Name: construction and use of an electrical stimulation chamber for enhancing osteogenic differentiation in mesenchymal stem/stromal cells in vitro
Uploaded: 2019-01-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una sovvenzione di Start-up di fondazione AO (S-14-03 H) e la Fondazione di Friedrichsheim (Stiftung Friedrichsheim) con sede a Francoforte sul meno, Germania.

1. costruzione di alloggiamento della coltura di stimolazione elettrica delle cellule
<ol><li>Per costruire la camera EStim, raccogliere due coperchi delle piastre per colture cellulari 6 pozzetti standard; filo di platino al 99,99%, 60 cm di lunghezza con un diametro di 0,5 – 1 mm; filo di rame argentati, 70 cm di lunghezza con un diametro di 0,6 mm; pinze di taglio; kit saldatore; un tubetto di colla superconduttore; connettore del blocchetto terminali di monofilo, sei piccolo 2,2 V LED (opzionale); un tubo di ades...

<ol>
	<li>Oryan, A., Kamali, A., Moshiri, A., Baghaban Eslaminejad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Bone+Regenerative+Medicine:+What+Is+the+Evidence?.">Role of Mesenchymal Stem Cells in Bone Regenerative Medicine: What Is the Evidence?.</a> Cells, Tissues, Organs. 204 (2), 59-83 (2017).</li><li>Mauney, J. R., Volloch, V., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Adult+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Bone+Tissue+Engineering+Applications:+Current+Status+and+Future+Prospects.">Role of Adult Mesenchymal Stem Cells in Bone Tissue Engineering Applications: Current Status and Future Prospects.</a> Tissue Engineering. 11 (5-6), 787-802 (2005).</li><li>Mobini, S., Leppik, L., Thottakkattumana Parameswaran, V., Barker, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+effect+of+direct+current+electrical+stimulation+on+rat+mesenchymal+stem+cells.">In vitro effect of direct current electrical stimulation on rat mesenchymal stem cells.</a> PeerJ. 5, e2821 (2017).</li><li>Leppik, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+electrical+stimulation+and+tissue+engineering+to+treat+large+bone+defects+in+a+rat+model.">Combining electrical stimulation and tissue engineering to treat large bone defects in a rat model.</a> Scientific Reports. 8 (1), S1 (2018).</li><li>Song, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+direct+current+electric+fields+to+cells+and+tissues+in+vitro+and+modulation+of+wound+electric+field+in+vivo.">Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo.</a> Nature Protocols. 2 (6), 1479-1489 (2007).</li><li>Hronik-Tupaj, M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+responses+of+two-+and+three-dimensional+engineered+tissues+to+electric+fields.">A review of the responses of two- and three-dimensional engineered tissues to electric fields.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 18 (3), 167-180 (2012).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+for+isolation+and+culture+of+mesenchymal+stem+cells+from+mouse+bone+marrow.">An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow.</a> Journal of Orthopaedic Translation. 3 (1), 26-33 (2015).</li><li>Nau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineered+vascularized+periosteal+flap+enriched+with+MSC/EPCs+for+the+treatment+of+large+bone+defects+in+rats.">Tissue engineered vascularized periosteal flap enriched with MSC/EPCs for the treatment of large bone defects in rats.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 907-917 (2017).</li><li>Eischen-Loges, M., Oliveira, K. M. C., Bhavsar, M. B., Barker, J. H., Leppik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretreating+mesenchymal+stem+cells+with+electrical+stimulation+causes+sustained+long-lasting+pro-osteogenic+effects.">Pretreating mesenchymal stem cells with electrical stimulation causes sustained long-lasting pro-osteogenic effects.</a> PeerJ. 6, 4959 (2018).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Curtis, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EF1alpha+and+RPL13a+represent+normalization+genes+suitable+for+RT-qPCR+analysis+of+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells.">EF1alpha and RPL13a represent normalization genes suitable for RT-qPCR analysis of bone marrow derived mesenchymal stem cells.</a> BMC Molecular Biology. 11, 61 (2010).</li><li>Wang, L., Li, Z. -. y., Wang, Y. -. p., Wu, Z. -. h., Yu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Expression+Profiles+of+Marker+Genes+in+Osteogenic+Differentiation+of+Human+Bone+Marrow-derived+Mesenchymal+Stem+Cells.">Dynamic Expression Profiles of Marker Genes in Osteogenic Differentiation of Human Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Chinese Medical Sciences Journal (Chung-kuo i hsueh k'o hsueh tsa chih). 30 (2), 108-113 (2015).</li><li>Kim, H. B., Ahn, S., Jang, H. J., Sim, S. B., Kim, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+corrosion+behaviors+and+surface+profiles+of+platinum-coated+electrodes+by+electrochemistry+and+complementary+microscopy:+biomedical+implications+for+anticancer+therapy.">Evaluation of corrosion behaviors and surface profiles of platinum-coated electrodes by electrochemistry and complementary microscopy: biomedical implications for anticancer therapy.</a> Micron. 38 (7), 747-753 (2007).</li><li>Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+field-induced+migration+and+intercellular+stress+alignment+in+a+collective+epithelial+monolayer.">Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer.</a> Molecular Biology of the Cell. , mbcE18010077 (2018).</li><li>Tai, G., Tai, M., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrically+stimulated+cell+migration+and+its+contribution+to+wound+healing.">Electrically stimulated cell migration and its contribution to wound healing.</a> Burns &amp; Trauma. 6, 20 (2018).</li><li>Love, M. R., Palee, S., Chattipakorn, S. C., Chattipakorn, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+electrical+stimulation+on+cell+proliferation+and+apoptosis.">Effects of electrical stimulation on cell proliferation and apoptosis.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (3), 1860-1876 (2018).</li><li>Adams, D. S., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+principles+for+measuring+resting+membrane+potential+and+ion+concentration+using+fluorescent+bioelectricity+reporters.">General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 385-397 (2012).</li><li>Jin, G., Li, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electrically+conductive+scaffold+as+the+skeleton+of+stem+cell+niche+in+regenerative+medicine.">The electrically conductive scaffold as the skeleton of stem cell niche in regenerative medicine.</a> Materials Science &amp; Engineering. C, Materials for Biological Applications. 45, 671-681 (2014).</li><li>Hronik-Tupaj, M., Rice, W. L., Cronin-Golomb, M., Kaplan, D. L., Georgakoudi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblastic+differentiation+and+stress+response+of+human+mesenchymal+stem+cells+exposed+to+alternating+current+electric+fields.">Osteoblastic differentiation and stress response of human mesenchymal stem cells exposed to alternating current electric fields.</a> Biomedical Engineering Online. 10, 9 (2011).</li></ol>

Qui descriviamo la costruzione di una camera e un metodo per il trattamento di cellule staminali mesenchimali con EStim che si traduce in una maggiore differenziazione osteogenica.
Il setup di EStim presentato non richiede particolare attrezzature/conoscenza e può essere eseguito in un laboratorio di Biologia/biochimica standard sulle cellule staminali dai ricercatori junior. Tuttavia, quando costruire e usare la camera di EStim, è necessario prestare attenzione speciale in pochi passaggi cr...

Un aumento nel trauma e/o difetti ossei malattia-indotta sono stati trattati utilizzando diverse combinazioni di tecnologie di medicina rigenerativa e terapia cellulare. MSCs sono le cellule di scelta in tali trattamenti, a causa della loro attività osteogenica relativamente elevata, isolamento ed espansione efficienza e sicurezza1. Per massimizzare la loro attività osteogenica e, quindi, ottimizzare la loro efficacia terapeutica, sono stati introdotti diversi metodi per manipolare MSCs prima del loro utilizzo in questi trattamenti (come Recensito da Mauney et al.2). Uno di questi metodi è EStim, che ha dimostrato di migliorare la differenziazione osteogenica MSC in vitro3 e promuovere in vivo4di guarigione ossea. Nonostante il numero crescente di studi concentrandosi sul trattamento MSCs con EStim, un regime ottimale per massimizzare l'effetto pro-osteogenico di EStim deve ancora essere definito.
Altri metodi in vitro utilizzando EStim utilizzano sale ponti sommersi nel terreno di coltura, che separa le cellule da elettrodi metallici5. Il vantaggio di questo è che la prestazione EStim tramite ponti sale Elimina l'introduzione di sottoprodotti chimici (ad esempio, la corrosione degli elettrodi metallici) che possono essere citotossici. Nonostante questo vantaggio, sale ponti sono ingombranti per lavorare con ed EStim consegnano differisce da quello consegnato in modelli in vivo, che lo rende difficile da correlare i risultati ottenuti con i due sistemi. Configurazioni che consegnare EStim tramite elettrodi metallici o carbonio fissati all'interno dei pozzi di cultura delle cellule (come Recensito da Hronik-Tupaj e Kaplan6) meglio simulano dispositivi utilizzati in vivo; Tuttavia, questi dispositivi sono difficili da pulire/sterilizzare tra un utilizzo e il numero delle cellule che possono essere studiate per esperimento è limitato. Abbiamo progettato la camera EStim presentata qui appositamente per risolvere le limitazioni di queste altre configurazioni. Mentre la maggior parte della nostra esperienza nell'utilizzo di quest'Aula EStim è stato con 2D e 3D colture contenenti midollo adiposo-tessuto-derivata e MSCs3,4, dei principali vantaggi di questa camera è che è versatile e, con relativamente minori modifiche, può essere adattato per studiare altri tipi di cellule in una varietà di condizioni diverse.
Qui descriviamo la costruzione di un alloggiamento della coltura delle cellule EStim; quindi, dimostriamo l'uso dal servizio MSCs trattante con regimi differenti di EStim e misurando l'effetto risultante sul differenziamento osteogenico. Differenziazione osteogenica MSC è valutata tramite il deposito del calcio, attività della fosfatasi alcalina ed espressione genica osteogenica marcatore. Importante, in passato esperimenti che hanno usato questa configurazione, abbiamo osservato che questi effetti pro-osteogenico persistono lungamente dopo che il trattamento di EStim è stato interrotto.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Estim fabrication</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Banana connector/Jack adaptor</td>
			<td>Poppstars</td>
			<td>1008554</td>
			<td>2 pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutting pliers</td>
			<td>Knipex</td>
			<td>78 03 125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC power supply (0-30V/0-3A)</td>
			<td>B&#38;K Precision</td>
			<td>Model 9130B</td>
			<td>Any simular model could be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulated flexible wires (0.14 mm2)</td>
			<td>Conrad Electronic International</td>
			<td>604794, 604093</td>
			<td>2 pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-corrosive silicone rubber</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3140 RTV</td>
			<td>*could be purchased by many stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Wire (999,5/1000; 1mm &#248;)</td>
			<td>Junker Edelmetalle</td>
			<td>00D-3010</td>
			<td>0.6 m needed for 1 Estim chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol solution</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td>Sterilisation of Estim chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver coated copper wire (0.6 mm &#248;)</td>
			<td>Conrad Electronic International</td>
			<td>409334 - 62</td>
			<td>&#8776;70 cm needed for 1 Estim device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering iron Set</td>
			<td>Conrad Electronic International</td>
			<td>1611410 - 62</td>
			<td>Any simular model could be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP 6-well plate lid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z707759-126EA</td>
			<td>2 lids for Estim chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.2V wired circular LEDs</td>
			<td>Conrad Electronic International</td>
			<td>599525 - 62</td>
			<td>6 pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UHU Super glue</td>
			<td>UHU GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>n/a</td>
			<td>*could be purchased by many stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Glycerophosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td>osteogenic cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>21885025</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td>osteogenic cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Falcon tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,547,004</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td>osteogenic cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague-Dawley (SD) rat mesenchymal stem cells, bone marrow origin</td>
			<td>Cyagen</td>
			<td>RASMX-01001</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell detachment solution</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>cell culture, cell detachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Flask, T75</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833911302</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP 6-well plates</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z707759-126EA</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Dye, 0.4% solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1450021</td>
			<td>cell count</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction and use of an electrical stimulation chamber for enhancing osteogenic differentiation in mesenchymal stem/stromal cells in vitro

Cellule staminali/stromali mesenchimali (MSCs) sono stati ampiamente utilizzate per promuovere la guarigione dell'osso in approcci di ingegneria tissutale. Stimolazione elettrica (EStim) ha dimostrata di aumentare la differenziazione osteogenica MSC in vitro e promuovere nelle regolazioni cliniche di guarigione ossea. Qui descriviamo la costruzione di un alloggiamento della coltura delle cellule EStim e suo uso nel trattamento dell'osso-zucchino-derivate MSC per migliorare la differenziazione osteogenica del ratto. Abbiamo trovato che il trattamento MSCs con EStim per 7 giorni si traduce in un aumento significativo nel differenziamento osteogenico e d'importanza, questo effetto pro-osteogenico persiste a lungo dopo (7 giorni) EStim è interrotto. Questo approccio di pretrattamento MSCs con EStim per migliorare la differenziazione osteogenica potrebbe essere usato per ottimizzare i risultati del trattamento di tessuto osseo e, quindi, di aiutarli a raggiungere il loro potenziale terapeutico completo. Oltre a questa applicazione, questo alloggiamento della coltura delle cellule EStim e protocollo utilizzabile anche per studiare altri comportamenti di cella EStim-sensibili, come la migrazione, la proliferazione, apoptosi e impalcatura allegato.

Per valutare l'effetto di 100 mV/mm di EStim sul differenziamento osteogenico di cellule staminali mesenchimali, cellule trattate con EStim per 3, 7 e 14 giorni o non trattato (controllo) sono stati analizzati al giorno 14 di coltura valutando i cambiamenti morfologici e deposizione di calcio (Figura 2 ). Questo è stato fatto da imaging celle utilizzando la microscopia a campo chiaro (cambiamenti di morfologia) o fissando le cellule in soluzione di paraforma...

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Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

Qui presentiamo un protocollo per la costruzione di un alloggiamento della coltura cellulare progettato per esporre le cellule a vari tipi di stimolazione elettrica e il suo uso nel trattamento di cellule staminali mesenchimali per migliorare la differenziazione osteogenica.

Costruzione e l'uso di una camera di stimolazione elettrica per migliorare la differenziazione osteogenica in cellule mesenchimali staminali/Stromal In Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Qui, mostriamo come costruire una camera di stimolazione elettrica usando le comuni sei piastre di coltura murale, e come usarla per stimolare la differenziazione osteogenica nelle cellule staminali mesenchimali. Questa camera è facile e non costosa da costruire e può essere riutilizzata in più esperimenti. Dopo essere state pretrattate con stimolazione elettrica nella nostra camera, le cellule staminali mesenchimali possono essere utilizzate per migliorare i risultati nei trattamenti di ingegneria del tessuto osseo.Questa camera può anche essere utilizzata per indagare altri tipi di cellule e comportamenti cellulari elettro-sensibili come migrazione, proliferazione, cambiamenti nel potenziale della membrana, apoptosi e attaccamento attento. In un coperchio a sei piastre, segnare e quindi praticare due fori di diametro di un millimetro, distanti 25 millimetri l'uno dall'altro, vicino al bordo esterno di ciascuno dei sei pozzi. Quindi, tagliare un filo di platino in sezioni lunghe 12 cinque centimetri.Piegare manualmente ogni sezione di cinque centimetri in una forma A, lasciando un'estremità lunga tre centimetri e gli altri due centimetri di lunghezza. Quindi, tagliare il filo rivestito d'argento in due lunghezze di 35 centimetri. Inserire l'estremità piegata più lunga di un filo di platino nel foro forato, lasciando uno o due millimetri sporgenti dall'esterno del coperchio.Piegarlo usando le forcep. Successivamente, fissare i fili di platino nei fori del coperchio con colla super conduttiva e lasciarli asciugare per circa sei ore. Per preparare i catodi, saldare le punte di tutti e sei i fili di platino sporgenti dal coperchio a uno dei fili rivestiti in argento.Per preparare gli anodi, saldare i restanti sei fili di platino ad altri fili rivestiti in argento. Successivamente, aggiungere LED nel circuito tra ciascuna delle sei coppie di elettrodi di platino anodico-catodo per confermare la funzionalità. Posizionare un pezzo di nastro isolante nero sotto ogni LED per evitare di esporre le celle nelle piastre di coltura alla luce a LED.Quindi, incollare il connettore del blocco terminale del filo nell'angolo in alto a sinistra del coperchio della piastra a sei pozzi e collegare entrambi i fili rivestiti in argento ai terminali di ingresso. Quindi, tagliare una sezione quadrata di 20 millimetri per 20 millimetri dall'angolo in alto a sinistra di un secondo coperchio a piastre a sei porsi, per ospitare il connettore del blocco terminale sul primo coperchio. Coprire il primo coperchio, dotato degli elettrodi, con il secondo coperchio, e rastrerli insieme al nastro adesivo.Collegare un'estremità dei due fili di rame isolati standard ai terminali di uscita del connettore del filo e l'altra estremità ai connettori maschi di banana. Accendere l'alimentatore premendo il tasto ON-OFF sul pannello frontale. Attivare il canale uno premendo il pulsante uno.Successivamente, premere il pulsante quattro per impostare la tensione. Impostare l'uscita di carico a 2,5 volt. Quindi premere INVIO.Il giorno in cui le cellule vengono trattate con fusto E, sterilizzare gli elettrodi in soluzione di etanolo al 70% per 30 minuti. Quindi, asciugarli sotto la luce UV in un armadio di sicurezza per altri 30 minuti. In una cappa di flusso laminare, coprire la piastra a sei po', contenente i CCC coltivati con il coperchio dotato degli elettrodi, assicurandosi che gli elettrodi siano completamente immersi nel mezzo.Quindi, trasferire la piastra coperta a sei pozzi con le celle all'incubatore e collegare i suoi fili all'alimentatore. Successivamente, impostare l'alimentatore su 2,5 volt di uscita di carico e trattare le cellule con gambo E per un'ora. Dopo la stimolazione, scollegare l'alimentatore e rimuovere la camera dello stelo E dall'incubatore.In condizioni sterili, sostituire il coperchio, dotato di elettrodi, con un coperchio standard a piastre a sei possi bene. Successivamente, riportare le cellule nell'incubatrice e lasciarle durante la notte. Pulire gli elettrodi, prima con PBS e poi con soluzione di etanolo al 70%.Quindi, pulire i prodotti di corrosione accumulati dalla superficie dell'elettrodo con carta vetrata fine. Ripetere il trattamento dello stelo E per sei giorni consecutivi. Il quarto giorno, prima di applicare la stimolazione elettrica, e in condizioni sterili, cambiare il mezzo di coltura aspirando 1,5 millilitri di mezzo e sostituendolo con 1,5 millilitri di mezzo di differenziazione osteogenico fresco preri riscaldato.Dopo aver applicato la stimolazione elettrica per sette giorni consecutivi, mantenere le cellule in coltura per altri sette giorni, scambiando il mezzo ogni tre o quattro giorni. Al termine del trattamento, analizzare i cambiamenti della morfologia cellulare al microscopio. Per valutare l'effetto della stimolazione elettrica sulla differenziazione osteogenica MSC, misurare la deposizione di calcio, l'attività della fosfatasi alcalina e l'espressione genica marcatore osteogenica, come descritto altrove.Per valutare l'effetto di 100 millivolt per millimetro di stimolazione elettrica sulla differenziazione osteogenica MSC, le cellule trattate con stimolazione elettrica per tre, sette e 14 giorni e le cellule non trattate, sono state analizzate al giorno 14 della coltura valutando i cambiamenti morfologici e la deposizione di calcio. Cambiamenti significativi nella morfologia cellulare e nei depositi di calcio sono stati visibili nelle cellule trattate con stimolazione elettrica per sette e 14 giorni. Un'analisi dettagliata dei cambiamenti dell'espressione genica marcatore osteogenica è stata eseguita nei giorni tre, sette e 14 della coltura.Al settimo giorno di coltura, l'espressione runx2 era significativamente più alta nelle cellule trattate con stimolazione elettrica per sette giorni. Mentre l'espressione di Colla1 era significativamente più alta nelle cellule trattate per sette giorni, misurate al giorno 14 della coltura. L'espressione dell'osteopontina è stata significativamente aumentata nelle cellule stimolate elettricamente nei giorni tre, sette e 14 della coltura.L'espressione di Osterix era assente nelle cellule di controllo in tutti i punti di tempo, ed era vista solo a sette e 14 giorni di coltura nelle cellule esposte alla stimolazione elettrica. La camera di stimolazione elettrica è relativamente facile da costruire. Tuttavia, è necessario prestare particolare attenzione quando si maneggiano i fili di platino e anche quando si puliscono e sterilizzano gli elettrodi.Le cellule pretrattate all'elettricità nella nostra camera, sole o seduti su un materiale impalcatura, potrebbero essere impiantate in modelli animali, per studiare come l'effetto positivo della stimolazione elettrica persista in vitro. Questa tecnica fornisce uno strumento semplice ma potente per studiare il meccanismo con cui la stimolazione elettrica regola le funzioni cellulari. Questa conoscenza può essere disponibile nelle cellule di medicina rigenerativa.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Ricerca

Bioingegneria

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Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Migliorata 3D idrogel culture di cellule gliali primari In Vitro modellazione del Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Isolamento di cellule staminali mesenchimali da periostio alveolare umano e gli effetti della vitamina D su attività osteogenica delle cellule derivate dal periostio

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential

Simultanea stimolazione elettrica e meccanica per migliorare il potenziale di cardiomiogenici delle cellule

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Modelli avanzati di fegato 3D per test di genotossicità in vitro a seguito dell'esposizione a lungo termine ai nanomateriali

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling

Nanofili di silicio e stimolazione ottica per indagini sull'accoppiamento elettrico intra e intercellulare

Myofibroblasts can spontaneously internalize silicon nanowires (SiNWs), making them an attractive target for bioelectronic applications. These ...

Simple, Affordable, and Modular Patterning of Cells using DNA

Modellazione semplice, economica e modulare delle cellule utilizzando il DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells ...