Name: construction and use of an electrical stimulation chamber for enhancing osteogenic differentiation in mesenchymal stem/stromal cells in vitro
Uploaded: 2019-01-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet i en del af en AO Foundation starttilskud (S-14-03 H) og Friedrichsheim-fonden (Stiftung Friedrichsheim) hjemsted i Frankfurt am Main, Tyskland.

1. opførelse af elektrisk stimulation celle kultur kammer
<ol><li>For at opbygge EStim kammer, indsamle to låg af standard 6-godt celle kultur plader; 99,99% platin wire, 60 cm i længden med en diameter på 0,5-1 mm; sølv-belagte kobbertråd, 70 cm i længden med en diameter på 0,6 mm; Cutting tænger; loddekolbe sæt; et rør af superledende lim; én ledning klemmerække stik, seks små 2,2 V lysdioder (valgfri); en tube af noncorrosive silikone klæbemiddel belægning (valgfri); en rulle sorte elektriske isoleri...

<ol>
	<li>Oryan, A., Kamali, A., Moshiri, A., Baghaban Eslaminejad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Bone+Regenerative+Medicine:+What+Is+the+Evidence?.">Role of Mesenchymal Stem Cells in Bone Regenerative Medicine: What Is the Evidence?.</a> Cells, Tissues, Organs. 204 (2), 59-83 (2017).</li><li>Mauney, J. R., Volloch, V., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Adult+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Bone+Tissue+Engineering+Applications:+Current+Status+and+Future+Prospects.">Role of Adult Mesenchymal Stem Cells in Bone Tissue Engineering Applications: Current Status and Future Prospects.</a> Tissue Engineering. 11 (5-6), 787-802 (2005).</li><li>Mobini, S., Leppik, L., Thottakkattumana Parameswaran, V., Barker, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+effect+of+direct+current+electrical+stimulation+on+rat+mesenchymal+stem+cells.">In vitro effect of direct current electrical stimulation on rat mesenchymal stem cells.</a> PeerJ. 5, e2821 (2017).</li><li>Leppik, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+electrical+stimulation+and+tissue+engineering+to+treat+large+bone+defects+in+a+rat+model.">Combining electrical stimulation and tissue engineering to treat large bone defects in a rat model.</a> Scientific Reports. 8 (1), S1 (2018).</li><li>Song, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+direct+current+electric+fields+to+cells+and+tissues+in+vitro+and+modulation+of+wound+electric+field+in+vivo.">Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo.</a> Nature Protocols. 2 (6), 1479-1489 (2007).</li><li>Hronik-Tupaj, M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+responses+of+two-+and+three-dimensional+engineered+tissues+to+electric+fields.">A review of the responses of two- and three-dimensional engineered tissues to electric fields.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 18 (3), 167-180 (2012).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+for+isolation+and+culture+of+mesenchymal+stem+cells+from+mouse+bone+marrow.">An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow.</a> Journal of Orthopaedic Translation. 3 (1), 26-33 (2015).</li><li>Nau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineered+vascularized+periosteal+flap+enriched+with+MSC/EPCs+for+the+treatment+of+large+bone+defects+in+rats.">Tissue engineered vascularized periosteal flap enriched with MSC/EPCs for the treatment of large bone defects in rats.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 907-917 (2017).</li><li>Eischen-Loges, M., Oliveira, K. M. C., Bhavsar, M. B., Barker, J. H., Leppik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretreating+mesenchymal+stem+cells+with+electrical+stimulation+causes+sustained+long-lasting+pro-osteogenic+effects.">Pretreating mesenchymal stem cells with electrical stimulation causes sustained long-lasting pro-osteogenic effects.</a> PeerJ. 6, 4959 (2018).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Curtis, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EF1alpha+and+RPL13a+represent+normalization+genes+suitable+for+RT-qPCR+analysis+of+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells.">EF1alpha and RPL13a represent normalization genes suitable for RT-qPCR analysis of bone marrow derived mesenchymal stem cells.</a> BMC Molecular Biology. 11, 61 (2010).</li><li>Wang, L., Li, Z. -. y., Wang, Y. -. p., Wu, Z. -. h., Yu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Expression+Profiles+of+Marker+Genes+in+Osteogenic+Differentiation+of+Human+Bone+Marrow-derived+Mesenchymal+Stem+Cells.">Dynamic Expression Profiles of Marker Genes in Osteogenic Differentiation of Human Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Chinese Medical Sciences Journal (Chung-kuo i hsueh k'o hsueh tsa chih). 30 (2), 108-113 (2015).</li><li>Kim, H. B., Ahn, S., Jang, H. J., Sim, S. B., Kim, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+corrosion+behaviors+and+surface+profiles+of+platinum-coated+electrodes+by+electrochemistry+and+complementary+microscopy:+biomedical+implications+for+anticancer+therapy.">Evaluation of corrosion behaviors and surface profiles of platinum-coated electrodes by electrochemistry and complementary microscopy: biomedical implications for anticancer therapy.</a> Micron. 38 (7), 747-753 (2007).</li><li>Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+field-induced+migration+and+intercellular+stress+alignment+in+a+collective+epithelial+monolayer.">Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer.</a> Molecular Biology of the Cell. , mbcE18010077 (2018).</li><li>Tai, G., Tai, M., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrically+stimulated+cell+migration+and+its+contribution+to+wound+healing.">Electrically stimulated cell migration and its contribution to wound healing.</a> Burns &amp; Trauma. 6, 20 (2018).</li><li>Love, M. R., Palee, S., Chattipakorn, S. C., Chattipakorn, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+electrical+stimulation+on+cell+proliferation+and+apoptosis.">Effects of electrical stimulation on cell proliferation and apoptosis.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (3), 1860-1876 (2018).</li><li>Adams, D. S., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+principles+for+measuring+resting+membrane+potential+and+ion+concentration+using+fluorescent+bioelectricity+reporters.">General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 385-397 (2012).</li><li>Jin, G., Li, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electrically+conductive+scaffold+as+the+skeleton+of+stem+cell+niche+in+regenerative+medicine.">The electrically conductive scaffold as the skeleton of stem cell niche in regenerative medicine.</a> Materials Science &amp; Engineering. C, Materials for Biological Applications. 45, 671-681 (2014).</li><li>Hronik-Tupaj, M., Rice, W. L., Cronin-Golomb, M., Kaplan, D. L., Georgakoudi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblastic+differentiation+and+stress+response+of+human+mesenchymal+stem+cells+exposed+to+alternating+current+electric+fields.">Osteoblastic differentiation and stress response of human mesenchymal stem cells exposed to alternating current electric fields.</a> Biomedical Engineering Online. 10, 9 (2011).</li></ol>

Her beskriver vi opførelsen af et kammer og en metode til behandling af mesenkymale stamceller med EStim, der resulterer i øget osteogenic differentiering.
Opsætningen EStim præsenteret kræver ikke specialviden udstyr og kan udføres i en standard stamcelle biologi/biokemi laboratorium af yngre forskere. Når bygge og bruge EStim kammer, skal særlig forsigtig træffes i et par kritiske trin. Når du håndterer platin elektroderne, skal ekstra pleje tages som dette metal er meget formbart...

En forøgelse af traumer og/eller sygdom-induceret knogledefekter bliver behandlet ved hjælp af forskellige kombinationer af celleterapi og regenerativ medicin teknologier. MSC'er er celle valg i sådanne behandlinger, på grund af deres relativt høje osteogenic aktivitet, isolation og ekspansion effektivitet og sikkerhed1. For at maksimere deres osteogenic aktivitet, og dermed optimere deres terapeutiske effektivitet, der er indført flere metoder til at manipulere MSCs forud for deres anvendelse i disse behandlinger (som anmelder af Mauney et al.2). En sådan metode er EStim, som har vist sig at forbedre MSC osteogenic differentiering i vitro3 og fremme knogle heling in vivo4. Trods det stigende antal undersøgelser med fokus på behandling af MSCs med EStim, endnu en optimal regime til at maksimere Estim's pro-osteogenic effekt ikke defineres.
Andre in vitro-metoder, EStim udnytte salt broer neddykket i substratet, som adskiller celler fra metallisk elektroder5. Fordelen ved dette er, at levere EStim gennem salt broer eliminerer indførelsen af kemiske biprodukter (fx, korrosion i metalliske elektroder) der kan være cytotoksiske. Trods denne fordel, salt broer er besværlige at arbejde med og EStim de levere adskiller sig fra de leverede i in vivo modeller, hvilket gør det vanskeligt at korrelere resultater, der opnås ved brug af de to systemer. Opsætninger, der leverer EStim via metalliske eller carbon elektroder fast inde i celle kultur wells simulere (som anmelder af Hronik-Tupaj og Kaplan6) bedre enheder, der bruges i vivo; men disse enheder er vanskelige at rengøre/sterilisere mellem bruger og antallet af celler, der kan studeres pr. eksperiment er begrænset. Vi designede EStim salen præsenteres her specifikt for at løse begrænsningerne af disse andre opsætninger. Mens de fleste af vores erfaring med at bruge denne EStim afdeling har været med 2D og 3D kulturer indeholdende knoglemarv - og fedtholdigt-væv-afledt MSCs3,4, en stor fordel af salen er der det er alsidig, og med mindre relativt ændringer, kan tilpasses til at studere andre celletyper under en række forskellige betingelser.
Her beskriver vi opførelsen af en EStim celle kultur kammer; derefter, vi demonstrere brugen af behandling af MSCs med forskellige regimer EStim og måle den resulterende virkning på osteogenic differentiering. MSC osteogenic differentiering er vurderet via calcium deposition, alkalisk fosfataseaktivitet og osteogenic markør genekspression. Vigtigere, konstaterede i tidligere eksperimenter, bruges denne opsætning, vi, at disse pro-osteogenic virkninger persistere længe efter EStim behandlingen blev afbrudt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Estim fabrication</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Banana connector/Jack adaptor</td>
			<td>Poppstars</td>
			<td>1008554</td>
			<td>2 pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutting pliers</td>
			<td>Knipex</td>
			<td>78 03 125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC power supply (0-30V/0-3A)</td>
			<td>B&#38;K Precision</td>
			<td>Model 9130B</td>
			<td>Any simular model could be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulated flexible wires (0.14 mm2)</td>
			<td>Conrad Electronic International</td>
			<td>604794, 604093</td>
			<td>2 pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-corrosive silicone rubber</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3140 RTV</td>
			<td>*could be purchased by many stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Wire (999,5/1000; 1mm &#248;)</td>
			<td>Junker Edelmetalle</td>
			<td>00D-3010</td>
			<td>0.6 m needed for 1 Estim chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol solution</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td>Sterilisation of Estim chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver coated copper wire (0.6 mm &#248;)</td>
			<td>Conrad Electronic International</td>
			<td>409334 - 62</td>
			<td>&#8776;70 cm needed for 1 Estim device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering iron Set</td>
			<td>Conrad Electronic International</td>
			<td>1611410 - 62</td>
			<td>Any simular model could be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP 6-well plate lid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z707759-126EA</td>
			<td>2 lids for Estim chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.2V wired circular LEDs</td>
			<td>Conrad Electronic International</td>
			<td>599525 - 62</td>
			<td>6 pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UHU Super glue</td>
			<td>UHU GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>n/a</td>
			<td>*could be purchased by many stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Glycerophosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td>osteogenic cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>21885025</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td>osteogenic cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Falcon tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,547,004</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td>osteogenic cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague-Dawley (SD) rat mesenchymal stem cells, bone marrow origin</td>
			<td>Cyagen</td>
			<td>RASMX-01001</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell detachment solution</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>cell culture, cell detachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Flask, T75</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833911302</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP 6-well plates</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z707759-126EA</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Dye, 0.4% solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1450021</td>
			<td>cell count</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction and use of an electrical stimulation chamber for enhancing osteogenic differentiation in mesenchymal stem/stromal cells in vitro

Mesenkymale stamceller/stromale celler (MSCs) er blevet brugt flittigt til at fremme knogleheling i tissue engineering tilgange. Elektrisk stimulation (EStim) har påvist at øge MSC osteogenic differentiering in vitro- og fremme knogle heling i klinisk indstillinger. Beskriver her vi opførelsen af en EStim celle kultur kammeret og dets anvendelse i behandling af rotte knogle-marv-afledte MSC til at forbedre osteogenic differentiering. Vi fandt, at behandling af MSCs med EStim til 7 dage resulterer i en betydelig stigning i den osteogenic differentiering, og vigtigst, denne pro-osteogenic effekt fortsætter længe efter (7 dage) EStim afbrydes. Denne tilgang af forbehandling MSCs med EStim til at forbedre osteogenic differentiering kunne bruges til at optimere knoglevæv engineering behandlingsresultater og således hjælpe dem med at opnå deres fulde terapeutiske potentiale. Ud over dette program, kan denne EStim celle kultur kammer og protokollen også bruges til at undersøge andre EStim-følsomme celle adfærd, såsom migration, spredning, apoptose og stillads vedhæftet fil.

For at evaluere effekten af 100 mV/mm af EStim på osteogenic differentiering af MSC'er, celler behandles med EStim for 3, blev 7 og 14 dage eller nontreated (kontrol) analyseret på dag 14 i dyrkning af vurderingen af morfologiske ændringer og calcium deposition (figur 2 ). Dette blev gjort ved imaging celler ved hjælp af-lysfelt mikroskopi (morfologi ændringer) eller ved fastsættelse af celler i 4% PARAFORMALDEHYD løsning, farvning dem med 0,02% alizar...

Watch this Scientific Journal Video about Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro at JoVE.com

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

Her præsenterer vi en protokol til opførelse af en celle kultur kammer designet til at eksponere celler til forskellige typer af elektrisk stimulation og dets anvendelse i behandling af mesenkymale stamceller for at forbedre osteogenic differentiering.

Konstruktion og brug af en elektrisk Stimulation kammer for at øge Osteogenic differentiering i mesenkymale stamceller/stromale celler In Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Her viser vi, hvordan man bygger et elektrisk stimulationskammer ved hjælp af fælles seks vægkulturplader, og hvordan man bruger det for at stimulere osteogen differentiering i mesenkymale stamceller. Dette kammer er let og ikke dyrt at bygge, og kan genbruges i flere eksperimenter. Efter at være blevet forbehandlet med elektrisk stimulation i vores kammer, mesenkymale stamceller kan bruges til at forbedre resultaterne i knoglevæv engineering behandlinger.Dette kammer kan også bruges til at undersøge andre celletyper og elektro-følsomme celle adfærd som migration, spredning, ændringer i membranen potentiale, apoptose, og omhyggelig vedhæftet fil. I en seks godt plade låg, mærke og derefter bore to en-millimeter diameter huller, 25 millimeter fra hinanden, nær den ydre kant af hver af de seks brønde. Dernæst skæres en platinledning i 12 fem centimeter lange sektioner.Bøje hver fem centimeters sektion manuelt i en L"-form, så den ene ende tre centimeter er lang, og de to andre centimeter lange. Skær derefter den sølvbelagte ledning i to 35 centimeter lange længder. Sæt den længere bøjede ende af en platinledning ind i det borede hul, så en til to millimeter stikker ud fra ydersiden af låget.Bøj den ved hjælp af sniver. Derefter skal du fastgøre platintrådene i lågets huller med superledende lim og lade dem tørre i ca. seks timer. For at forberede katoder, lodde spidsen af alle seks platin ledninger stikker ud fra låget til en af de sølv-belagte ledninger.For at forberede anoder, lodde de resterende seks platin ledninger til andre sølv-belagte ledninger. Derefter tilsættes lysdioder i kredsløbet mellem hver af de seks anode-katode platin-elektrode par for at bekræfte funktionaliteten. Placer et stykke sort isoleringstape under hver LED for at forhindre, at cellerne i kulturpladerne udsættes for LED-lys.Lim derefter trådterminalblokstikket til øverste venstre hjørne af det seksbårne pladelåg, og tilslut begge sølvbelagte ledninger til indgangsterminalerne. Derefter skæres en 20-millimeter med 20-millimeter firkantet sektion fra øverste venstre hjørne af en anden seks-brønds plade låg, for at imødekomme terminalblokstikket på det første låg. Dæk det første låg, der er udstyret med elektroderne, med det andet låg, og tape dem sammen med tape.Tilslut den ene ende af de to standard isolerede kobbertråde til trådstikkets udgangsterminaler, og den anden ende til bananhanstik. Tænd for strømforsyningen ved at trykke på ON-OFF-knappen på frontpanelet. Aktivér kanal et ved at trykke på knap et.Tryk derefter på knap fire for at indstille spændingen. Indstil belastningsudgangen til 2,5 volt. Tryk derefter på Enter.Den dag cellerne behandles med E-stilk, steriliseres elektroderne i 70% ethanolopløsning i 30 minutter. Tør dem derefter under UV-lys i et sikkerhedsskab i yderligere 30 minutter. I en laminar flow hætte, dække seks-brønd plade, der indeholder de dyrkede MSC'er med låget er udstyret med elektroderne, og sørg for, at elektroderne er helt nedsænket i mediet.Derefter overføre den overdækkede seks-brønd plade med celler til inkubatoren og forbinde sine ledninger til strømforsyningen. Dernæst indstilles strømforsyningen til 2,5 volt belastningsoutput og behandler cellerne med E-stamtænglen i en time. Efter stimulering skal strømforsyningen afbrydes, og E-stammekammeret fjernes fra inkubatoren.Under sterile forhold skal låget, der er udstyret med elektroder, udskiftes med et standard belagtslet. Derefter returnere cellerne til kuvøse, og lad dem natten over. Rengør elektroderne, først med PBS, og derefter med 70% ethanol opløsning.Rengør derefter de akkumulerede korrosionsprodukter fra elektrodeoverfladen med fint sandpapir. Gentag E-stilken behandling i seks på hinanden følgende dage. På dag fire, før der anvendes elektrisk stimulation, og under sterile forhold, ændre kultur medium ved at aspirere 1,5 milliliter medium og erstatte det med 1,5 milliliter af forvarmte, frisk osteogenisk differentiering medium.Efter anvendelse af elektrisk stimulation i syv på hinanden følgende dage, vedligeholde cellerne i kulturen i yderligere syv dage, udveksle mediet hver tre til fire dage. Når behandlingen er afsluttet, analysere celle morfologi ændringer under et mikroskop. For at vurdere effekten af elektrisk stimulation på MSC osteogen differentiering måles calciumaflejring, alkalisk fosfataseaktivitet og osteogen markørgenksudtryk, som beskrevet andetsteds.For at vurdere effekten af 100 millivolt pr. millimeter elektrisk stimulation på MSC's osteogene differentiering blev celler behandlet med elektrisk stimulation i tre, syv og 14 dage og ikke-behandlede celler analyseret på kulturdag 14 ved vurdering af morfologiske ændringer og calciumaflejring. Signifikante ændringer i cellemorfologi og calciumaflejringer var synlige i celler behandlet med elektrisk stimulation i syv og 14 dage. En detaljeret analyse af osteogene markør genekspression ændringer blev udført på dag tre, syv og 14 af kultur.På kulturdag var RunX2-udtrykket signifikant højere i celler behandlet med elektrisk stimulation i syv dage. Mens Colla1-udtrykket var signifikant højere i celler, der blev behandlet i syv dage, målt på kulturdag 14. Udtrykket af osteopontin blev signifikant forøget i elektrisk stimulerede celler på dag tre, syv og 14 af kulturen.Osterix-ekspressionen var fraværende i kontrolceller på alle tidspunkter og blev kun set efter syv og 14 dages kultur i celler, der blev eksponeret for elektrisk stimulation. Den elektriske stimulation kammer er relativt let at bygge. Der skal dog være særlig omhu ved håndtering af platinledningerne, og også ved rengøring og sterilisering af elektroderne.Celler forbehandlet til elektricitet i vores kammer, alene eller siddende på et stilladsmateriale, kunne implanteres i dyremodeller, for at undersøge, hvordan den positive effekt af elektrisk stimulation fortsætter in vitro. Denne teknik giver et simpelt, men kraftfuldt værktøj til at studere den mekanisme, hvorigennem elektrisk stimulation regulerer cellefunktioner. Denne viden kan være tilgængelig i regenerative medicinceller.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Engineering skeletmuskel Væv fra murine myoblast progenitorceller og anvendelse af elektrisk stimulering

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Øjenirritation Test (EIT) for Hazard Identifikation af Eye Irriterer Kemikalier hjælp rekonstrueret human Cornea-lignende Epithelial (RHCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

Polyelektrolyt kompleks for heparinbindende område osteogent vækstfaktor Delivery

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

en<em&gt; In vitro</em&gt; Orgel Kultur Model af muse diskusprolaps

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Forbedret 3D Hydrogel kulturer af primære Glial celler for In Vitro modellering af Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Isolering af mesenkymale stamceller fra menneskelige alveolær Periosteum og effekter af D-Vitamin på Osteogenic aktivitet af Periosteum-afledte celler

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential

Samtidige elektriske og mekaniske Stimulation til at øge cellernes Cardiomyogenic potentiale

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Avancerede 3D-levermodeller til in vitro genotoksicitetstest efter langvarig nanomaterialeeksponering

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling

Silicium nanowires og optisk stimulation til undersøgelser af intra- og intercellulær elektrisk kobling

Myofibroblasts can spontaneously internalize silicon nanowires (SiNWs), making them an attractive target for bioelectronic applications. These ...

Simple, Affordable, and Modular Patterning of Cells using DNA

Enkel, overkommelig og modulær mønstre af celler ved hjælp af DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells ...