Name: construction and use of an electrical stimulation chamber for enhancing osteogenic differentiation in mesenchymal stem/stromal cells in vitro
Uploaded: 2019-01-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro at JoVE.com

עבודה זו נתמך בחלקה של אאו גרנט סטארט-אפ של קרן (S-14-03 H) ושל קרן Friedrichsheim (Stiftung Friedrichsheim) ב פרנקפורט, גרמניה.

1. בנייה לשכת התרבות של גירוי חשמלי תא
<ol><li>כדי לבנות תא EStim, לאסוף את העפעפיים שני לוחות תרבות תא 6-ובכן תקן; 99.99% פלטינה חוט, 60 ס"מ אורך בקוטר של 0.5-1 מ מ; חוט נחושת מצופה כסף, 70 ס מ אורך בקוטר 0.6 מ"מ; פלייר למהנדס חשמל; מלחם קיט; שפופרת אחת של דבק superconductive; חוט אחד מסוף לחסום מחבר, שישה קטנים 2.2 V נוריו...

<ol>
	<li>Oryan, A., Kamali, A., Moshiri, A., Baghaban Eslaminejad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Bone+Regenerative+Medicine:+What+Is+the+Evidence?.">Role of Mesenchymal Stem Cells in Bone Regenerative Medicine: What Is the Evidence?.</a> Cells, Tissues, Organs. 204 (2), 59-83 (2017).</li><li>Mauney, J. R., Volloch, V., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Adult+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Bone+Tissue+Engineering+Applications:+Current+Status+and+Future+Prospects.">Role of Adult Mesenchymal Stem Cells in Bone Tissue Engineering Applications: Current Status and Future Prospects.</a> Tissue Engineering. 11 (5-6), 787-802 (2005).</li><li>Mobini, S., Leppik, L., Thottakkattumana Parameswaran, V., Barker, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+effect+of+direct+current+electrical+stimulation+on+rat+mesenchymal+stem+cells.">In vitro effect of direct current electrical stimulation on rat mesenchymal stem cells.</a> PeerJ. 5, e2821 (2017).</li><li>Leppik, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+electrical+stimulation+and+tissue+engineering+to+treat+large+bone+defects+in+a+rat+model.">Combining electrical stimulation and tissue engineering to treat large bone defects in a rat model.</a> Scientific Reports. 8 (1), S1 (2018).</li><li>Song, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+direct+current+electric+fields+to+cells+and+tissues+in+vitro+and+modulation+of+wound+electric+field+in+vivo.">Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo.</a> Nature Protocols. 2 (6), 1479-1489 (2007).</li><li>Hronik-Tupaj, M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+responses+of+two-+and+three-dimensional+engineered+tissues+to+electric+fields.">A review of the responses of two- and three-dimensional engineered tissues to electric fields.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 18 (3), 167-180 (2012).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+for+isolation+and+culture+of+mesenchymal+stem+cells+from+mouse+bone+marrow.">An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow.</a> Journal of Orthopaedic Translation. 3 (1), 26-33 (2015).</li><li>Nau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineered+vascularized+periosteal+flap+enriched+with+MSC/EPCs+for+the+treatment+of+large+bone+defects+in+rats.">Tissue engineered vascularized periosteal flap enriched with MSC/EPCs for the treatment of large bone defects in rats.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 907-917 (2017).</li><li>Eischen-Loges, M., Oliveira, K. M. C., Bhavsar, M. B., Barker, J. H., Leppik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretreating+mesenchymal+stem+cells+with+electrical+stimulation+causes+sustained+long-lasting+pro-osteogenic+effects.">Pretreating mesenchymal stem cells with electrical stimulation causes sustained long-lasting pro-osteogenic effects.</a> PeerJ. 6, 4959 (2018).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Curtis, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EF1alpha+and+RPL13a+represent+normalization+genes+suitable+for+RT-qPCR+analysis+of+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells.">EF1alpha and RPL13a represent normalization genes suitable for RT-qPCR analysis of bone marrow derived mesenchymal stem cells.</a> BMC Molecular Biology. 11, 61 (2010).</li><li>Wang, L., Li, Z. -. y., Wang, Y. -. p., Wu, Z. -. h., Yu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Expression+Profiles+of+Marker+Genes+in+Osteogenic+Differentiation+of+Human+Bone+Marrow-derived+Mesenchymal+Stem+Cells.">Dynamic Expression Profiles of Marker Genes in Osteogenic Differentiation of Human Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Chinese Medical Sciences Journal (Chung-kuo i hsueh k'o hsueh tsa chih). 30 (2), 108-113 (2015).</li><li>Kim, H. B., Ahn, S., Jang, H. J., Sim, S. B., Kim, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+corrosion+behaviors+and+surface+profiles+of+platinum-coated+electrodes+by+electrochemistry+and+complementary+microscopy:+biomedical+implications+for+anticancer+therapy.">Evaluation of corrosion behaviors and surface profiles of platinum-coated electrodes by electrochemistry and complementary microscopy: biomedical implications for anticancer therapy.</a> Micron. 38 (7), 747-753 (2007).</li><li>Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+field-induced+migration+and+intercellular+stress+alignment+in+a+collective+epithelial+monolayer.">Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer.</a> Molecular Biology of the Cell. , mbcE18010077 (2018).</li><li>Tai, G., Tai, M., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrically+stimulated+cell+migration+and+its+contribution+to+wound+healing.">Electrically stimulated cell migration and its contribution to wound healing.</a> Burns &amp; Trauma. 6, 20 (2018).</li><li>Love, M. R., Palee, S., Chattipakorn, S. C., Chattipakorn, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+electrical+stimulation+on+cell+proliferation+and+apoptosis.">Effects of electrical stimulation on cell proliferation and apoptosis.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (3), 1860-1876 (2018).</li><li>Adams, D. S., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+principles+for+measuring+resting+membrane+potential+and+ion+concentration+using+fluorescent+bioelectricity+reporters.">General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 385-397 (2012).</li><li>Jin, G., Li, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electrically+conductive+scaffold+as+the+skeleton+of+stem+cell+niche+in+regenerative+medicine.">The electrically conductive scaffold as the skeleton of stem cell niche in regenerative medicine.</a> Materials Science &amp; Engineering. C, Materials for Biological Applications. 45, 671-681 (2014).</li><li>Hronik-Tupaj, M., Rice, W. L., Cronin-Golomb, M., Kaplan, D. L., Georgakoudi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblastic+differentiation+and+stress+response+of+human+mesenchymal+stem+cells+exposed+to+alternating+current+electric+fields.">Osteoblastic differentiation and stress response of human mesenchymal stem cells exposed to alternating current electric fields.</a> Biomedical Engineering Online. 10, 9 (2011).</li></ol>

כאן נתאר הקמת תא, שיטה לטיפול בבעיות גזע mesenchymal עם EStim כי התוצאות התמיינות משופרת osteogenic.
הגדרת EStim שהוצגו לא דורשת ציוד/ידע מיוחד, יכול להתבצע בתוך מעבדה ביולוגיה/ביוכימיה סטנדרטי בתאי גזע על ידי החוקרים הצעירים. עם זאת, כאשר בונים ומפעילים תא EStim, טיפול מיוחד חייב להילקח מספר ?...

עלייה טראומה ו/או פגמים הנוצרות על-ידי מחלת עצם מטופלים באמצעות צירופים שונים של טיפול בתאי וטכנולוגיות רפואה רגנרטיבית. MSCs הם התא לפי בחירה, טיפולים כאלה, בשל פעילות osteogenic יחסית גבוהה, בידוד, הרחבת והיעילות, בטיחות1. על מנת למקסם את הפעילות osteogenic שלהם, לכן, למטב את האפקטיביות הטיפולית שלהם, הוכנסו מספר שיטות לטיפול MSCs לפני השימוש בטיפולים אלה (כפי שנסקרו על ידי Mauney et al.2). שיטה אחת כזאת היא EStim, אשר הוכח לשפר MSC בידול osteogenic חוץ גופית3 ולקדם את עצם ריפוי ויוו4. למרות המספר הגדל והולך של לימודי התמקדות בטיפול MSCs עם EStim, משטר אופטימלית עבור למקסם את אפקט pro-osteogenic של EStim טרם מוגדר.
שיטות הפריה אחרות באמצעות EStim לנצל את גשרי מלח בתוך המדיום תרבות, המפריד בין תאים אלקטרודות מתכתי5. היתרון של זה היא כי אספקת EStim באמצעות גשרים מלח מבטלת המבוא של לוואי כימיות (למשל, קורוזיה של אלקטרודות מתכתי) שעשויים להיות ציטוטוקסיות. למרות יתרון זה, גשרי מלח הם מסורבלים כדי לעבוד עם, EStim הם מספקים שונה כי מודלים ויוו ונמסרו ב, ולכן קשה לתאם את התוצאות המתקבלות בעת שימוש את שתי המערכות. כיוונוני לספק EStim באמצעות אלקטרודות מתכתי או פחמן קבוע בתוך הבארות התרבות התא (כפי שנסקרו על ידי Hronik-Tupaj, קפלן6) כדאי לדמות התקנים המשמשים ויוו; עם זאת, התקנים אלה שקשה לנקות/לחטא בין שימושים, מספר התאים שניתן ללמוד לכל ניסוי מוגבל. תיכננו תא EStim המובאים כאן במיוחד כדי לטפל המגבלות של אלה כיוונונים אחרים. בעוד רוב הניסיון שלנו באמצעות לשכת EStim הזה כבר עם 2D ו 3D תרבויות המכיל מח עצם ושומן-רקמה-נגזר MSCs3,4, אחד היתרונות המרכזיים של החדר הזה זה תכליתי והוא, עם יחסית מינורי שינויים, ניתן להתאים ללמוד את סוגי תאים אחרים תחת מגוון תנאים שונים.
כאן נתאר את בניית חדר תרבות תא EStim; לאחר מכן, נדגים את השימוש בו על ידי MSCs בטיפול עם משטרי שונים של EStim ומדידת האפקט המתקבל על בידול osteogenic. בידול osteogenic MSC מוערך באמצעות התצהיר סידן פעילות פוספטאז אלקליין, ביטוי גנים סמן osteogenic. חשוב, ב עבר ניסויים בשימוש תוכנית התקנה זו, הבחנו כי השפעות פרו-osteogenic אלו נמשכות זמן רב לאחר הטיפול EStim הופסק.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Estim fabrication</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Banana connector/Jack adaptor</td>
			<td>Poppstars</td>
			<td>1008554</td>
			<td>2 pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutting pliers</td>
			<td>Knipex</td>
			<td>78 03 125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC power supply (0-30V/0-3A)</td>
			<td>B&#38;K Precision</td>
			<td>Model 9130B</td>
			<td>Any simular model could be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulated flexible wires (0.14 mm2)</td>
			<td>Conrad Electronic International</td>
			<td>604794, 604093</td>
			<td>2 pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-corrosive silicone rubber</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3140 RTV</td>
			<td>*could be purchased by many stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Wire (999,5/1000; 1mm &#248;)</td>
			<td>Junker Edelmetalle</td>
			<td>00D-3010</td>
			<td>0.6 m needed for 1 Estim chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol solution</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td>Sterilisation of Estim chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver coated copper wire (0.6 mm &#248;)</td>
			<td>Conrad Electronic International</td>
			<td>409334 - 62</td>
			<td>&#8776;70 cm needed for 1 Estim device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering iron Set</td>
			<td>Conrad Electronic International</td>
			<td>1611410 - 62</td>
			<td>Any simular model could be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP 6-well plate lid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z707759-126EA</td>
			<td>2 lids for Estim chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.2V wired circular LEDs</td>
			<td>Conrad Electronic International</td>
			<td>599525 - 62</td>
			<td>6 pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UHU Super glue</td>
			<td>UHU GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>n/a</td>
			<td>*could be purchased by many stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Glycerophosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td>osteogenic cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>21885025</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td>osteogenic cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Falcon tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,547,004</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td>osteogenic cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague-Dawley (SD) rat mesenchymal stem cells, bone marrow origin</td>
			<td>Cyagen</td>
			<td>RASMX-01001</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell detachment solution</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>cell culture, cell detachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Flask, T75</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833911302</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP 6-well plates</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z707759-126EA</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Dye, 0.4% solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1450021</td>
			<td>cell count</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction and use of an electrical stimulation chamber for enhancing osteogenic differentiation in mesenchymal stem/stromal cells in vitro

תאי גזע mesenchymal/סטרומה (MSCs) נעשה שימוש נרחב כדי לקדם את עצם ריפוי ברקמות הנדסה גישות. גירוי חשמלי (EStim) הוכח להגדיל MSC בידול osteogenic במבחנה, לקדם את עצם ריפוי בהגדרות קליניים. כאן נתאר הקמת חדר תרבות תא EStim ואלשין השימוש בטיפול עצמות מח-נגזר MSC כדי לשפר את הבידול osteogenic. מצאנו כי בטיפול MSCs עם EStim במשך 7 ימים גורמת לעליה משמעותית הבידול osteogenic, חשוב, אפקט pro-osteogenic זה נמשכת זמן רב לאחר (7 ימים) EStim הוא הופסק. גישה זו של pretreating MSCs עם EStim כדי לשפר את הבידול osteogenic יכול לשמש כדי למטב את רקמת העצם הנדסה תוצאות הטיפול, לפיכך, לסייע להם לממש את הפוטנציאל הטיפולי מלאה שלהם. בנוסף יישום זה, הזה EStim תא תרבות קאמרית, פרוטוקול יכול לשמש גם כדי לחקור התנהגויות תא רגיש EStim אחרות, כגון העברה, התפשטות, אפופטוזיס מצורף לגרדום.

כדי להעריך את ההשפעה של 100 mV/מ מ EStim על הבידול osteogenic של MSCs, תאים שטופלו EStim עבור 3, 7, ו 14 ימים או nontreated (בקרה) נותחו ביום 14 של culturing על-ידי הערכת שינויים מורפולוגיים ומשקעים סידן (איור 2 ). הדבר נעשה על-ידי הדמיה תאים באמצעות מיקרוסקופיית שדה בהיר (מורפולוגיה שינוי...

Watch this Scientific Journal Video about Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro at JoVE.com

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

כאן אנו מציגים פרוטוקול להקמת תא התרבות תאים שנועדו לחשוף תאים לסוגים שונים של גירוי חשמלי, ושימוש בו בטיפול גזע mesenchymal כדי לשפר את הבידול osteogenic.

בנייה ושימוש חדר גירוי חשמלי לשיפור Osteogenic התמיינות בתאי גזע Mesenchymal/סטרומה במבחנה

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

כאן, אנו מראים כיצד לבנות תא גירוי חשמלי באמצעות שש צלחות תרבות קיר נפוצות, וכיצד להשתמש בו על מנת לעורר בידול אוסטאוגני בתאי גזע mesenchymal. תא זה קל ולא יקר לבנייה, ו ניתן לעשות בו שימוש חוזר בניסויים מרובים. לאחר שטופלו מראש בגירוי חשמלי בתא שלנו, ניתן להשתמש בתאי גזע קסנצ'ימליים כדי לשפר את התוצאות בטיפולים בהנדסת רקמת עצם.תא זה יכול לשמש גם כדי לחקור סוגי תאים אחרים והתנהגויות תאים רגישים אלקטרו כמו הגירה, התפשטות, שינויים בפוטנציאל הממברנה, אפופטוזיס, ו התקשרות זהירה. במכסה צלחת שש באר, לסמן ולאחר מכן לקדוח שני חורים בקוטר מילימטר אחד, 25 מילימטרים זה מזה, ליד הקצה החיצוני של כל אחת משש בארות. לאחר מכן, חותכים חוט פלטינה לחלקים באורך 125 ס"מ.כופפו ידנית כל קטע באורך חמישה סנטימטרים לצורת L, והשאירו קצה אחד באורך שלושה סנטימטרים, ואת שני סנטימטרים נוספים. לאחר מכן, חותכים את החוט מצופה הכסף לשני אורכי 35 ס"מ. הכנס את הקצה הכפוף הארוך יותר של חוט פלטינה לתוך החור שנקדח, והשאיר אחד עד שני מילימטרים בולטים מהחוץ של המכסה.לכופף אותו באמצעות מדפים. לאחר מכן, לאבטח את חוטי הפלטינה בחורי המכסה עם דבק מוליך סופר ולהשאיר אותם להתייבש במשך כשש שעות. כדי להכין את הקתודות, הלחים את קצות כל ששת חוטי הפלטינה הבולטים מהמכסה לאחד החוטים מצופים הכסף.כדי להכין את האנודות, הלחים את ששת חוטי הפלטינה הנותרים לחוטים אחרים מצופים כסף. לאחר מכן, להוסיף נוריות במעגל בין כל אחד מששת זוגות אנודה-קתודה פלטינה אלקטרודה כדי לאשר את הפונקציונליות. מניחים פיסת סרט בידוד שחור מתחת לכל LED כדי למנוע חשיפת התאים בצלחות התרבות לאור LED.לאחר מכן, הדבק את מחבר בלוק מסוף החוט לפינה השמאלית העליונה של מכסה הלוח בן ששת הבארים, וחבר את שני החוטים מצופים הכסף למסופי הקלט. לאחר מכן, לגזור 20 מילימטר על ידי 20 מילימטר מרובע קטע מהפינה השמאלית העליונה של מכסה צלחת שש באר השני, כדי להתאים את מחבר בלוק מסוף על המכסה הראשון. מכסים את המכסה הראשון, מצויד באלקטרודות, עם המכסה השני, וקלטת אותם יחד עם סרט דבק.חבר קצה אחד של שני חוטי הנחושת המבודדים הסטנדרטיים למסופי הפלט של מחבר התיל, והשני מסתיים במחברים זכרי בננה. הפעל את ספק הכוח על-ידי לחיצה על לחצן כיבוי בלוח הקדמי. הפעל את ערוץ 1 על-ידי לחיצה על לחצן אחד.לאחר מכן, לחץ על כפתור ארבע כדי להגדיר את המתח. הגדר את פלט העומס על 2.5 וולט. לאחר מכן הקש Enter.ביום שבו התאים מטופלים בגזע E, מעקרים את האלקטרודות בתסכול 70%אתנול למשך 30 דקות. לאחר מכן, ייבשו אותם תחת אור UV בארון בטיחות למשך 30 דקות נוספות. במכסה המנוע של זרימה למינארית, מכסים את לוח שש הבאר המכיל את ה- MSCs התרבותיים עם המכסה המצויד באלקטרודות, ומוודאים כי האלקטרודות שקועות לחלוטין במדיום.לאחר מכן, להעביר את צלחת שש באר מכוסה עם תאים לאנקובטור ולחבר את החוטים שלה לאספקת החשמל. לאחר מכן, הגדר את אספקת החשמל לתפוקת עומס של 2.5 וולט וטפל בתאים עם גזע E למשך שעה אחת. לאחר הגירוי, לנתק את אספקת החשמל ולהסיר את תא גזע E מהאינקובטור.בתנאים סטריליים, החליפו את המכסה, המצויד באלקטרודות, במכסה לוח סטנדרטי של שש בארות. לאחר מכן, להחזיר את התאים לאנקובטור, ולהשאיר אותם לילה. נקה את האלקטרודות, תחילה עם PBS, ולאחר מכן עם 70%פתרון אתנול.לאחר מכן, לנקות את מוצרי קורוזיה שנצברו מפני השטח אלקטרודה עם נייר זכוכית עדין. חזור על הטיפול בגזע E במשך שישה ימים רצופים. ביום הרביעי, לפני החלת גירוי חשמלי, ובתנאים סטריליים, לשנות את מדיום התרבות על ידי שאיפה 1.5 מיליליטר של בינוני והחלפתו עם 1.5 מיליליטר של מדיום בידול אוסטאוגני מחומם מראש, טרי.לאחר החלת גירוי חשמלי במשך שבעה ימים רצופים, לשמור על התאים בתרבות במשך שבעה ימים נוספים, החלפת המדיום כל שלושה עד ארבעה ימים. כאשר הטיפול הושלם, לנתח את השינויים מורפולוגיה התא תחת מיקרוסקופ. כדי להעריך את ההשפעה של גירוי חשמלי על בידול אוסטאוגני MSC, למדוד תצהיר סידן, פעילות phosphatase אלקליין, ביטוי גנים סמן osteogenic, כמתואר במקומות אחרים.כדי להעריך את ההשפעה של 100 מילי-וולט למילימטר של גירוי חשמלי על ההתברלות האוסטאוגנית MSC, תאים שטופלו בגירוי חשמלי במשך שלושה, שבעה ו -14 ימים ותאים שאינם מטופלים, נותחו ביום 14 של התרבות על ידי הערכת שינויים מורפולוגיים ותצהיר סידן. שינויים משמעותיים במורפולוגיה של התאים ובפיקדונות הסידן נראו בתאים שטופלו בגירוי חשמלי במשך שבעה ו-14 ימים. ניתוח מפורט של שינויים בביטוי גנים של סמן אוסטאוגני בוצע בימים 3, 7 ו-14 של תרבות.ביום השביעי לתרבות, הביטוי RunX2 היה גבוה משמעותית בתאים שטופלו בגירוי חשמלי במשך שבעה ימים. בעוד ביטוי Colla1 היה גבוה משמעותית בתאים שטופלו במשך שבעה ימים, נמדד ביום 14 של התרבות. הביטוי של אוסטאופונטין גדל באופן משמעותי בתאים מגורה חשמלית בימים שלוש, שבע, ו 14 של תרבות.ביטוי אוסטריקס נעדר בתאי בקרה בכל נקודות הזמן, ונראינו רק בשבעה ו -14 ימים של תרבות בתאים שנחשפו לגירוי חשמלי. תא הגירוי החשמלי קל יחסית לבנייה. עם זאת, יש לדאוג במיוחד בעת טיפול בחוילי הפלטינה, וגם בעת ניקוי ועיקור האלקטרודות.תאים שטופלו מראש בחשמל בתא שלנו, לבד או יושבים על חומר פיגומים, יכולים להיות מושתלים במודלים של בעלי חיים, כדי לחקור כיצד ההשפעה החיובית של גירוי חשמלי נמשכת במבחנה. טכניקה זו מספקת כלי פשוט אך רב עוצמה ללמוד את המנגנון שבאמצעותו גירוי חשמלי מווסת את תפקודי התאים. ידע זה יכול להיות זמין בתאי רפואה רגנרטיבית.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

רקמות שריר שלד הנדסה מתאי Murine היצמדות מולידו ויישום של גירוי חשמלי

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

גירוי מבחן העין (EIT) לסיכוני זיהוי כימיקלים עיניים מעצבנים באמצעות אפיתל דגם רקמות כמו-קרנית משוחזר אדם (RHCE)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

קומפלקס polyelectrolyte למשלוח גורם הגדילה osteogenic דומיין כריכה הפרין

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם תרבות איברים של הדיסק הבין חולייתי Murine

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

שיפור תרבויות הידרוג 3D של תאי גליה העיקרי עבור במבחנה דוגמנות של Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

בידוד של גזע Mesenchymal מן האדם קרום העצם מכתשיים ואפקטים של ויטמין D על פעילות Osteogenic של תאים נגזר קרום העצם

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential

גירויים חשמליים ומכניים בו זמנית כדי לשפר את פוטנציאל Cardiomyogenic של תאים

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

דגמי כבד תלת-ממדיים מתקדמים לבדיקות גנוטוקסיות במבחנה בעקבות חשיפה ננו-חומרית לטווח ארוך

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling

ננו-חוטי סיליקון וגירוי אופטי לחקירות של צימוד חשמלי פנים-תאי

Myofibroblasts can spontaneously internalize silicon nanowires (SiNWs), making them an attractive target for bioelectronic applications. These ...

Simple, Affordable, and Modular Patterning of Cells using DNA

דפוס פשוט, זול ומודולרי של תאים המשתמשים ב- DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells ...