينيك

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential

التحفيز الكهربائية والميكانيكية المتزامنة لتعزيز إمكانات كارديوميوجينيك الخلايا

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

نماذج متقدمة الكبد 3D لاختبار السمية الجينية في المختبر بعد التعرض للمواد النانوية على المدى الطويل

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling

أسلاك السيليكون النانوية والتحفيز البصري للتحقيقات من اقتران داخل وفيما بين الخلايا الكهربائية

Myofibroblasts can spontaneously internalize silicon nanowires (SiNWs), making them an attractive target for bioelectronic applications. These ...

Simple, Affordable, and Modular Patterning of Cells using DNA

بسيطة، بأسعار معقولة، ونمط وحدات من الخلايا باستخدام الحمض النووي

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells ...