Name: construction and use of an electrical stimulation chamber for enhancing osteogenic differentiation in mesenchymal stem/stromal cells in vitro
Uploaded: 2019-01-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro at JoVE.com

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een AO Stichting Start-Up Grant (S-14-03 H) en de Friedrichsheim-Stichting (Stiftung Friedrichsheim), gevestigd in Frankfurt am Main, Duitsland.

1. bouw van elektrische stimulatie cel cultuur kamer
<ol><li>Verzamelen om te bouwen de kamer EStim, twee deksels van standaard 6-well cel cultuur platen; 99,99% platina-draad, 60 cm lang met een diameter van 0,5 – 1 mm; zilver gecoat koperdraad, 70 cm lang met een diameter van 0.6 mm; snijden-tangen; soldeerbout kit; één buis van supergeleidende lijm; één draad aansluitblok connector, zes kleine 2.2 V LEDs (facultatief); één buis van noncorrosive siliconen lijm coating (facultatief); een rol van zwarte elektri...

<ol>
	<li>Oryan, A., Kamali, A., Moshiri, A., Baghaban Eslaminejad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Bone+Regenerative+Medicine:+What+Is+the+Evidence?.">Role of Mesenchymal Stem Cells in Bone Regenerative Medicine: What Is the Evidence?.</a> Cells, Tissues, Organs. 204 (2), 59-83 (2017).</li><li>Mauney, J. R., Volloch, V., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Adult+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Bone+Tissue+Engineering+Applications:+Current+Status+and+Future+Prospects.">Role of Adult Mesenchymal Stem Cells in Bone Tissue Engineering Applications: Current Status and Future Prospects.</a> Tissue Engineering. 11 (5-6), 787-802 (2005).</li><li>Mobini, S., Leppik, L., Thottakkattumana Parameswaran, V., Barker, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+effect+of+direct+current+electrical+stimulation+on+rat+mesenchymal+stem+cells.">In vitro effect of direct current electrical stimulation on rat mesenchymal stem cells.</a> PeerJ. 5, e2821 (2017).</li><li>Leppik, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+electrical+stimulation+and+tissue+engineering+to+treat+large+bone+defects+in+a+rat+model.">Combining electrical stimulation and tissue engineering to treat large bone defects in a rat model.</a> Scientific Reports. 8 (1), S1 (2018).</li><li>Song, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+direct+current+electric+fields+to+cells+and+tissues+in+vitro+and+modulation+of+wound+electric+field+in+vivo.">Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo.</a> Nature Protocols. 2 (6), 1479-1489 (2007).</li><li>Hronik-Tupaj, M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+responses+of+two-+and+three-dimensional+engineered+tissues+to+electric+fields.">A review of the responses of two- and three-dimensional engineered tissues to electric fields.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 18 (3), 167-180 (2012).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+for+isolation+and+culture+of+mesenchymal+stem+cells+from+mouse+bone+marrow.">An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow.</a> Journal of Orthopaedic Translation. 3 (1), 26-33 (2015).</li><li>Nau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineered+vascularized+periosteal+flap+enriched+with+MSC/EPCs+for+the+treatment+of+large+bone+defects+in+rats.">Tissue engineered vascularized periosteal flap enriched with MSC/EPCs for the treatment of large bone defects in rats.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 907-917 (2017).</li><li>Eischen-Loges, M., Oliveira, K. M. C., Bhavsar, M. B., Barker, J. H., Leppik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretreating+mesenchymal+stem+cells+with+electrical+stimulation+causes+sustained+long-lasting+pro-osteogenic+effects.">Pretreating mesenchymal stem cells with electrical stimulation causes sustained long-lasting pro-osteogenic effects.</a> PeerJ. 6, 4959 (2018).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Curtis, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EF1alpha+and+RPL13a+represent+normalization+genes+suitable+for+RT-qPCR+analysis+of+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells.">EF1alpha and RPL13a represent normalization genes suitable for RT-qPCR analysis of bone marrow derived mesenchymal stem cells.</a> BMC Molecular Biology. 11, 61 (2010).</li><li>Wang, L., Li, Z. -. y., Wang, Y. -. p., Wu, Z. -. h., Yu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Expression+Profiles+of+Marker+Genes+in+Osteogenic+Differentiation+of+Human+Bone+Marrow-derived+Mesenchymal+Stem+Cells.">Dynamic Expression Profiles of Marker Genes in Osteogenic Differentiation of Human Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Chinese Medical Sciences Journal (Chung-kuo i hsueh k'o hsueh tsa chih). 30 (2), 108-113 (2015).</li><li>Kim, H. B., Ahn, S., Jang, H. J., Sim, S. B., Kim, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+corrosion+behaviors+and+surface+profiles+of+platinum-coated+electrodes+by+electrochemistry+and+complementary+microscopy:+biomedical+implications+for+anticancer+therapy.">Evaluation of corrosion behaviors and surface profiles of platinum-coated electrodes by electrochemistry and complementary microscopy: biomedical implications for anticancer therapy.</a> Micron. 38 (7), 747-753 (2007).</li><li>Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+field-induced+migration+and+intercellular+stress+alignment+in+a+collective+epithelial+monolayer.">Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer.</a> Molecular Biology of the Cell. , mbcE18010077 (2018).</li><li>Tai, G., Tai, M., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrically+stimulated+cell+migration+and+its+contribution+to+wound+healing.">Electrically stimulated cell migration and its contribution to wound healing.</a> Burns &amp; Trauma. 6, 20 (2018).</li><li>Love, M. R., Palee, S., Chattipakorn, S. C., Chattipakorn, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+electrical+stimulation+on+cell+proliferation+and+apoptosis.">Effects of electrical stimulation on cell proliferation and apoptosis.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (3), 1860-1876 (2018).</li><li>Adams, D. S., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+principles+for+measuring+resting+membrane+potential+and+ion+concentration+using+fluorescent+bioelectricity+reporters.">General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 385-397 (2012).</li><li>Jin, G., Li, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electrically+conductive+scaffold+as+the+skeleton+of+stem+cell+niche+in+regenerative+medicine.">The electrically conductive scaffold as the skeleton of stem cell niche in regenerative medicine.</a> Materials Science &amp; Engineering. C, Materials for Biological Applications. 45, 671-681 (2014).</li><li>Hronik-Tupaj, M., Rice, W. L., Cronin-Golomb, M., Kaplan, D. L., Georgakoudi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblastic+differentiation+and+stress+response+of+human+mesenchymal+stem+cells+exposed+to+alternating+current+electric+fields.">Osteoblastic differentiation and stress response of human mesenchymal stem cells exposed to alternating current electric fields.</a> Biomedical Engineering Online. 10, 9 (2011).</li></ol>

Hier beschrijven we de bouw van een kamer en een methode voor de behandeling van mesenchymale stamcellen met EStim die tot verbeterde osteogenic differentiatie leidt.
De setup van de EStim gepresenteerd vereist geen speciale apparatuur/kennis en kan worden uitgevoerd in een laboratorium van de biologie/biochemie de cel van de stam van de standaard door junioronderzoekers. Echter wanneer gebouw en met behulp van de zaal EStim, moet speciale zorg men in een paar kritische stappen. Bij de behande...

Een toename van de trauma's en/of ziekte-geïnduceerde bot gebreken worden behandeld met behulp van verschillende combinaties van celtherapie en regeneratieve geneeskunde technologieën. MSCs zijn de cel van keuze in dergelijke behandelingen, vanwege hun relatief hoge osteogenic activiteit, isolatie en uitbreiding efficiëntie en veiligheid1. Wilt maximaliseren van hun osteogenic activiteit en, dus, het optimaliseren van hun therapeutische doeltreffendheid, zijn verschillende methoden om te manipuleren MSCs voorafgaand aan het gebruik ervan in deze behandelingen (zoals herzien door Mauney et al.2) bijgekomen. Een dergelijke methode is EStim, waarvan is aangetoond te verbeteren van MSC osteogenic differentiatie in vitro3 en bot in vivo4genezing te bevorderen. Ondanks het groeiend aantal studies gericht op de behandeling van MSCs met EStim, moet een optimale regime voor het maximaliseren van de EStim pro-osteogenic effect nog worden gedefinieerd.
Andere methoden in vitro met behulp van EStim gebruiken zout bruggen ondergedompeld in het kweekmedium, die cellen van metalen elektroden5scheidt. Het voordeel hiervan is dat de invoering van chemische bijproducten (bijvoorbeeld, corrosie van metalen elektroden) die mogelijk cytotoxisch EStim leveren door middel van zout bruggen elimineert. Ondanks dit voordeel, zout bruggen zijn omslachtig om mee te werken en de EStim zij leveren verschilt van die in geleverde in vivo modellen, waardoor het moeilijk te correleren van resultaten bij het gebruik van de twee systemen. Opstellingen die EStim via metalen of koolstof elektrodes vast binnen de cel cultuur putten leveren simuleren (zoals herzien door Hronik-Tupaj en Kaplan6) beter apparaten die worden gebruikt in vivo; echter, deze apparaten zijn moeilijk te reinigen/steriliseren tussen toepassingen en het aantal cellen die kunnen worden bestudeerd per experiment is beperkt. We ontwierpen de EStim zaal gepresenteerd hier specifiek om aan te pakken van de beperkingen van deze andere opstellingen. Terwijl de meeste van onze ervaring met behulp van deze zaal EStim geweest met 2D en 3D culturen met het beenmerg - en adipeus-weefsel-afgeleide MSCs3,4, een belangrijk voordeel van dit Parlement is dat het is veelzijdig en, met relatief kleine wijzigingen, kunnen worden aangepast aan het bestuderen van andere celtypes onder allerlei verschillende omstandigheden.
Hier beschrijven we de bouw van een EStim vergaderzaal voor de cultuur van de cel; vervolgens tonen wij het gebruik ervan door behandelende MSCs met verschillende regimes van EStim en het meten van het resulterende effect op osteogenic differentiatie. MSC osteogenic differentiatie wordt beoordeeld via afzetting van calcium, alkalisch fosfatase activiteit en osteogenic marker genexpressie. Nog belangrijker is, in verleden experimenten waarmee deze opstelling, we hebben vastgesteld dat deze pro-osteogenic effecten aanhouden lang nadat de EStim behandeling werd gestaakt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Estim fabrication</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Banana connector/Jack adaptor</td>
			<td>Poppstars</td>
			<td>1008554</td>
			<td>2 pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutting pliers</td>
			<td>Knipex</td>
			<td>78 03 125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC power supply (0-30V/0-3A)</td>
			<td>B&#38;K Precision</td>
			<td>Model 9130B</td>
			<td>Any simular model could be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulated flexible wires (0.14 mm2)</td>
			<td>Conrad Electronic International</td>
			<td>604794, 604093</td>
			<td>2 pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-corrosive silicone rubber</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3140 RTV</td>
			<td>*could be purchased by many stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Wire (999,5/1000; 1mm &#248;)</td>
			<td>Junker Edelmetalle</td>
			<td>00D-3010</td>
			<td>0.6 m needed for 1 Estim chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol solution</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td>Sterilisation of Estim chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver coated copper wire (0.6 mm &#248;)</td>
			<td>Conrad Electronic International</td>
			<td>409334 - 62</td>
			<td>&#8776;70 cm needed for 1 Estim device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering iron Set</td>
			<td>Conrad Electronic International</td>
			<td>1611410 - 62</td>
			<td>Any simular model could be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP 6-well plate lid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z707759-126EA</td>
			<td>2 lids for Estim chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.2V wired circular LEDs</td>
			<td>Conrad Electronic International</td>
			<td>599525 - 62</td>
			<td>6 pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UHU Super glue</td>
			<td>UHU GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>n/a</td>
			<td>*could be purchased by many stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Glycerophosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td>osteogenic cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>21885025</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td>osteogenic cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Falcon tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,547,004</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td>osteogenic cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague-Dawley (SD) rat mesenchymal stem cells, bone marrow origin</td>
			<td>Cyagen</td>
			<td>RASMX-01001</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell detachment solution</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>cell culture, cell detachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Flask, T75</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833911302</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP 6-well plates</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z707759-126EA</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Dye, 0.4% solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1450021</td>
			<td>cell count</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction and use of an electrical stimulation chamber for enhancing osteogenic differentiation in mesenchymal stem/stromal cells in vitro

Mesenchymale stamcellen/stromale cellen (MSCs) zijn uitvoerig gebruikt om bot genezing in weefsel engineering benaderingen te bevorderen. Elektrische stimulatie (EStim) heeft aangetoond dat MSC osteogenic differentiatie in vitro verbeteren en bot genezing in klinische instellingen te bevorderen. Hier beschrijven we de bouw van een EStim kamer voor de cultuur van de cel en het gebruik ervan bij de behandeling van bot-merg-afgeleide MSC ter verbetering van osteogenic differentiatie rat. We vonden dat behandeling van MSCs met EStim voor 7 dagen in een aanzienlijke toename van de osteogenic differentiatie resulteert, en bovenal dit pro-osteogenic effect blijft voortbestaan lang na (7 dagen) EStim wordt stopgezet. Deze aanpak van voorbehandeling MSCs met EStim ter verbetering van osteogenic differentiatie kan worden gebruikt om botweefsel engineering behandeling resultaten te optimaliseren en, dus, helpen hen om hun volledige therapeutische potentieel te bereiken. Naast deze applicatie, kunnen deze EStim cel cultuur kamer en protocol ook worden gebruikt te onderzoeken van andere EStim-gevoelige cel gedrag, zoals migratie, proliferatie, apoptosis en steiger bijlage.

Om te evalueren van het effect van 100 mV/mm EStim op de osteogenic differentiatie van MSCs, cellen EStim behandeld voor 3, werden 7, en 14 dagen of nontreated (control) geanalyseerd op dag 14 van kweken door beoordeling van de morfologische veranderingen en calcium afzetting (Figuur 2 ). Dit werd gedaan door imaging cellen met helder-veld microscopie (morfologie wijzigingen) of door de vaststelling van de cellen in 4% paraformaldehyde oplossing, hen met oplo...

Watch this Scientific Journal Video about Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro at JoVE.com

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

Hier presenteren we een protocol voor de bouw van een cel cultuur kamer ontworpen om bloot cellen tot verschillende soorten elektrische stimulatie, en het gebruik ervan bij de behandeling van mesenchymale stamcellen om osteogenic differentiatie.

Constructie en het gebruik van een elektrische stimulatie kamer voor het verbeteren van Osteogenic differentiatie in mesenchymale stamcellen/stromale cellen In Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Hier laten we zien hoe je een elektrische stimulatiekamer bouwt met behulp van gemeenschappelijke zes wandkweekplaten, en hoe je deze gebruiken om osteogene differentiatie in mesenchymale stamcellen te stimuleren. Deze kamer is eenvoudig en niet duur om te bouwen, en kan worden hergebruikt in meerdere experimenten. Na voorbehandeling met elektrische stimulatie in onze kamer, kunnen mesenchymale stamcellen worden gebruikt om de resultaten in botweefsel engineering behandelingen te verbeteren.Deze kamer kan ook worden gebruikt om andere celtypen en elektrogevoelig celgedrag te onderzoeken, zoals migratie, proliferatie, veranderingen in het membraanpotentieel, apoptose en zorgvuldige hechting. In een zes put plaat deksel, markeren en vervolgens boren twee een-millimeter diameter gaten, 25 millimeter uit elkaar, in de buurt van de buitenste rand van elk van de zes putten. Knip vervolgens een platina draad in 12 vijf centimeter lange secties.Buig elke sectie van vijf centimeter handmatig in een L-vorm, waardoor het ene uiteinde drie centimeter lang is en de andere twee centimeter lang. Snijd vervolgens de met zilver bedekte draad in twee lengtes van 35 centimeter. Steek het langere gebogen uiteinde van een platina draad in het geboorde gat, waardoor een tot twee millimeter uitsteken van de buitenkant van het deksel.Buig het met tangen. Bevestig daarna de platina draden in de dekselgaten met supergeleidende lijm en laat ze ongeveer zes uur drogen. Om de kathodes voor te bereiden, soldeer de uiteinden van alle zes platina draden die uitsteken van het deksel naar een van de met zilver bedekte draden.Om de anoden voor te bereiden, soldeer de resterende zes platina draden aan andere zilvergecoate draden. Voeg vervolgens LED's toe in het circuit tussen elk van de zes anode-kathode platina-elektrodeparen om de functionaliteit te bevestigen. Plaats een stuk zwarte isolatietape onder elke LED om te voorkomen dat de cellen in de kweekplaten worden blootgesteld aan LED-licht.Plak vervolgens de draadeindblokconnector in de linkerbovenhoek van het zes-putplaatdeksel en sluit beide met zilver bedekte draden aan op de ingangsterminals. Knip vervolgens een vierkant stuk van 20 bij 20 millimeter uit de linkerbovenhoek van een tweede zes-putplaatdeksel, om de sluitblokconnector op het eerste deksel te huisvesten. Bedek het eerste deksel, uitgerust met de elektroden, met het tweede deksel, en plak ze samen met plakband.Sluit het ene uiteinde van de twee standaard geïsoleerde koperdraden aan op de uitgangsterminals van de draadconnector en het andere uiteinde op mannelijke bananenconnectoren. Schakel de voeding in door op de AAN-UIT-knop op het voorpaneel te drukken. Activeer kanaal één door op knop één te drukken.Druk daarna op knop vier om de spanning in te stellen. Stel de belastingsuitvoer in op 2,5 volt. Druk vervolgens op Enter.Op de dag dat de cellen worden behandeld met E-stam, steriliseren de elektroden in 70% ethanol oplossing gedurende 30 minuten. Droog ze vervolgens 30 minuten onder UV-licht in een veiligheidskast. Bedek in een laminaire stroomkap de zes-put plaat met de gekweekte MSCs met het deksel uitgerust met de elektroden, om ervoor te zorgen dat de elektroden volledig ondergedompeld zijn in het medium.Breng vervolgens de overdekte zes-put plaat met cellen naar de incubator en sluit de draden aan op de voeding. Stel vervolgens de voeding in op een belastingsvermogen van 2,5 volt en behandel de cellen een uur met E-stam. Na stimulatie de voeding loskoppelen en de E-stamkamer uit de couveuse verwijderen.Vervang onder steriele omstandigheden het deksel, voorzien van elektroden, door een standaard zesputte plaatdeksel. Vervolgens, terug de cellen naar de incubator, en laat ze 's nachts. Reinig de elektroden, eerst met PBS, en vervolgens met 70% ethanol oplossing.Reinig vervolgens de opgehoopte corrosieproducten van het elektrodeoppervlak met fijn schuurpapier. Herhaal de E-stambehandeling gedurende zes opeenvolgende dagen. Op dag vier, voorafgaand aan het toepassen van elektrische stimulatie, en onder steriele omstandigheden, verander het kweekmedium door 1,5 milliliter medium te aspireren en te vervangen door 1,5 milliliter voorverwarmd, vers osteogeen differentiatiemedium.Na het toepassen van elektrische stimulatie gedurende zeven opeenvolgende dagen, handhaven van de cellen in de cultuur voor een extra zeven dagen, het uitwisselen van het medium om de drie tot vier dagen. Wanneer de behandeling is voltooid, analyseren van de celmorfologie veranderingen onder een microscoop. Om het effect van elektrische stimulatie op MSC osteogene differentiatie te beoordelen, meet calciumdepositie, alkalische fosfatase activiteit, en osteogene marker genexpressie, zoals elders beschreven.Om het effect van 100 millivolt per millimeter elektrische stimulatie op de MSC osteogene differentiatie te evalueren, werden cellen behandeld met elektrische stimulatie gedurende drie, zeven en 14 dagen en niet-behandelde cellen, geanalyseerd op dag 14 van de cultuur door morfologische veranderingen en calciumdepositie te beoordelen. Significante veranderingen in celmorfologie en calciumafzettingen waren zeven en 14 dagen zichtbaar in cellen die met elektrische stimulatie werden behandeld. Een gedetailleerde analyse van osteogene marker genexpressie veranderingen werd uitgevoerd op dag drie, zeven en 14 van de cultuur.Op dag zeven van de cultuur, RunX2 expressie was aanzienlijk hoger in cellen behandeld met elektrische stimulatie voor zeven dagen. Terwijl colla1 expressie was aanzienlijk hoger in cellen behandeld voor zeven dagen, gemeten op dag 14 van de cultuur. De expressie van osteopontine werd aanzienlijk verhoogd in elektrisch gestimuleerde cellen op dagen drie, zeven en 14 van de cultuur.Osterix expressie was afwezig in controlecellen op alle tijdstippen, en werd alleen gezien op zeven en 14 dagen van de cultuur in cellen blootgesteld aan elektrische stimulatie. De elektrische stimulatiekamer is relatief eenvoudig te bouwen. Er moet echter speciale aandacht worden genomen bij het hanteren van de platinadraden, en ook bij het reinigen en steriliseren van de elektroden.Cellen die in onze kamer voorbehandeld zijn op elektriciteit, alleen of op een steigermateriaal, kunnen in diermodellen worden geïmplanteerd om te bestuderen hoe het positieve effect van elektrische stimulatie in vitro aanhoudt. Deze techniek biedt een eenvoudig maar krachtig hulpmiddel om het mechanisme te bestuderen waarmee elektrische stimulatie celfuncties reguleert. Deze kennis kan beschikbaar zijn in regeneratieve geneeskunde cellen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Techniek skeletspier weefsel van muizen myoblast progenitorcellen en toepassing van elektrische stimulatie

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Test op oogirritatie (EIT) voor Risico oog irriterende stoffen met gereconstrueerde humane Cornea-achtige Epithelial (RHCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

Polyelectrolyte Complex voor Heparine Binding Domain osteogeen Growth Factor Delivery

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Model van het Muizen tussenwervelschijf

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Verbeterd 3D Hydrogel culturen van primaire gliacellen voor In Vitro modellering van Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Isolatie van mesenchymale stamcellen uit menselijke alveolaire beenvlies en effecten van vitamine D op Osteogenic activiteit van beenvlies-afgeleide cellen

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential

Gelijktijdige elektrische en mechanische stimulatie ter verbetering van de cellen Cardiomyogenic potentieel

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Geavanceerde 3D-levermodellen voor in vitro genotoxiciteitstests na langdurige blootstelling aan nanomaterialen

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling

Silicium nanodraden en optische stimulatie voor onderzoeken van intra- en intercellulaire elektrische koppeling

Myofibroblasts can spontaneously internalize silicon nanowires (SiNWs), making them an attractive target for bioelectronic applications. These ...

Simple, Affordable, and Modular Patterning of Cells using DNA

Eenvoudige, betaalbare en modulaire patronen van cellen met behulp van DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells ...