Name: construction and use of an electrical stimulation chamber for enhancing osteogenic differentiation in mesenchymal stem/stromal cells in vitro
Uploaded: 2019-01-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro at JoVE.com

Ce travail a été soutenu en partie par une subvention de démarrage de la Fondation AO (S-14-03 H) et la fondation de Friedrichsheim (Stiftung Friedrichsheim) basé à Francfort/Main, Allemagne.

1. construction de la chambre de culture de cellules stimulation électrique
<ol><li>Pour construire la chambre EStim, recueillir deux couvercles de plaques de culture cellulaire standard de 6 puits ; fil de platine à 99,99 %, 60 cm de long avec un diamètre de 0,5 à 1 mm ; fil de cuivre argenté, 70 cm de long avec un diamètre de 0,6 mm ; pinces coupantes ; kit fer à souder ; un tube de colle supraconducteur ; un seul fil terminal de connexion, six petites 2,2 V LED (en option) ; un tube de colle silicone n...

<ol>
	<li>Oryan, A., Kamali, A., Moshiri, A., Baghaban Eslaminejad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Bone+Regenerative+Medicine:+What+Is+the+Evidence?.">Role of Mesenchymal Stem Cells in Bone Regenerative Medicine: What Is the Evidence?.</a> Cells, Tissues, Organs. 204 (2), 59-83 (2017).</li><li>Mauney, J. R., Volloch, V., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Adult+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Bone+Tissue+Engineering+Applications:+Current+Status+and+Future+Prospects.">Role of Adult Mesenchymal Stem Cells in Bone Tissue Engineering Applications: Current Status and Future Prospects.</a> Tissue Engineering. 11 (5-6), 787-802 (2005).</li><li>Mobini, S., Leppik, L., Thottakkattumana Parameswaran, V., Barker, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+effect+of+direct+current+electrical+stimulation+on+rat+mesenchymal+stem+cells.">In vitro effect of direct current electrical stimulation on rat mesenchymal stem cells.</a> PeerJ. 5, e2821 (2017).</li><li>Leppik, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+electrical+stimulation+and+tissue+engineering+to+treat+large+bone+defects+in+a+rat+model.">Combining electrical stimulation and tissue engineering to treat large bone defects in a rat model.</a> Scientific Reports. 8 (1), S1 (2018).</li><li>Song, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+direct+current+electric+fields+to+cells+and+tissues+in+vitro+and+modulation+of+wound+electric+field+in+vivo.">Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo.</a> Nature Protocols. 2 (6), 1479-1489 (2007).</li><li>Hronik-Tupaj, M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+responses+of+two-+and+three-dimensional+engineered+tissues+to+electric+fields.">A review of the responses of two- and three-dimensional engineered tissues to electric fields.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 18 (3), 167-180 (2012).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+for+isolation+and+culture+of+mesenchymal+stem+cells+from+mouse+bone+marrow.">An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow.</a> Journal of Orthopaedic Translation. 3 (1), 26-33 (2015).</li><li>Nau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineered+vascularized+periosteal+flap+enriched+with+MSC/EPCs+for+the+treatment+of+large+bone+defects+in+rats.">Tissue engineered vascularized periosteal flap enriched with MSC/EPCs for the treatment of large bone defects in rats.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 907-917 (2017).</li><li>Eischen-Loges, M., Oliveira, K. M. C., Bhavsar, M. B., Barker, J. H., Leppik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretreating+mesenchymal+stem+cells+with+electrical+stimulation+causes+sustained+long-lasting+pro-osteogenic+effects.">Pretreating mesenchymal stem cells with electrical stimulation causes sustained long-lasting pro-osteogenic effects.</a> PeerJ. 6, 4959 (2018).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Curtis, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EF1alpha+and+RPL13a+represent+normalization+genes+suitable+for+RT-qPCR+analysis+of+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells.">EF1alpha and RPL13a represent normalization genes suitable for RT-qPCR analysis of bone marrow derived mesenchymal stem cells.</a> BMC Molecular Biology. 11, 61 (2010).</li><li>Wang, L., Li, Z. -. y., Wang, Y. -. p., Wu, Z. -. h., Yu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Expression+Profiles+of+Marker+Genes+in+Osteogenic+Differentiation+of+Human+Bone+Marrow-derived+Mesenchymal+Stem+Cells.">Dynamic Expression Profiles of Marker Genes in Osteogenic Differentiation of Human Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Chinese Medical Sciences Journal (Chung-kuo i hsueh k'o hsueh tsa chih). 30 (2), 108-113 (2015).</li><li>Kim, H. B., Ahn, S., Jang, H. J., Sim, S. B., Kim, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+corrosion+behaviors+and+surface+profiles+of+platinum-coated+electrodes+by+electrochemistry+and+complementary+microscopy:+biomedical+implications+for+anticancer+therapy.">Evaluation of corrosion behaviors and surface profiles of platinum-coated electrodes by electrochemistry and complementary microscopy: biomedical implications for anticancer therapy.</a> Micron. 38 (7), 747-753 (2007).</li><li>Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+field-induced+migration+and+intercellular+stress+alignment+in+a+collective+epithelial+monolayer.">Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer.</a> Molecular Biology of the Cell. , mbcE18010077 (2018).</li><li>Tai, G., Tai, M., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrically+stimulated+cell+migration+and+its+contribution+to+wound+healing.">Electrically stimulated cell migration and its contribution to wound healing.</a> Burns &amp; Trauma. 6, 20 (2018).</li><li>Love, M. R., Palee, S., Chattipakorn, S. C., Chattipakorn, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+electrical+stimulation+on+cell+proliferation+and+apoptosis.">Effects of electrical stimulation on cell proliferation and apoptosis.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (3), 1860-1876 (2018).</li><li>Adams, D. S., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+principles+for+measuring+resting+membrane+potential+and+ion+concentration+using+fluorescent+bioelectricity+reporters.">General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 385-397 (2012).</li><li>Jin, G., Li, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electrically+conductive+scaffold+as+the+skeleton+of+stem+cell+niche+in+regenerative+medicine.">The electrically conductive scaffold as the skeleton of stem cell niche in regenerative medicine.</a> Materials Science &amp; Engineering. C, Materials for Biological Applications. 45, 671-681 (2014).</li><li>Hronik-Tupaj, M., Rice, W. L., Cronin-Golomb, M., Kaplan, D. L., Georgakoudi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblastic+differentiation+and+stress+response+of+human+mesenchymal+stem+cells+exposed+to+alternating+current+electric+fields.">Osteoblastic differentiation and stress response of human mesenchymal stem cells exposed to alternating current electric fields.</a> Biomedical Engineering Online. 10, 9 (2011).</li></ol>

Nous décrivons ici la construction d’une chambre et une méthode pour le traitement des cellules souches mésenchymateuses EStim qui entraîne une différenciation ostéogénique.
L’installation d’EStim présentée ne nécessite pas d’équipement/connaissances particulières et peut être effectuée dans un laboratoire de biologie/biochimie des cellules souches standard de chercheurs débutants. Toutefois, lorsque la construction et à l’aide de la chambre EStim, spécial il faut en...

Une augmentation des traumatismes et/ou défauts osseux induite par la maladie sont traitées à l’aide de différentes combinaisons de thérapie cellulaire et les technologies de la médecine régénérative. MSCs sont la cellule de choix dans ces traitements, en raison de leur activité ostéogénique relativement élevée, isolement et expansion efficacité et sécurité1. Pour optimiser leur activité ostéogénique et, par conséquent, optimiser leur efficacité thérapeutique, plusieurs méthodes ont été introduites pour manipuler les MSCs avant leur utilisation dans ces traitements (tel qu’il est examiné par Mauney Al.2). Une de ces méthodes est EStim, qui a été montré pour améliorer la différenciation ostéogénique MSC in vitro3 et promouvoir OS in vivo4de guérison. Malgré le nombre croissant d’études qui portent sur le traitement de MSCs avec EStim, un régime optimal pour maximiser l’effet pro-ostéogénique de EStim doit encore être défini.
Autres méthodes in vitro à l’aide d’EStim utilisent des ponts salins immergés dans le milieu de culture, qui sépare les cellules des électrodes métalliques5. L’avantage de ceci est que livraison estimée par l’intermédiaire de ponts salins élimine l’introduction de sous-produits chimiques (p. ex., la corrosion des électrodes métalliques) qui peuvent être cytotoxiques. Malgré cet avantage, ponts salins sont difficiles à travailler avec, et l’EStim ils livrent diffère de celui livré en modèles in vivo, compliquant la corrélation entre les résultats obtenus en utilisant les deux systèmes. Configurations qui offrent EStim via des électrodes métalliques ou de carbone fixés à l’intérieur des puits de culture cellulaire (tel que revu par Hronik-Tupaj et Kaplan6) mieux simulent appareils utilisés in vivo ; Cependant, ces dispositifs sont difficiles à nettoyer/stériliser entre chaque utilisation et le nombre de cellules qui peuvent être étudiés par l’expérience est limité. Nous avons conçu la chambre EStim présentée ici spécifiquement pour pallier les lacunes de ces autres configurations. Alors que la majeure partie de notre expérience dans l’utilisation de cette chambre EStim travaille chez 2D et 3D cultures contenant de la moelle osseuse et adipeux tissu-dérivés - MSCs3,4, est un avantage majeur de cette chambre, qui il est polyvalent et, avec relativement mineur changements, peut être adapté pour étudier d’autres types de cellules dans une variété de différentes conditions.
Nous décrivons ici la construction d’une chambre de culture de cellules EStim ; Ensuite, nous montrons l’utilisation de MSCs traitants avec différents schémas d’EStim et mesurant l’effet qui en résulte sur la différenciation ostéogénique. Différenciation ostéogénique MSC est évaluée par le dépôt de calcium, l’activité phosphatase alcaline et expression du gène marqueur ostéogénique. Ce qui est important, dans passé des expériences qui ont utilisé cette configuration, nous avons observé que ces effets pro-ostéogénique persistent longtemps après que le traitement EStim a été interrompu.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Estim fabrication</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Banana connector/Jack adaptor</td>
			<td>Poppstars</td>
			<td>1008554</td>
			<td>2 pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutting pliers</td>
			<td>Knipex</td>
			<td>78 03 125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC power supply (0-30V/0-3A)</td>
			<td>B&#38;K Precision</td>
			<td>Model 9130B</td>
			<td>Any simular model could be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulated flexible wires (0.14 mm2)</td>
			<td>Conrad Electronic International</td>
			<td>604794, 604093</td>
			<td>2 pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-corrosive silicone rubber</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3140 RTV</td>
			<td>*could be purchased by many stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Wire (999,5/1000; 1mm &#248;)</td>
			<td>Junker Edelmetalle</td>
			<td>00D-3010</td>
			<td>0.6 m needed for 1 Estim chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol solution</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td>Sterilisation of Estim chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver coated copper wire (0.6 mm &#248;)</td>
			<td>Conrad Electronic International</td>
			<td>409334 - 62</td>
			<td>&#8776;70 cm needed for 1 Estim device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering iron Set</td>
			<td>Conrad Electronic International</td>
			<td>1611410 - 62</td>
			<td>Any simular model could be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP 6-well plate lid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z707759-126EA</td>
			<td>2 lids for Estim chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.2V wired circular LEDs</td>
			<td>Conrad Electronic International</td>
			<td>599525 - 62</td>
			<td>6 pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UHU Super glue</td>
			<td>UHU GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>n/a</td>
			<td>*could be purchased by many stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Glycerophosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td>osteogenic cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>21885025</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td>osteogenic cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Falcon tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,547,004</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td>osteogenic cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague-Dawley (SD) rat mesenchymal stem cells, bone marrow origin</td>
			<td>Cyagen</td>
			<td>RASMX-01001</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell detachment solution</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>cell culture, cell detachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Flask, T75</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833911302</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP 6-well plates</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z707759-126EA</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Dye, 0.4% solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1450021</td>
			<td>cell count</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction and use of an electrical stimulation chamber for enhancing osteogenic differentiation in mesenchymal stem/stromal cells in vitro

Cellules souches/stromales mésenchymateuses (CSM) ont été largement utilisés pour promouvoir la guérison osseuse dans les approches en génie tissulaire. Stimulation électrique (EStim) a été démontrée pour augmenter la différenciation ostéogénique MSC in vitro et promouvoir OS guérison en milieu clinique. Nous décrivons ici la construction d’une chambre de culture de cellules EStim et son utilisation dans le traitement de rat MSC OS-moelle osseuse afin d’améliorer la différenciation ostéogénique. Nous avons constaté que traitant MSCs avec EStim pendant 7 jours se traduit par une augmentation significative de la différenciation ostéogénique, et surtout, cet effet pro-ostéogénique persiste longtemps après que (7 jours) EStim est discontinué. Cette approche de pré-traitement MSCs avec EStim afin d’améliorer la différenciation ostéogénique pourrait être utilisée pour optimiser le tissu osseux, ingénierie des résultats du traitement et, ainsi, les aider à réaliser leur potentiel thérapeutique complet. En plus de cette application, cette chambre de culture de cellules EStim et protocole permet également d’enquêter sur d’autres comportements de cellule EStim sensibles, tels que de la migration, prolifération, apoptose et fixation de l’échafaudage.

Pour évaluer l’effet de 100 mV/mm de EStim sur la différenciation ostéogénique de MSCs, les cellules traitées avec EStim pour 3, 7 et 14 jours ou non-traitées (contrôle) ont été analysées à 14 jours de culture en évaluant les changements morphologiques et le dépôt de calcium (Figure 2 ). Cela a été fait par imagerie de cellules à l’aide de la microscopie lumineuse (changements de morphologie) ou par fixation des cellules en solution à 4 ...

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Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

Nous présentons ici un protocole pour la construction d’une chambre de culture cellulaire conçue pour exposer les cellules de différents types de stimulation électrique et son utilisation dans le traitement des cellules souches mésenchymateuses afin d’améliorer la différenciation ostéogénique.

Construction et utilisation d’une chambre de Stimulation électrique pour renforcer la différenciation ostéogénique dans les cellules souches mésenchymateuses/stromales In Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Ici, nous montrons comment construire une chambre de stimulation électrique en utilisant six plaques de culture murale commune, et comment l’utiliser afin de stimuler la différenciation ostéogénique dans les cellules souches mésenchymales. Cette chambre est facile et pas coûteuse à construire, et peut être réutilisée dans de multiples expériences. Après avoir été pré-traitées avec la stimulation électrique dans notre chambre, les cellules souches mésenchymales peuvent être employées pour améliorer des résultats dans des traitements d’ingénierie de tissu d’os.Cette chambre peut également être utilisée pour étudier d’autres types de cellules et les comportements cellulaires électro-sensibles comme la migration, la prolifération, les changements dans le potentiel membranaire, l’apoptose et l’attachement soigneux. Dans un couvercle de six plaques de puits, marquer puis percer deux trous d’un millimètre de diamètre, à 25 millimètres l’un de l’autre, près du bord extérieur de chacun des six puits. Ensuite, couper un fil de platine en 12 sections de cinq centimètres de long.Pliez manuellement chaque section de cinq centimètres en forme de L, laissant une extrémité de trois centimètres de long, et l’autre de deux centimètres de long. Ensuite, coupez le fil enduit d’argent en deux longueurs de 35 centimètres. Insérez l’extrémité plus longue et pliée d’un fil de platine dans le trou foré, laissant un à deux millimètres dépasser de l’extérieur du couvercle.Pliez-le à l’aide de forceps. Par la suite, fixez les fils de platine dans les trous du couvercle avec de la colle super conductrice et laissez-les sécher pendant environ six heures. Pour préparer les cathodes, souder les extrémités des six fils de platine qui dépassent du couvercle à l’un des fils enduits d’argent.Pour préparer les anodes, souder les six fils de platine restants à d’autres fils recouverts d’argent. Par la suite, ajoutez des LED dans le circuit entre chacune des six paires anode-cathode platine-électrode pour confirmer la fonctionnalité. Placez un morceau de ruban isolant noir sous chaque LED pour éviter d’exposer les cellules dans les plaques de culture à la lumière LED.Ensuite, collez le connecteur de bloc terminal filaire au coin supérieur gauche du couvercle de la plaque de six puits et connectez les deux fils recouverts d’argent aux terminaux d’entrée. Ensuite, découpez une section carrée de 20 millimètres par 20 millimètres du coin supérieur gauche d’un deuxième couvercle de plaque de six puits, pour accueillir le connecteur de bloc terminal sur le premier couvercle. Couvrez le premier couvercle, équipé des électrodes, avec le deuxième couvercle, et collez-les avec du ruban adhésif.Connectez une extrémité des deux fils de cuivre isolés standard aux terminaux de sortie du connecteur de fil, et l’autre extrémité aux connecteurs mâles de banane. Allumez l’alimentation électrique en appuyant sur le bouton ON-OFF sur le panneau avant. Activez le canal un en appuyant sur le bouton un.Par la suite, appuyez sur le bouton quatre pour régler la tension. Réglez la puissance de charge à 2,5 volts. Appuyez ensuite sur Entrez.Le jour où les cellules sont traitées avec la tige E, stériliser les électrodes dans la solution 70% éthanol pendant 30 minutes. Ensuite, séchez-les sous la lumière UV dans un coffret de sécurité pendant 30 minutes supplémentaires. Dans un capot d’écoulement laminaire, couvrir la plaque de six puits contenant les MSC cultivés avec le couvercle équipé des électrodes, en s’assurant que les électrodes sont complètement immergées dans le milieu.Ensuite, transférez la plaque couverte de six puits avec des cellules à l’incubateur et connectez ses fils à l’alimentation électrique. Ensuite, réglez l’alimentation électrique à la sortie de charge de 2,5 volts et traitez les cellules avec la tige E pendant une heure. Après la stimulation, déconnecter l’alimentation électrique et retirer la chambre de tige E de l’incubateur.Dans des conditions stériles, remplacer le couvercle, équipé d’électrodes, par un couvercle de plaque standard de six puits. Par la suite, retournez les cellules à l’incubateur et laissez-les toute la nuit. Nettoyez les électrodes, d’abord avec PBS, puis avec une solution 70% éthanol.Ensuite, nettoyez les produits de corrosion accumulés de la surface de l’électrode avec du papier de verre fin. Répétez le traitement de la tige E pendant six jours consécutifs. Le quatrième jour, avant d’appliquer la stimulation électrique, et dans des conditions stériles, changer le milieu de culture en aspirant 1,5 millilitres de milieu et en le remplaçant par 1,5 millilitres de préchauffé, milieu de différenciation ostéogène fraîche.Après avoir appliqué la stimulation électrique pendant sept jours consécutifs, maintenez les cellules en culture pendant sept jours supplémentaires, échangeant le milieu tous les trois à quatre jours. Lorsque le traitement est terminé, analyser les changements de morphologie cellulaire au microscope. Évaluer l’effet de la stimulation électrique sur la différenciation ostéogénique du MSC, mesurer le dépôt de calcium, l’activité alcaline de phosphatase et l’expression du gène marqueur ostéogénique, tel que décrit ailleurs.Pour évaluer l’effet de 100 millivolts par millimètre de stimulation électrique sur la différenciation ostéogénique de MSC, des cellules traitées avec la stimulation électrique pendant trois, sept, et 14 jours et des cellules non traitées, ont été analysées au jour 14 de la culture en évaluant des changements morphologiques et des dépôts de calcium. Des changements significatifs dans la morphologie cellulaire et les dépôts de calcium étaient visibles dans les cellules traitées avec la stimulation électrique pendant sept et 14 jours. Une analyse détaillée des changements ostéogènes d’expression de gène de marqueur a été exécutée aux jours trois, sept, et 14 de la culture.Au septième jour de la culture, l’expression de RunX2 était sensiblement plus élevée dans les cellules traitées avec la stimulation électrique pendant sept jours. Alors que l’expression colla1 était significativement plus élevée dans les cellules traitées pendant sept jours, mesurées au jour 14 de la culture. L’expression de l’osteopontin a été sensiblement augmentée dans les cellules électriquement stimulées aux jours trois, sept, et 14 de la culture.L’expression d’Astérix était absente dans les cellules de contrôle à tous les points de temps, et a été vue seulement à sept et 14 jours de culture dans les cellules exposées à la stimulation électrique. La chambre de stimulation électrique est relativement facile à construire. Cependant, un soin particulier doit être pris lors de la manipulation des fils de platine, et aussi lors du nettoyage et la stérilisation des électrodes.Les cellules prétraitées à l’électricité dans notre chambre, seules ou assises sur un échafaudage, pourraient être implantées dans des modèles animaux, afin d’étudier comment l’effet positif de la stimulation électrique persiste in vitro. Cette technique fournit un outil simple mais puissant pour étudier le mécanisme par lequel la stimulation électrique régule les fonctions cellulaires. Ces connaissances peuvent être disponibles dans les cellules de médecine régénérative.

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Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Amélioré l’Hydrogel 3D des Cultures de cellules gliales primaires pour In Vitro la modélisation du neuro-inflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Isolement des cellules souches mésenchymateuses du périoste alvéolaire humaine et les effets de la vitamine D sur activité ostéogène du périoste dérivées des cellules

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential

Stimulation électrique et mécanique simultanée pour promouvoir le potentiel de cellules Cardiomyogénique

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Modèles hépatiques 3D avancés pour les tests de génotoxicité in vitro après une exposition à long terme aux nanomatériaux

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling

Nanofils de silicium et stimulation optique pour les études de couplage électrique intra- et intercellulaire

Myofibroblasts can spontaneously internalize silicon nanowires (SiNWs), making them an attractive target for bioelectronic applications. These ...

Simple, Affordable, and Modular Patterning of Cells using DNA

Modélisation simple, abordable et modulaire des cellules à l’aide de l’ADN

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells ...