Name: construction and use of an electrical stimulation chamber for enhancing osteogenic differentiation in mesenchymal stem/stromal cells in vitro
Uploaded: 2019-01-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro at JoVE.com

Dette arbeidet var støttes delvis av en AO Foundation oppstart stipend (S-14-03 H) og Friedrichsheim Foundation (Stiftung Friedrichsheim) basert i Frankfurt am Main, Tyskland.

1. bygging av elektrisk stimulering celle kultur kammer
<ol><li>For å bygge EStim kammeret, samle to lokkene på standard 6-vel celle kultur platene. 99,99% platina ledninger, 60 cm i lengde med en diameter på 0,5-1 mm; sølv-belagt av kobbertråd, 70 cm i lengde med en diameter på 0,6 mm; Avbitertang; lodding jern kit; en tube superconductive lim; en wire terminalblokken kontakt, seks små 2.2 V lysdioder (valgfritt); en tube med noncorrosive silikon lim coating (valgfritt); en rull med svart elektrisk isolasjon ta...

<ol>
	<li>Oryan, A., Kamali, A., Moshiri, A., Baghaban Eslaminejad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Bone+Regenerative+Medicine:+What+Is+the+Evidence?.">Role of Mesenchymal Stem Cells in Bone Regenerative Medicine: What Is the Evidence?.</a> Cells, Tissues, Organs. 204 (2), 59-83 (2017).</li><li>Mauney, J. R., Volloch, V., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Adult+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Bone+Tissue+Engineering+Applications:+Current+Status+and+Future+Prospects.">Role of Adult Mesenchymal Stem Cells in Bone Tissue Engineering Applications: Current Status and Future Prospects.</a> Tissue Engineering. 11 (5-6), 787-802 (2005).</li><li>Mobini, S., Leppik, L., Thottakkattumana Parameswaran, V., Barker, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+effect+of+direct+current+electrical+stimulation+on+rat+mesenchymal+stem+cells.">In vitro effect of direct current electrical stimulation on rat mesenchymal stem cells.</a> PeerJ. 5, e2821 (2017).</li><li>Leppik, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+electrical+stimulation+and+tissue+engineering+to+treat+large+bone+defects+in+a+rat+model.">Combining electrical stimulation and tissue engineering to treat large bone defects in a rat model.</a> Scientific Reports. 8 (1), S1 (2018).</li><li>Song, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+direct+current+electric+fields+to+cells+and+tissues+in+vitro+and+modulation+of+wound+electric+field+in+vivo.">Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo.</a> Nature Protocols. 2 (6), 1479-1489 (2007).</li><li>Hronik-Tupaj, M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+responses+of+two-+and+three-dimensional+engineered+tissues+to+electric+fields.">A review of the responses of two- and three-dimensional engineered tissues to electric fields.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 18 (3), 167-180 (2012).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+for+isolation+and+culture+of+mesenchymal+stem+cells+from+mouse+bone+marrow.">An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow.</a> Journal of Orthopaedic Translation. 3 (1), 26-33 (2015).</li><li>Nau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineered+vascularized+periosteal+flap+enriched+with+MSC/EPCs+for+the+treatment+of+large+bone+defects+in+rats.">Tissue engineered vascularized periosteal flap enriched with MSC/EPCs for the treatment of large bone defects in rats.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 907-917 (2017).</li><li>Eischen-Loges, M., Oliveira, K. M. C., Bhavsar, M. B., Barker, J. H., Leppik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretreating+mesenchymal+stem+cells+with+electrical+stimulation+causes+sustained+long-lasting+pro-osteogenic+effects.">Pretreating mesenchymal stem cells with electrical stimulation causes sustained long-lasting pro-osteogenic effects.</a> PeerJ. 6, 4959 (2018).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Curtis, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EF1alpha+and+RPL13a+represent+normalization+genes+suitable+for+RT-qPCR+analysis+of+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells.">EF1alpha and RPL13a represent normalization genes suitable for RT-qPCR analysis of bone marrow derived mesenchymal stem cells.</a> BMC Molecular Biology. 11, 61 (2010).</li><li>Wang, L., Li, Z. -. y., Wang, Y. -. p., Wu, Z. -. h., Yu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Expression+Profiles+of+Marker+Genes+in+Osteogenic+Differentiation+of+Human+Bone+Marrow-derived+Mesenchymal+Stem+Cells.">Dynamic Expression Profiles of Marker Genes in Osteogenic Differentiation of Human Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Chinese Medical Sciences Journal (Chung-kuo i hsueh k'o hsueh tsa chih). 30 (2), 108-113 (2015).</li><li>Kim, H. B., Ahn, S., Jang, H. J., Sim, S. B., Kim, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+corrosion+behaviors+and+surface+profiles+of+platinum-coated+electrodes+by+electrochemistry+and+complementary+microscopy:+biomedical+implications+for+anticancer+therapy.">Evaluation of corrosion behaviors and surface profiles of platinum-coated electrodes by electrochemistry and complementary microscopy: biomedical implications for anticancer therapy.</a> Micron. 38 (7), 747-753 (2007).</li><li>Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+field-induced+migration+and+intercellular+stress+alignment+in+a+collective+epithelial+monolayer.">Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer.</a> Molecular Biology of the Cell. , mbcE18010077 (2018).</li><li>Tai, G., Tai, M., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrically+stimulated+cell+migration+and+its+contribution+to+wound+healing.">Electrically stimulated cell migration and its contribution to wound healing.</a> Burns &amp; Trauma. 6, 20 (2018).</li><li>Love, M. R., Palee, S., Chattipakorn, S. C., Chattipakorn, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+electrical+stimulation+on+cell+proliferation+and+apoptosis.">Effects of electrical stimulation on cell proliferation and apoptosis.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (3), 1860-1876 (2018).</li><li>Adams, D. S., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+principles+for+measuring+resting+membrane+potential+and+ion+concentration+using+fluorescent+bioelectricity+reporters.">General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 385-397 (2012).</li><li>Jin, G., Li, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electrically+conductive+scaffold+as+the+skeleton+of+stem+cell+niche+in+regenerative+medicine.">The electrically conductive scaffold as the skeleton of stem cell niche in regenerative medicine.</a> Materials Science &amp; Engineering. C, Materials for Biological Applications. 45, 671-681 (2014).</li><li>Hronik-Tupaj, M., Rice, W. L., Cronin-Golomb, M., Kaplan, D. L., Georgakoudi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblastic+differentiation+and+stress+response+of+human+mesenchymal+stem+cells+exposed+to+alternating+current+electric+fields.">Osteoblastic differentiation and stress response of human mesenchymal stem cells exposed to alternating current electric fields.</a> Biomedical Engineering Online. 10, 9 (2011).</li></ol>

Her beskriver vi byggingen av et kammer og en metode for behandling av mesenchymal stamceller med EStim som gir forbedret osteogenic differensiering.
EStim oppsettet presentert krever ikke spesiell utstyr/kunnskap og kan utføres i et standard stamcelleforskningen biologi/biokjemi laboratorium av junior forskere. Når bygge og bruke EStim kammeret, må imidlertid spesiell omsorg tas i noen viktige skritt. Ved håndtering av platina elektrodene, må ekstra hensyn tas som dette metallet svært f...

En økning i traumer og/eller sykdom-indusert bein mangler behandles med forskjellige kombinasjoner av cellen terapi og regenerativ medisin teknologier. MSCs er cellen valgfrihet i slike behandlinger, grunnet deres relativt høy osteogenic aktivitet, isolasjon og utvidelse effektivitet og sikkerhet1. For å maksimere deres osteogenic aktivitet, og dermed optimalisere terapeutisk effektiviteten, har flere metoder blitt introdusert for å manipulere MSCs før deres bruk i disse behandlingene (som vurderes av Mauney et al.2). En slik metode er EStim, som har vist seg å forbedre MSC osteogenic differensiering i vitro3 og fremme bein healing i vivo4. Til tross for økende antall studier med fokus på behandle MSCs med EStim, en optimale diett for å maksimere Estim's pro-osteogenic effekt på ennå defineres.
Andre i vitro metoder å bruke EStim benytte salt broer nedsenket i kultur medium, som skiller celler fra metallisk elektroder5. Fordelen med dette er at levere EStim gjennom salt broer eliminerer innføring av kjemiske biprodukter (f.eks, korrosjon av metallisk elektroder) som kan være cytotoksisk. Til tross for denne fordelen, salt broer er tungvint å arbeide med, og EStim de skiller seg fra de leveres i i vivo modellene, gjør det vanskelig å korrelere resultater ved å bruke de to systemene. Oppsett som leverer EStim metallisk eller karbon elektroder fast inni cellen kultur brønnene simulere (som vurderes av Hronik-Tupaj og Kaplan6) bedre enheter i vivo; men disse enhetene er vanskelig å rengjøre/sterilisere mellom bruker og antall celler som kan studeres per forsøk er begrenset. Vi har utformet EStim kammeret presenteres her spesielt for å møte begrensningene for disse andre oppsett. Mens de fleste av vår erfaring med denne EStim kammer har vært med 2D og 3D kulturer som inneholder benmarg og liggende under adipose-vev-avledede MSCs3,4, en stor fordel med denne kammer er at det er allsidig, og med mindre relativt endringer kan tilpasses å studere andre celletyper under en rekke ulike forhold.
Her beskriver vi byggingen av en EStim celle kultur kammer; deretter viser vi bruken av behandlende MSCs med forskjellige regimer EStim og måle den resulterende effekten på osteogenic differensiering. MSC osteogenic differensiering vurderes via kalsium deponering, alkalisk fosfatase aktivitet og osteogenic markør genuttrykk. Viktigere, observerte i siste eksperimenter som brukes dette oppsettet, vi at disse pro-osteogenic effektene vedvare lenge etter EStim behandling ble avviklet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Estim fabrication</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Banana connector/Jack adaptor</td>
			<td>Poppstars</td>
			<td>1008554</td>
			<td>2 pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutting pliers</td>
			<td>Knipex</td>
			<td>78 03 125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC power supply (0-30V/0-3A)</td>
			<td>B&#38;K Precision</td>
			<td>Model 9130B</td>
			<td>Any simular model could be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulated flexible wires (0.14 mm2)</td>
			<td>Conrad Electronic International</td>
			<td>604794, 604093</td>
			<td>2 pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-corrosive silicone rubber</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3140 RTV</td>
			<td>*could be purchased by many stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Wire (999,5/1000; 1mm &#248;)</td>
			<td>Junker Edelmetalle</td>
			<td>00D-3010</td>
			<td>0.6 m needed for 1 Estim chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol solution</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td>Sterilisation of Estim chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver coated copper wire (0.6 mm &#248;)</td>
			<td>Conrad Electronic International</td>
			<td>409334 - 62</td>
			<td>&#8776;70 cm needed for 1 Estim device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering iron Set</td>
			<td>Conrad Electronic International</td>
			<td>1611410 - 62</td>
			<td>Any simular model could be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP 6-well plate lid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z707759-126EA</td>
			<td>2 lids for Estim chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.2V wired circular LEDs</td>
			<td>Conrad Electronic International</td>
			<td>599525 - 62</td>
			<td>6 pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UHU Super glue</td>
			<td>UHU GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>n/a</td>
			<td>*could be purchased by many stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Glycerophosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td>osteogenic cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>21885025</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td>osteogenic cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Falcon tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,547,004</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td>osteogenic cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague-Dawley (SD) rat mesenchymal stem cells, bone marrow origin</td>
			<td>Cyagen</td>
			<td>RASMX-01001</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell detachment solution</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>cell culture, cell detachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Flask, T75</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833911302</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP 6-well plates</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z707759-126EA</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Dye, 0.4% solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1450021</td>
			<td>cell count</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction and use of an electrical stimulation chamber for enhancing osteogenic differentiation in mesenchymal stem/stromal cells in vitro

Mesenchymal stammen/stromal celler (MSCs) har blitt brukt mye å fremme bein helbredelse i vev utvikling tilnærminger. Elektrisk stimulering (EStim) har vist seg å øke MSC osteogenic differensiering i vitro og fremme bein i klinisk innstillinger. Beskriver her vi byggingen av en EStim celle kultur kammer og dens bruk i behandling av rotte bein margtransplantasjon-avledet MSC å forbedre osteogenic differensiering. Vi fant at behandle MSCs med EStim for 7 dager resulterer i en betydelig økning i osteogenic differensiering, og viktigst, denne pro-osteogenic effekten fortsetter lenge etter (7 dager) EStim er avviklet. Denne tilnærmingen av pretreating MSCs med EStim å forbedre osteogenic differensiering kan brukes til å optimalisere benvev engineering behandlingsresultatene, og dermed hjelpe dem å oppnå full terapeutiske potensialet. I tillegg til dette programmet, kan denne EStim celle kultur kammer og protokollen også brukes til å undersøke andre EStim-sensitive celle atferd, som overføring, spredning, apoptose og stillaset vedlegg.

For å evaluere effekten av 100 mV/mm av EStim på osteogenic differensiering av MSCs, cellene behandlet med EStim for 3, ble 7 og 14 dager eller nontreated (kontroll) analysert på dag 14 av dyrking av vurdere morfologiske endringer og kalsium deponering (figur 2 ). Dette ble gjort av imaging celler ved hjelp av lys-feltet mikroskopi (morfologi endringer) eller ved å feste cellene i 4% paraformaldehyde løsning, farging dem med 0,02% alizarin rød løsning ...

Watch this Scientific Journal Video about Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro at JoVE.com

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

Her presenterer vi en protokoll for bygging av en celle kultur kammer laget for å avsløre celler til ulike typer elektrisk stimulering, og dens bruk i behandling av mesenchymal stamceller for å forbedre osteogenic differensiering.

Bygging og bruk av en elektrisk stimulering kammer for å styrke Osteogenic differensiering i Mesenchymal Stem/Stromal celler i Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Her viser vi hvordan man bygger et elektrisk stimuleringskammer ved hjelp av vanlige seks veggkulturplater, og hvordan du bruker det for å stimulere osteogen differensiering i mesenchymale stamceller. Dette kammeret er enkelt og ikke dyrt å bygge, og kan gjenbrukes i flere eksperimenter. Etter å ha blitt forhåndsbehandlet med elektrisk stimulering i vårt kammer, kan mesenchymale stamceller brukes til å forbedre resultatene i beinvevstekniske behandlinger.Dette kammeret kan også brukes til å undersøke andre celletyper og elektrosensitiv celleatferd som migrasjon, spredning, endringer i membranpotensialet, apoptose og forsiktig vedlegg. I en seks brønnplate lokk, merke og deretter bore to en millimeter diameter hull, 25 millimeter fra hverandre, nær den ytre kanten av hver av de seks brønnene. Deretter kutter du en platinaledning i 12 fem centimeter lange seksjoner.Bøy hver fem centimeters seksjon manuelt inn i en L"-form, slik at den ene enden er tre centimeter lang, og den andre to centimeter lange. Deretter kutter du den sølvbelagte ledningen i to 35-centimeter lengder. Sett den lengre bøyde enden av en platinatråd inn i det borede hullet, slik at en til to millimeter stikker ut fra utsiden av lokket.Bøy den med tang. Etterpå fester du platinaledningene i lokket hull med super-ledende lim og la dem tørke i ca seks timer. For å forberede katodene, loddete spissene på alle seks platinaledninger som stikker ut fra lokket til en av de sølvbelagte ledningene.For å forberede anodene, lodde de resterende seks platinaledninger til andre sølvbelagte ledninger. Deretter legger du til lysdioder i kretsen mellom hver av de seks anode-katode platina-elektrodeparene for å bekrefte funksjonaliteten. Plasser et stykke svart isolasjonstape under hver LED for å hindre å utsette cellene i kulturplatene for LED-lys.Lim deretter trådklemmeblokkkontakten til øverste venstre hjørne av det seksbrønns platelokket, og koble begge sølvbelagte ledninger til inngangsterminalene. Klipp deretter ut en 20-millimeter med 20 millimeter firkantet seksjon fra øverste venstre hjørne av et annet seksbrønns platelokk, for å imøtekomme klemmeblokkkontakten på det første lokket. Dekk det første lokket, utstyrt med elektrodene, med det andre lokket, og tape dem sammen med tape.Koble den ene enden av de to standardisolerte kobberledningene til utgangsterminalene på trådkontakten, og de andre endene til banan mannlige kontakter. Slå på strømforsyningen ved å trykke på ON-OFF-knappen på frontpanelet. Aktiver kanal én ved å trykke på knapp én.Etterpå trykker du på knapp fire for å stille inn spenningen. Sett lastutgangen på 2,5 volt. Trykk deretter Enter.På dagen cellene behandles med E-stammen, steriliser elektrodene i 70% etanoloppløsning i 30 minutter. Tørk dem deretter under UV-lys i et sikkerhetsskap i ytterligere 30 minutter. I en laminær strømningshette dekker du seksbrønnsplaten som inneholder de kultiverte mscene med lokket utstyrt med elektrodene, og sørger for at elektrodene er helt nedsenket i mediet.Deretter overfører du den dekkede seksbrønnsplaten med celler til inkubatoren og kobler ledningene til strømforsyningen. Deretter setter du strømforsyningen til 2,5 volts lastutgang og behandler cellene med E-stamme i en time. Etter stimulering kobler du fra strømforsyningen og fjerner E-stammekammeret fra inkubatoren.Under sterile forhold, skift ut lokket, utstyrt med elektroder, med en standard seks-brønns platelokk. Deretter returnerer cellene til inkubatoren, og la dem stå over natten. Rengjør elektrodene, først med PBS, og deretter med 70% etanolløsning.Rengjør deretter de akkumulerte korrosjonsproduktene fra elektrodeoverflaten med fint sandpapir. Gjenta E-stammen i seks påfølgende dager. På dag fire, før du bruker elektrisk stimulering, og under sterile forhold, endre kulturmediet ved å aspirere 1,5 milliliter medium og erstatte den med 1,5 milliliter forhåndsoppvarmet, frisk osteogen differensiering medium.Etter å ha brukt elektrisk stimulering i syv påfølgende dager, opprettholde cellene i kultur i ytterligere syv dager, utveksle mediet hver tredje til fire dager. Når behandlingen er fullført, analyser cellemorfologiendringene under et mikroskop. For å vurdere effekten av elektrisk stimulering på MSC osteogen differensiering, måle kalsium deponering, alkalisk fosfatase aktivitet, og osteogen markør genuttrykk, som beskrevet andre steder.For å evaluere effekten av 100 millivolt per millimeter elektrisk stimulering på MSC osteogen differensiering, ble celler behandlet med elektrisk stimulering i tre, syv og 14 dager og ikke-behandlede celler analysert på dag 14 av kulturen ved å vurdere morfologiske endringer og kalsiumavsetning. Signifikante endringer i cellemorfologi og kalsiumavleiringer var synlige i celler behandlet med elektrisk stimulering i syv og 14 dager. En detaljert analyse av osteogene markørgenuttrykksendringer ble utført på dag tre, syv og 14 av kulturen.På dag sju av kulturen var RunX2-uttrykket betydelig høyere i celler behandlet med elektrisk stimulering i syv dager. Mens Colla1-uttrykket var signifikant høyere i celler behandlet i syv dager, målt på dag 14 av kultur. Uttrykket for osteopontin ble betydelig økt i elektrisk stimulerte celler på dag tre, syv og 14 av kultur.Osterix uttrykk var fraværende i kontrollceller til enhver tid, og ble sett bare på syv og 14 dager med kultur i celler utsatt for elektrisk stimulering. Det elektriske stimuleringskammeret er relativt enkelt å bygge. Det må imidlertid tas spesiell forsiktighet ved håndtering av platinaledningene, og også ved rengjøring og sterilisering av elektrodene.Celler som er forhåndsbehandlet på elektrisitet i vårt kammer, alene eller sitter på et stillasmateriale, kan implanteres i dyremodeller, for å studere hvordan den positive effekten av elektrisk stimulering vedvarer in vitro. Denne teknikken gir et enkelt, men kraftig verktøy for å studere mekanismen som elektrisk stimulering regulerer cellefunksjoner. Denne kunnskapen kan være tilgjengelig i regenerative medisinceller.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Engineering skjelettmuskulatur vev fra Murine Myoblast stamceller og anvendelse av elektrisk stimulering

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Øyeirritasjonstest (EIT) for fareidentifikasjon for Eye irriterende kjemikalier som bruker Rekonstruert Menneskelig Hornhinnen lignende Epithelial (RHCE) Tissue Modell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

Polyelektrolytkompleks for Heparin Binding Domain osteogene Growth Factor Levering

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

en<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modell av Murine mellomvirvelskive

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Forbedret 3D Hydrogel kulturer av primære gliacellene for In Vitro modellering av Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Isolering av Mesenchymal stamceller fra menneskelige Alveolar Periosteum og effekter av Vitamin D på Osteogenic aktivitet i Periosteum-avledet celler

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential

Samtidige elektro og mekanisk stimulering å øke cellenes Cardiomyogenic potensial

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Avanserte 3D levermodeller for in vitro gentoksisitetstesting etter langvarig nanomaterialeeksponering

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling

Silisium nanoledninger og optisk stimulering for undersøkelser av intra- og intercellulær elektrisk kobling

Myofibroblasts can spontaneously internalize silicon nanowires (SiNWs), making them an attractive target for bioelectronic applications. These ...

Simple, Affordable, and Modular Patterning of Cells using DNA

Enkel, rimelig og modulær mønster av celler ved hjelp av DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells ...