Name: construction and use of an electrical stimulation chamber for enhancing osteogenic differentiation in mesenchymal stem/stromal cells in vitro
Uploaded: 2019-01-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro at JoVE.com

Diese Arbeit wurde zum Teil durch eine AO Foundation Gründungshilfe (03 / 14 / S-H) und die Stiftung Friedrichsheim (Stiftung Friedrichsheim) mit Sitz in Frankfurt/Main, Deutschland unterstützt.

1. Bau der Elektrostimulation Zelle Kultur Kammer
<ol><li>Um die EStim-Kammer zu bauen, sammeln Sie zwei Deckel der standard 6-Well Kultur Zellplatten; 99,99 % Platin Draht, 60 cm Länge mit einem Durchmesser von 0,5 – 1 mm; versilberter Kupferdraht, 70 cm in der Länge mit einem Durchmesser von 0,6 mm; Vornschneider; Lötkolben Kit; eine Tube supraleitenden Klebstoff; eine Anschlussklemme Lüsterklemme, sechs kleine 2,2 V LEDs (fakultativ); eine Tube korrosionsbeständig Silikonkleber Beschichtung (optional); eine K...

<ol>
	<li>Oryan, A., Kamali, A., Moshiri, A., Baghaban Eslaminejad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Bone+Regenerative+Medicine:+What+Is+the+Evidence?.">Role of Mesenchymal Stem Cells in Bone Regenerative Medicine: What Is the Evidence?.</a> Cells, Tissues, Organs. 204 (2), 59-83 (2017).</li><li>Mauney, J. R., Volloch, V., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Adult+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Bone+Tissue+Engineering+Applications:+Current+Status+and+Future+Prospects.">Role of Adult Mesenchymal Stem Cells in Bone Tissue Engineering Applications: Current Status and Future Prospects.</a> Tissue Engineering. 11 (5-6), 787-802 (2005).</li><li>Mobini, S., Leppik, L., Thottakkattumana Parameswaran, V., Barker, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+effect+of+direct+current+electrical+stimulation+on+rat+mesenchymal+stem+cells.">In vitro effect of direct current electrical stimulation on rat mesenchymal stem cells.</a> PeerJ. 5, e2821 (2017).</li><li>Leppik, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+electrical+stimulation+and+tissue+engineering+to+treat+large+bone+defects+in+a+rat+model.">Combining electrical stimulation and tissue engineering to treat large bone defects in a rat model.</a> Scientific Reports. 8 (1), S1 (2018).</li><li>Song, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+direct+current+electric+fields+to+cells+and+tissues+in+vitro+and+modulation+of+wound+electric+field+in+vivo.">Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo.</a> Nature Protocols. 2 (6), 1479-1489 (2007).</li><li>Hronik-Tupaj, M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+responses+of+two-+and+three-dimensional+engineered+tissues+to+electric+fields.">A review of the responses of two- and three-dimensional engineered tissues to electric fields.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 18 (3), 167-180 (2012).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+for+isolation+and+culture+of+mesenchymal+stem+cells+from+mouse+bone+marrow.">An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow.</a> Journal of Orthopaedic Translation. 3 (1), 26-33 (2015).</li><li>Nau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineered+vascularized+periosteal+flap+enriched+with+MSC/EPCs+for+the+treatment+of+large+bone+defects+in+rats.">Tissue engineered vascularized periosteal flap enriched with MSC/EPCs for the treatment of large bone defects in rats.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 907-917 (2017).</li><li>Eischen-Loges, M., Oliveira, K. M. C., Bhavsar, M. B., Barker, J. H., Leppik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretreating+mesenchymal+stem+cells+with+electrical+stimulation+causes+sustained+long-lasting+pro-osteogenic+effects.">Pretreating mesenchymal stem cells with electrical stimulation causes sustained long-lasting pro-osteogenic effects.</a> PeerJ. 6, 4959 (2018).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Curtis, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EF1alpha+and+RPL13a+represent+normalization+genes+suitable+for+RT-qPCR+analysis+of+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells.">EF1alpha and RPL13a represent normalization genes suitable for RT-qPCR analysis of bone marrow derived mesenchymal stem cells.</a> BMC Molecular Biology. 11, 61 (2010).</li><li>Wang, L., Li, Z. -. y., Wang, Y. -. p., Wu, Z. -. h., Yu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Expression+Profiles+of+Marker+Genes+in+Osteogenic+Differentiation+of+Human+Bone+Marrow-derived+Mesenchymal+Stem+Cells.">Dynamic Expression Profiles of Marker Genes in Osteogenic Differentiation of Human Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Chinese Medical Sciences Journal (Chung-kuo i hsueh k'o hsueh tsa chih). 30 (2), 108-113 (2015).</li><li>Kim, H. B., Ahn, S., Jang, H. J., Sim, S. B., Kim, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+corrosion+behaviors+and+surface+profiles+of+platinum-coated+electrodes+by+electrochemistry+and+complementary+microscopy:+biomedical+implications+for+anticancer+therapy.">Evaluation of corrosion behaviors and surface profiles of platinum-coated electrodes by electrochemistry and complementary microscopy: biomedical implications for anticancer therapy.</a> Micron. 38 (7), 747-753 (2007).</li><li>Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+field-induced+migration+and+intercellular+stress+alignment+in+a+collective+epithelial+monolayer.">Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer.</a> Molecular Biology of the Cell. , mbcE18010077 (2018).</li><li>Tai, G., Tai, M., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrically+stimulated+cell+migration+and+its+contribution+to+wound+healing.">Electrically stimulated cell migration and its contribution to wound healing.</a> Burns &amp; Trauma. 6, 20 (2018).</li><li>Love, M. R., Palee, S., Chattipakorn, S. C., Chattipakorn, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+electrical+stimulation+on+cell+proliferation+and+apoptosis.">Effects of electrical stimulation on cell proliferation and apoptosis.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (3), 1860-1876 (2018).</li><li>Adams, D. S., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+principles+for+measuring+resting+membrane+potential+and+ion+concentration+using+fluorescent+bioelectricity+reporters.">General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 385-397 (2012).</li><li>Jin, G., Li, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electrically+conductive+scaffold+as+the+skeleton+of+stem+cell+niche+in+regenerative+medicine.">The electrically conductive scaffold as the skeleton of stem cell niche in regenerative medicine.</a> Materials Science &amp; Engineering. C, Materials for Biological Applications. 45, 671-681 (2014).</li><li>Hronik-Tupaj, M., Rice, W. L., Cronin-Golomb, M., Kaplan, D. L., Georgakoudi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblastic+differentiation+and+stress+response+of+human+mesenchymal+stem+cells+exposed+to+alternating+current+electric+fields.">Osteoblastic differentiation and stress response of human mesenchymal stem cells exposed to alternating current electric fields.</a> Biomedical Engineering Online. 10, 9 (2011).</li></ol>

Hier beschreiben wir den Bau einer Kammer und eine Methode für die Behandlung von mesenchymalen Stammzellen mit EStim, der verbesserte osteogene Differenzierung führt.
Das EStim Setup präsentiert erfordert keine spezielle Ausrüstung/wissen und von Nachwuchswissenschaftlern in einem standard Stammzell-Biologie/Biochemie Labor durchgeführt werden kann. Allerdings muss beim Erstellen und verwenden der EStim-Kammer, in ein paar wichtige Schritte geachtet werden. Beim Umgang mit der Platin-Ele...

Zunahme/Trauma oder Krankheit-induzierte Knochendefekte sind mit unterschiedlichen Kombinationen der Zelltherapie und regenerative Medizin-Technologien behandelt werden. MSCs sind die Zelle der Auswahl in solche Behandlungen aufgrund ihrer relativ hohen knochenbildenden Aktivität, Isolierung und Ausbau Effizienz und Sicherheit1. Zur Maximierung ihrer knochenbildenden Aktivität und damit ihre therapeutische Wirksamkeit zu optimieren, wurden mehrere Methoden eingeführt, um MSCs vor ihrer Verwendung in diesen Behandlungen zu manipulieren (wie Mauney Et Al.2überprüft). Eine solche Methode ist EStim, das gezeigt worden ist, zu verbessern MSC osteogene Differenzierung in Vitro3 und Förderung der Knochenheilung in-vivo-4. Trotz der wachsenden Zahl von Studien mit Schwerpunkt auf die Behandlung von MSCs mit EStim muss eine optimale Therapie für die Maximierung der EStim Pro-osteogene Effekt noch definiert werden.
Andere in-vitro-Methoden mit EStim nutzen Salz Brücken, eingetaucht in das Kulturmedium, das Zellen von metallischen Elektroden5trennt. Der Vorteil hierbei ist, dass liefern EStim durch Salz Brücken die Einführung der chemischen Nebenprodukte (z.B. Korrosion von metallischen Elektroden) eliminiert, die zytotoxischen möglicherweise. Trotz dieses Vorteils Salz Brücken sind umständlich, mit zu arbeiten, und die EStim sie liefern unterscheidet, dass gelieferte in in-vivo-Modelle macht es schwierig, die Ergebnisse beim Einsatz der beiden Systeme korrelieren. Setups, die EStim über metallische oder Carbon Elektroden befestigt im Inneren der Zelle Kultur Brunnen liefern simulieren (wie Hronik Tupaj und Kaplan6überprüft) besser Geräte in Vivo; aber diese Geräte sind schwer zu reinigen sterilisieren/zwischen den Anwendungen und beschränkt sich die Anzahl der Zellen, die pro Experiment untersucht werden können. Wir entwarfen EStim Kammer präsentiert hier speziell um die Einschränkungen von diesen anderen Setups zu beheben. Während die meisten von unserer Erfahrung im Umgang mit diesem EStim-Saal wurde mit 2D und 3D Kulturen mit dem Knochenmark und Fettgewebe-Gewebe-abgeleitete MSCs3,4, ein großer Vorteil dieses Hauses ist, dass es ist vielseitig und mit relativ Änderungen, anpassbar andere Zelltypen unter einer Vielzahl von unterschiedlichen Bedingungen zu studieren.
Hier beschreiben wir den Bau einer EStim Zelle Kultur Kammer; dann zeigen wir Ihnen deren Nutzung durch Behandlung von MSCs mit verschiedenen Therapien EStim und den daraus resultierende Effekt auf osteogene Differenzierung zu messen. MSC osteogene Differenzierung wird durch Ablagerung von Kalzium, alkalische Phosphatase-Aktivität und osteogene Marker-gen-Expression beurteilt. Vor allem beobachtet Vergangenheit Experimente, die diese Einrichtung verwendet wir, dass diese Pro-osteogene Effekte bestehen, lange nach Beendigung der Therapie die EStim.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Estim fabrication</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Banana connector/Jack adaptor</td>
			<td>Poppstars</td>
			<td>1008554</td>
			<td>2 pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutting pliers</td>
			<td>Knipex</td>
			<td>78 03 125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC power supply (0-30V/0-3A)</td>
			<td>B&#38;K Precision</td>
			<td>Model 9130B</td>
			<td>Any simular model could be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulated flexible wires (0.14 mm2)</td>
			<td>Conrad Electronic International</td>
			<td>604794, 604093</td>
			<td>2 pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-corrosive silicone rubber</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3140 RTV</td>
			<td>*could be purchased by many stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Wire (999,5/1000; 1mm &#248;)</td>
			<td>Junker Edelmetalle</td>
			<td>00D-3010</td>
			<td>0.6 m needed for 1 Estim chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol solution</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td>Sterilisation of Estim chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver coated copper wire (0.6 mm &#248;)</td>
			<td>Conrad Electronic International</td>
			<td>409334 - 62</td>
			<td>&#8776;70 cm needed for 1 Estim device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering iron Set</td>
			<td>Conrad Electronic International</td>
			<td>1611410 - 62</td>
			<td>Any simular model could be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP 6-well plate lid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z707759-126EA</td>
			<td>2 lids for Estim chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.2V wired circular LEDs</td>
			<td>Conrad Electronic International</td>
			<td>599525 - 62</td>
			<td>6 pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UHU Super glue</td>
			<td>UHU GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>n/a</td>
			<td>*could be purchased by many stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Glycerophosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td>osteogenic cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>21885025</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td>osteogenic cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Falcon tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,547,004</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td>osteogenic cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague-Dawley (SD) rat mesenchymal stem cells, bone marrow origin</td>
			<td>Cyagen</td>
			<td>RASMX-01001</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell detachment solution</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>cell culture, cell detachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Flask, T75</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833911302</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP 6-well plates</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z707759-126EA</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Dye, 0.4% solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1450021</td>
			<td>cell count</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction and use of an electrical stimulation chamber for enhancing osteogenic differentiation in mesenchymal stem/stromal cells in vitro

Mesenchymale Stammzellen/Stromazellen Zellen (MSCs) wurden ausgiebig zur Förderung der Knochenheilung in Gewebetechnik Ansätze. Elektrostimulation (EStim) nachweislich zu erhöhen MSC osteogene Differenzierung in-vitro- und Förderung der Knochenheilung in klinischen Umgebungen. Hier beschreiben wir den Bau einer EStim Zelle Kultur Kammer und seine Verwendung bei der Behandlung von Ratte Bone-Marrow-derived MSC osteogene Differenzierung zu verbessern. Wir fanden, dass die Behandlung von MSCs mit EStim für 7 Tage führt zu einem deutlichen Anstieg der osteogene Differenzierung, und wichtig ist, diese Pro-osteogene Effekt bleibt lange nach (7 Tage) EStim eingestellt ist. Dieser Ansatz der Vorbehandlung MSCs mit EStim osteogene Differenzierung verbessern ließe sich Knochengewebe engineering Behandlungsergebnisse zu optimieren und so helfen ihnen, ihre volle therapeutische Potential zu erreichen. Neben dieser Anwendung dieser EStim Zelle Kultur Kammer und Protokoll auch einsetzbar, andere EStim-sensible Zelle Verhaltensweisen, z. B. Migration, Proliferation, Apoptose und Gerüst Anlage zu untersuchen.

Zur Bewertung der Wirkung der 100 mV/mm EStim auf die osteogene Differenzierung der MSCs, Zellen behandelt mit EStim für 3, wurden 7 und 14 Tagen oder aufbereitetem (Control) am 14. Tag der Kultivierung durch die morphologische Veränderungen und Kalzium Ablagerung (Abbildung 2 Bewertung analysiert ). Dies geschah durch bildgebende Zellen mittels Hellfeld Mikroskopie (Morphologie Änderungen) oder durch Befestigung Zellen in 4 % Paraformaldehyd Lösung, mit ...

Watch this Scientific Journal Video about Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro at JoVE.com

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

Hier präsentieren wir ein Protokoll für den Bau einer Zelle Kultur Kammer entwickelt, um Zellen zu verschiedenen Arten von elektrische Stimulation, und seine Verwendung bei der Behandlung von mesenchymalen Stammzellen zur Verbesserung der osteogene Differenzierung aufzudecken.

Bau und Betrieb von einer Kammer elektrische Stimulation zur Verbesserung der osteogene Differenzierung mesenchymaler Stammzellen/Stromazellen Zellen In Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Hier zeigen wir, wie man eine elektrische Stimulationskammer mit gängigen sechs Wandkulturplatten baut und wie man sie einsetzt, um die osteogene Differenzierung in mesenchymalen Stammzellen zu stimulieren. Diese Kammer ist einfach und nicht teuer zu bauen, und kann in mehreren Experimenten wiederverwendet werden. Nach der Vorbehandlung mit elektrischer Stimulation in unserer Kammer können mesenchymale Stammzellen verwendet werden, um die Ergebnisse in knochengewebetechnischen Behandlungen zu verbessern.Diese Kammer kann auch verwendet werden, um andere Zelltypen und elektroempfindliche Zellverhalten wie Migration, Proliferation, Veränderungen im Membranpotential, Apoptose und sorgfältige Anhaftung zu untersuchen. In einem sechs Bohrblechdeckel, markieren und bohren Sie dann zwei Löcher mit einem Millimeter Durchmesser, 25 Millimeter voneinander entfernt, in der Nähe der äußeren Kante jeder der sechs Bohrungen. Als nächstes schneiden Sie einen Platindraht in 12 fünf Zentimeter lange Abschnitte.Biegen Sie jeden Fünf-Zentimeter-Abschnitt manuell in eine L"-Form, so dass ein Ende drei Zentimeter lang und die anderen zwei Zentimeter lang sind. Dann schneiden Sie den silberbeschichteten Draht in zwei 35-Zentimeter-Längen. Setzen Sie das längere gebogene Ende eines Platindrahtes in das Bohrloch ein, sodass ein bis zwei Millimeter von der Außenseite des Deckels herausragen.Biegen Sie es mit Zangen. Anschließend die Platindrähte in den Deckellöchern mit superleitendem Kleber befestigen und ca. sechs Stunden trocknen lassen. Zur Vorbereitung der Kathoden löten Sie die Spitzen aller sechs Platindrähte, die vom Deckel auf einen der silberbeschichteten Drähte ragen.Zur Vorbereitung der Anoden die restlichen sechs Platindrähte auf andere silberbeschichtete Drähte löten. Fügen Sie anschließend LEDs in den Kreislauf zwischen jedem der sechs Anoden-Kathoden-Platin-Elektroden-Paare hinzu, um die Funktionalität zu bestätigen. Legen Sie ein Stück schwarzes Isolierband unter jede LED, um zu verhindern, dass die Zellen in den Kulturplatten LED-Licht aussetzen.Als nächstes kleben Sie den Drahtklemmenstecker an die linke obere Ecke des Sechs-Well-Plattendeckels und verbinden Sie beide silberbeschichteten Drähte mit den Eingangsklemmen. Schneiden Sie dann einen 20-Millimeter-mal 20-Millimeter-Quadratteil aus der linken oberen Ecke eines zweiten Sechs-Well-Plattendeckels aus, um den Klemmenblockanschluss auf dem ersten Deckel unterzubringen. Bedecken Sie den ersten Deckel, der mit den Elektroden ausgestattet ist, mit dem zweiten Deckel und kleben Sie sie mit Klebeband zusammen.Schließen Sie ein Ende der beiden standardmäßig isolierten Kupferdrähte an die Ausgangsklemmen des Drahtsteckers und das andere Ende an Bananensteckeranschlüsse an. Schalten Sie das Netzteil ein, indem Sie die ON-OFF-Taste auf der Frontplatte drücken. Aktivieren Sie Kanal eins durch Drücken der Taste eins.Danach drücken Sie Taste vier, um die Spannung einzustellen. Stellen Sie den Lastausgang auf 2,5 Volt ein. Drücken Sie dann die Eingabetaste.Am Tag, an dem die Zellen mit E-Stiel behandelt werden, sterilisieren Sie die Elektroden in 70%Ethanol-Lösung für 30 Minuten. Dann trocknen Sie sie unter UV-Licht in einem Sicherheitsschrank für weitere 30 Minuten. In einer laminaren Durchflusshaube bedecken Sie die Sechs-Well-Platte mit den kultivierten MSCs mit dem deckel, der mit den Elektroden ausgestattet ist, und stellen Sie sicher, dass die Elektroden vollständig in das Medium eingetaucht sind.Übertragen Sie dann die abgedeckte Sechs-Well-Platte mit Zellen an den Inkubator und schließen Sie ihre Drähte an das Netzteil an. Als nächstes stellen Sie die Stromversorgung auf 2,5 Volt Lastausgang und behandeln Sie die Zellen mit E-Stamm für eine Stunde. Trennen Sie nach der Stimulation die Stromversorgung und entfernen Sie die E-Stielkammer aus dem Inkubator.Ersetzen Sie unter sterilen Bedingungen den mit Elektroden ausgestatteten Deckel durch einen Standard-Sechs-Well-Plattendeckel. Anschließend die Zellen an den Inkubator zurückgeben und über Nacht verlassen. Reinigen Sie die Elektroden zuerst mit PBS und dann mit 70% Ethanollösung.Reinigen Sie dann die angesammelten Korrosionsprodukte von der Elektrodenoberfläche mit feinem Schleifpapier. Wiederholen Sie die E-Stiel-Behandlung für sechs aufeinanderfolgende Tage. Am vierten Tag, vor der Anwendung der elektrischen Stimulation, und unter sterilen Bedingungen, ändern Sie das Kulturmedium, indem Sie 1,5 Milliliter Medium ansaugen und durch 1,5 Milliliter vorgewärmtes, frisches osteogenes Differenzierungsmedium ersetzen.Nach der Anwendung der elektrischen Stimulation für sieben aufeinanderfolgende Tage, halten Sie die Zellen in kultur für weitere sieben Tage, Austausch des Mediums alle drei bis vier Tage. Wenn die Behandlung abgeschlossen ist, analysieren Sie die Zellmorphologie-Änderungen unter dem Mikroskop. Um die Auswirkungen der elektrischen Stimulation auf die osteogene MSC-Differenzierung zu bewerten, messen Sie die Kalziumabscheidung, die alkalische Phosphataseaktivität und die osteogene Marker-Genexpression, wie an anderer Stelle beschrieben.Um die Wirkung von 100 Millivolt pro Millimeter elektrischer Stimulation auf die osteogene MSC-Differenzierung zu bewerten, wurden Zellen, die drei, sieben und 14 Tage lang mit elektrischer Stimulation behandelt wurden, und nicht behandelte Zellen am 14. Tag der Kultur analysiert, indem morphologische Veränderungen und Kalziumablagerungen bewertet wurden. Signifikante Veränderungen in der Zellmorphologie und Kalziumablagerungen waren in Zellen sichtbar, die sieben und 14 Tage lang mit elektrischer Stimulation behandelt wurden. Eine detaillierte Analyse der Veränderungen der osteogenen Marker-Genexpression wurde an den Tagen drei, sieben und 14 der Kultur durchgeführt.An Tag sieben der Kultur war die RunX2-Expression in Zellen, die sieben Tage lang mit elektrischer Stimulation behandelt wurden, signifikant höher. Während colla1-Expression in Zellen, die sieben Tage lang behandelt wurden, signifikant höher war, gemessen am Tag 14 der Kultur. Die Expression von Osteopontin wurde in elektrisch stimulierten Zellen an den Tagen drei, sieben und 14 der Kultur signifikant erhöht.Osterix-Expression fehlte in Kontrollzellen zu allen Zeitpunkten und wurde nur bei sieben und 14 Tagen Kultur in Zellen gesehen, die elektrischer Stimulation ausgesetzt waren. Die elektrische Stimulationskammer ist relativ einfach zu bauen. Besondere Vorsicht ist jedoch bei der Handhabung der Platindrähte sowie bei der Reinigung und Sterilisation der Elektroden geboten.Zellen, die in unserer Kammer mit Strom vorbehandelt wurden, allein oder auf einem Gerüstmaterial sitzend, könnten in Tiermodelle implantiert werden, um zu untersuchen, wie die positive Wirkung der elektrischen Stimulation in vitro fortbesteht. Diese Technik bietet ein einfaches, aber leistungsstarkes Werkzeug, um den Mechanismus zu untersuchen, mit dem elektrische Stimulation die Zellfunktionen reguliert. Dieses Wissen kann in regenerativen Medizinzellen verfügbar sein.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Engineering Skeletal Muscle Gewebe von Murine Myoblast Progenitor Cells und Anwendung von Elektrostimulation

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

Forschung

Biotechnik

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Test auf Augenreizung (EIT) zur Kennzeichnung der Gefahr von Augen Reizt Chemicals mit rekonstruierter menschlicher Hornhaut-ähnlichen Epithelial (RhCE) Gewebemodell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

Polyelektrolytkomplex für Heparin-Bindungsdomäne Osteogenisches Growth Factor Lieferung

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modell der Murine Bandscheiben

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

3D Hydrogel Kulturen von primären Gliazellen für In-vitro- Modellierung von Neuroinflammation verbessert

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Isolierung von mesenchymalen Stammzellen aus menschlichen alveoläre Periost und Effekte von Vitamin D auf knochenbildenden Aktivität Periost-abgeleitete Zellen

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential

Gleichzeitige elektrische und mechanische Stimulation, Cells Cardiomyogenic Potenzial zu steigern

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Erweiterte 3D-Lebermodelle für In-vitro-Genotoxizitätstests nach langfristiger Nanomaterial-Exposition

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling

Silizium-Nanodrähte und optische Stimulation für Untersuchungen der intra- und interzellulären elektrischen Kopplung

Myofibroblasts can spontaneously internalize silicon nanowires (SiNWs), making them an attractive target for bioelectronic applications. These ...

Simple, Affordable, and Modular Patterning of Cells using DNA

Einfache, erschwingliche und modulare Musterung von Zellen mit DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells ...