Name: construction and use of an electrical stimulation chamber for enhancing osteogenic differentiation in mesenchymal stem/stromal cells in vitro
Uploaded: 2019-01-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro at JoVE.com

Este trabalho foi financiado em parte por uma concessão de start-up AO Foundation (S-14-03 H) e a Fundação Friedrichsheim (Stiftung Friedrichsheim) com sede em Frankfurt am Main, Alemanha.

1. construção da câmara de cultura de células de estimulação elétrica
<ol><li>Para construir a câmara EStim, coletar duas tampas das placas de cultura padrão 6-poços de célula; fio de 99,99% de platina, 60 cm de comprimento com um diâmetro de 0,5 a 1 mm; fio de cobre revestido de prata, 70 cm de comprimento com um diâmetro de 0,6 mm; alicate de corte; kit de ferro de soldar; um tubo de cola supercondutor; conector de bloco de terminais de um fio, seis pequenos 2,2 V diodos emissores de luz (opcional); um t...

<ol>
	<li>Oryan, A., Kamali, A., Moshiri, A., Baghaban Eslaminejad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Bone+Regenerative+Medicine:+What+Is+the+Evidence?.">Role of Mesenchymal Stem Cells in Bone Regenerative Medicine: What Is the Evidence?.</a> Cells, Tissues, Organs. 204 (2), 59-83 (2017).</li><li>Mauney, J. R., Volloch, V., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Adult+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Bone+Tissue+Engineering+Applications:+Current+Status+and+Future+Prospects.">Role of Adult Mesenchymal Stem Cells in Bone Tissue Engineering Applications: Current Status and Future Prospects.</a> Tissue Engineering. 11 (5-6), 787-802 (2005).</li><li>Mobini, S., Leppik, L., Thottakkattumana Parameswaran, V., Barker, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+effect+of+direct+current+electrical+stimulation+on+rat+mesenchymal+stem+cells.">In vitro effect of direct current electrical stimulation on rat mesenchymal stem cells.</a> PeerJ. 5, e2821 (2017).</li><li>Leppik, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+electrical+stimulation+and+tissue+engineering+to+treat+large+bone+defects+in+a+rat+model.">Combining electrical stimulation and tissue engineering to treat large bone defects in a rat model.</a> Scientific Reports. 8 (1), S1 (2018).</li><li>Song, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+direct+current+electric+fields+to+cells+and+tissues+in+vitro+and+modulation+of+wound+electric+field+in+vivo.">Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo.</a> Nature Protocols. 2 (6), 1479-1489 (2007).</li><li>Hronik-Tupaj, M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+responses+of+two-+and+three-dimensional+engineered+tissues+to+electric+fields.">A review of the responses of two- and three-dimensional engineered tissues to electric fields.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 18 (3), 167-180 (2012).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+for+isolation+and+culture+of+mesenchymal+stem+cells+from+mouse+bone+marrow.">An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow.</a> Journal of Orthopaedic Translation. 3 (1), 26-33 (2015).</li><li>Nau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineered+vascularized+periosteal+flap+enriched+with+MSC/EPCs+for+the+treatment+of+large+bone+defects+in+rats.">Tissue engineered vascularized periosteal flap enriched with MSC/EPCs for the treatment of large bone defects in rats.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 907-917 (2017).</li><li>Eischen-Loges, M., Oliveira, K. M. C., Bhavsar, M. B., Barker, J. H., Leppik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretreating+mesenchymal+stem+cells+with+electrical+stimulation+causes+sustained+long-lasting+pro-osteogenic+effects.">Pretreating mesenchymal stem cells with electrical stimulation causes sustained long-lasting pro-osteogenic effects.</a> PeerJ. 6, 4959 (2018).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Curtis, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EF1alpha+and+RPL13a+represent+normalization+genes+suitable+for+RT-qPCR+analysis+of+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells.">EF1alpha and RPL13a represent normalization genes suitable for RT-qPCR analysis of bone marrow derived mesenchymal stem cells.</a> BMC Molecular Biology. 11, 61 (2010).</li><li>Wang, L., Li, Z. -. y., Wang, Y. -. p., Wu, Z. -. h., Yu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Expression+Profiles+of+Marker+Genes+in+Osteogenic+Differentiation+of+Human+Bone+Marrow-derived+Mesenchymal+Stem+Cells.">Dynamic Expression Profiles of Marker Genes in Osteogenic Differentiation of Human Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Chinese Medical Sciences Journal (Chung-kuo i hsueh k'o hsueh tsa chih). 30 (2), 108-113 (2015).</li><li>Kim, H. B., Ahn, S., Jang, H. J., Sim, S. B., Kim, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+corrosion+behaviors+and+surface+profiles+of+platinum-coated+electrodes+by+electrochemistry+and+complementary+microscopy:+biomedical+implications+for+anticancer+therapy.">Evaluation of corrosion behaviors and surface profiles of platinum-coated electrodes by electrochemistry and complementary microscopy: biomedical implications for anticancer therapy.</a> Micron. 38 (7), 747-753 (2007).</li><li>Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+field-induced+migration+and+intercellular+stress+alignment+in+a+collective+epithelial+monolayer.">Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer.</a> Molecular Biology of the Cell. , mbcE18010077 (2018).</li><li>Tai, G., Tai, M., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrically+stimulated+cell+migration+and+its+contribution+to+wound+healing.">Electrically stimulated cell migration and its contribution to wound healing.</a> Burns &amp; Trauma. 6, 20 (2018).</li><li>Love, M. R., Palee, S., Chattipakorn, S. C., Chattipakorn, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+electrical+stimulation+on+cell+proliferation+and+apoptosis.">Effects of electrical stimulation on cell proliferation and apoptosis.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (3), 1860-1876 (2018).</li><li>Adams, D. S., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+principles+for+measuring+resting+membrane+potential+and+ion+concentration+using+fluorescent+bioelectricity+reporters.">General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 385-397 (2012).</li><li>Jin, G., Li, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electrically+conductive+scaffold+as+the+skeleton+of+stem+cell+niche+in+regenerative+medicine.">The electrically conductive scaffold as the skeleton of stem cell niche in regenerative medicine.</a> Materials Science &amp; Engineering. C, Materials for Biological Applications. 45, 671-681 (2014).</li><li>Hronik-Tupaj, M., Rice, W. L., Cronin-Golomb, M., Kaplan, D. L., Georgakoudi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblastic+differentiation+and+stress+response+of+human+mesenchymal+stem+cells+exposed+to+alternating+current+electric+fields.">Osteoblastic differentiation and stress response of human mesenchymal stem cells exposed to alternating current electric fields.</a> Biomedical Engineering Online. 10, 9 (2011).</li></ol>

Aqui descrevemos a construção de uma câmara e um método para o tratamento de células-tronco mesenquimais com EStim que resulta em maior diferenciação osteogênica.
A configuração de EStim apresentada não requer equipamentos especial/conhecimento e pode ser realizada em um laboratório de biologia/bioquímica de células-tronco padrão por pesquisadores Júnior. No entanto, quando compilando e usando a câmara EStim, especial deve ter cuidado em algumas etapas críticas. Ao manusear o...

Um aumento no trauma e/ou defeitos ósseos induzida por doença estão sendo tratados usando diferentes combinações de terapia celular e tecnologias de medicina regenerativa. MSCs são a célula de escolha em tais tratamentos, devido à sua relativamente alta atividade osteogênica, isolamento e expansão de eficiência e segurança1. Para maximizar sua atividade osteogênica e, assim, otimizar sua eficácia terapêutica, foram introduzidos vários métodos para manipular MSCs antes da sua utilização nestes tratamentos (como comentado por Mauney et al.2). Um tal método é EStim, que foi mostrado para aumentar a diferenciação osteogênica do MSC em vitro3 e promover a consolidação em vivo4. Apesar do crescente número de estudos com foco em tratamento MSCs com EStim, um regime ideal para maximizar o efeito de pro-osteogênica do EStim ainda tem de ser definido.
Outros métodos in vitro usando EStim utilizam sal pontes submergidas em meio de cultura, que separa as células dos eletrodos metálicos5. A vantagem desta é que entregar EStim através de pontes de sal elimina a introdução de subprodutos químicos (por exemplo, corrosão dos eletrodos metálicos) que podem ser citotóxicos. Apesar desta vantagem, pontes de sal são complicados para trabalhar com, e entregam a EStim difere que entregue em modelos in vivo, tornando difícil correlacionar os resultados obtidos ao utilizar os dois sistemas. Configurações que entregam EStim via eletrodos metálicos ou carbono fixados dentro dos poços de cultura celular (como revisto por Hronik-Tupaj e Kaplan6) melhor simulam dispositivos utilizados no vivo; no entanto, esses dispositivos são difíceis de limpar/esterilizar entre usos e o número de células que podem ser estudadas por experiência é limitado. Nós projetamos a câmara EStim apresentada aqui especificamente para resolver as limitações destas outras configurações. Enquanto a maioria da nossa experiência usando esta câmara EStim foi com 2D e 3D culturas contendo medula óssea e adiposo tecido-derivada de MSCs3,4, a principal vantagem desta câmara é que é versátil e, com menor relativamente alterações, pode ser adaptado para outros tipos de células sob uma variedade de diferentes condições de estudar.
Aqui descrevemos a construção de uma câmara de cultura de células de EStim; Então, vamos demonstrar a sua utilização por tratados MSCs com diferentes regimes de EStim e medir o efeito resultante na diferenciação osteogênica. Diferenciação osteogênica MSC é avaliada através de deposição de cálcio, atividade da fosfatase alcalina e expressão de gene marcador osteogênica. Importante, no passado experiências que usou esta configuração, observou-se que estes efeitos pro-osteogênica persistirem muito tempo depois foi descontinuado o tratamento de EStim.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Estim fabrication</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Banana connector/Jack adaptor</td>
			<td>Poppstars</td>
			<td>1008554</td>
			<td>2 pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutting pliers</td>
			<td>Knipex</td>
			<td>78 03 125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC power supply (0-30V/0-3A)</td>
			<td>B&#38;K Precision</td>
			<td>Model 9130B</td>
			<td>Any simular model could be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulated flexible wires (0.14 mm2)</td>
			<td>Conrad Electronic International</td>
			<td>604794, 604093</td>
			<td>2 pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-corrosive silicone rubber</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3140 RTV</td>
			<td>*could be purchased by many stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Wire (999,5/1000; 1mm &#248;)</td>
			<td>Junker Edelmetalle</td>
			<td>00D-3010</td>
			<td>0.6 m needed for 1 Estim chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol solution</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td>Sterilisation of Estim chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver coated copper wire (0.6 mm &#248;)</td>
			<td>Conrad Electronic International</td>
			<td>409334 - 62</td>
			<td>&#8776;70 cm needed for 1 Estim device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering iron Set</td>
			<td>Conrad Electronic International</td>
			<td>1611410 - 62</td>
			<td>Any simular model could be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP 6-well plate lid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z707759-126EA</td>
			<td>2 lids for Estim chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.2V wired circular LEDs</td>
			<td>Conrad Electronic International</td>
			<td>599525 - 62</td>
			<td>6 pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UHU Super glue</td>
			<td>UHU GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>n/a</td>
			<td>*could be purchased by many stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Glycerophosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td>osteogenic cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>21885025</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td>osteogenic cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Falcon tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,547,004</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td>osteogenic cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague-Dawley (SD) rat mesenchymal stem cells, bone marrow origin</td>
			<td>Cyagen</td>
			<td>RASMX-01001</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell detachment solution</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>cell culture, cell detachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Flask, T75</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833911302</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP 6-well plates</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z707759-126EA</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Dye, 0.4% solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1450021</td>
			<td>cell count</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction and use of an electrical stimulation chamber for enhancing osteogenic differentiation in mesenchymal stem/stromal cells in vitro

Células tronco mesenquimais/estromal (MSCs) têm sido amplamente utilizadas para promover a consolidação óssea em abordagens de engenharia de tecidos. Estimulação elétrica (EStim) tem demonstrada aumentar a diferenciação osteogênica de MSC in vitro e promover a consolidação óssea em situações clínicas. Aqui descrevemos a construção de uma câmara de cultura de células de EStim... e sua utilização no tratamento de rato osso-medula-derivado MSC para realçar a diferenciação osteogênica. Descobrimos que tratar MSCs com EStim durante 7 dias resulta em um aumento significativo na diferenciação osteogênica, e importante, este efeito pro-osteogênica persiste muito tempo depois (7 dias) EStim é descontinuado. Esta abordagem de pretreating MSCs com EStim para realçar a diferenciação osteogênica poderia ser usada para otimizar os resultados do tratamento de engenharia de tecido ósseo e, assim, ajudá-los a alcançar o seu potencial terapêutico completo. Além desta aplicação, esta câmara de cultura de células de EStim e protocolo também podem ser usados para investigar outros comportamentos de célula EStim-sensíveis, tais como a migração, proliferação, apoptose e acessório do andaime.

Para avaliar o efeito de 100 mV/mm de EStim na diferenciação osteogênica do MSCs, células tratadas com EStim para 3, 7 e 14 dias ou folhas (controle) foram analisados no dia 14 de cultivo avaliando alterações morfológicas e deposição de cálcio (Figura 2 ). Isto foi feito por imagem de células usando microscopia de campo claro (alterações de morfologia) ou pela fixação de células em solução de paraformaldeído 4%, manchando-os com solução d...

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Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

Aqui nós apresentamos um protocolo para a construção de uma câmara de cultura celular projetada para expor as células de vários tipos de estimulação elétrica e sua utilização no tratamento de células-tronco mesenquimais para realçar a diferenciação osteogênica.

Construção e utilização de uma câmara de estimulação elétrica para reforçar a diferenciação osteogênica em células estromais/tronco mesenquimais em Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Aqui, mostramos como construir uma câmara de estimulação elétrica usando seis placas comuns de cultura de parede, e como usá-la para estimular a diferenciação osteogênica em células-tronco mesenquimais. Esta câmara é fácil e não é cara de construir, e pode ser reutilizada em múltiplos experimentos. Depois de serem pré-tratadas com estimulação elétrica em nossa câmara, as células-tronco mesenquimais podem ser usadas para melhorar os resultados em tratamentos de engenharia de tecidos ósseos.Esta câmara também pode ser usada para investigar outros tipos de células e comportamentos celulares eletro-sensíveis, como migração, proliferação, alterações no potencial da membrana, apoptose e apego cuidadoso. Em uma tampa de placa de seis poços, marque e, em seguida, faça dois furos de um milímetro de diâmetro, 25 milímetros de distância, perto da borda externa de cada um dos seis poços. Em seguida, corte um fio de platina em seções de 12 centímetros de comprimento.Dobre manualmente cada seção de cinco centímetros em uma forma L, deixando uma extremidade de três centímetros de comprimento, e a outra de dois centímetros de comprimento. Em seguida, corte o fio revestido de prata em dois comprimentos de 35 centímetros. Insira a extremidade mais longa e dobrada de um fio de platina no orifício perfurado, deixando de um a dois milímetros salientes do lado de fora da tampa.Dobre-o usando fórceps. Depois, fixe os fios de platina nos orifícios da tampa com cola super condutora e deixe-os secar por aproximadamente seis horas. Para preparar os cátodos, solde as pontas de todos os seis fios de platina que se projetam da tampa para um dos fios revestidos de prata.Para preparar os ânodos, solde os seis fios de platina restantes para outros fios revestidos de prata. Posteriormente, adicione LEDs no circuito entre cada um dos seis pares de eletrodos de platina de ânodo-cátodo para confirmar a funcionalidade. Coloque um pedaço de fita de isolamento preto sob cada LED para evitar expor as células nas placas de cultura à luz LED.Em seguida, cole o conector do bloco do terminal de arame no canto superior esquerdo da tampa da placa de seis poços, e conecte ambos os fios revestidos de prata aos terminais de entrada. Em seguida, corte uma seção quadrada de 20 milímetros por 20 milímetros do canto superior esquerdo de uma segunda tampa de placa de seis poços, para acomodar o conector do bloco terminal na primeira tampa. Cubra a primeira tampa, equipada com os eletrodos, com a segunda tampa, e tape-as junto com fita adesiva.Conecte uma extremidade dos dois fios de cobre isolados padrão aos terminais de saída do conector do fio, e a outra extremidades aos conectores machos de banana. Ligue a fonte de alimentação pressionando o botão ON-OFF no painel frontal. Ative o canal um pressionando o botão um.Depois, pressione o botão quatro para definir a tensão. Defina a saída de carga em 2,5 volts. Em seguida, pressione Enter.No dia em que as células são tratadas com haste E, esterilizar os eletrodos em solução de 70% de etanol por 30 minutos. Em seguida, seque-os sob luz UV em um gabinete de segurança por mais 30 minutos. Em uma capa de fluxo laminar, cubra a placa de seis poços contendo os MSCs cultivados com a tampa equipada com os eletrodos, certificando-se de que os eletrodos estão completamente submersos no meio.Em seguida, transfira a placa coberta de seis poços com células para a incubadora e conecte seus fios à fonte de alimentação. Em seguida, defina a fonte de alimentação para a saída de carga de 2,5 volts e trate as células com haste E por uma hora. Após a estimulação, desconecte a fonte de alimentação e remova a câmara de haste E da incubadora.Em condições estéreis, substitua a tampa, equipada com eletrodos, por uma tampa de placa padrão de seis poços. Posteriormente, devolva as células à incubadora e deixe-as durante a noite. Limpe os eletrodos, primeiro com PBS, e depois com solução de 70% de etanol.Em seguida, limpe os produtos de corrosão acumulados da superfície do eletrodo com lixa fina. Repita o tratamento de haste E por seis dias consecutivos. No quarto dia, antes de aplicar estimulação elétrica, e em condições estéreis, mude o meio de cultura aspirando 1,5 mililitros de médio e substituindo-o por 1,5 mililitros de meio de diferenciação osteogênica pré-aquecido e fresco.Após a aplicação de estimulação elétrica por sete dias consecutivos, mantenha as células na cultura por mais sete dias, trocando o meio a cada três ou quatro dias. Quando o tratamento for concluído, analise as alterações da morfologia celular sob um microscópio. Para avaliar o efeito da estimulação elétrica na diferenciação osteogênica do MSC, meça a deposição de cálcio, a atividade alcalina de fosfattase e a expressão genética do marcador osteogênico, como descrito em outros lugares.Para avaliar o efeito de 100 milivolts por milímetro de estimulação elétrica na diferenciação osteogênica do MSC, as células tratadas com estimulação elétrica durante três, sete e 14 dias e células não tratadas foram analisadas no dia 14 da cultura, avaliando alterações morfológicas e deposição de cálcio. Mudanças significativas na morfologia celular e depósitos de cálcio foram visíveis em células tratadas com estimulação elétrica durante sete e 14 dias. Uma análise detalhada das alterações de expressão genética do marcador osteogênico foi realizada nos dias três, sete e 14 da cultura.No sétimo dia de cultura, a expressão RunX2 foi significativamente maior em células tratadas com estimulação elétrica durante sete dias. Considerando que a expressão colla1 foi significativamente maior nas células tratadas durante sete dias, medida no dia 14 da cultura. A expressão da osteopontina aumentou significativamente em células eletricamente estimuladas nos dias três, sete e 14 da cultura.A expressão otérix estava ausente nas células de controle em todos os pontos de tempo, e era vista apenas aos sete e 14 dias de cultura em células expostas à estimulação elétrica. A câmara de estimulação elétrica é relativamente fácil de construir. No entanto, deve-se tomar cuidado especial ao manusear os fios de platina, e também ao limpar e esterilizar os eletrodos.Células pré-tratadas com eletricidade em nossa câmara, sozinhas ou sentadas em um material de andaime, poderiam ser implantadas em modelos animais, para estudar como o efeito positivo da estimulação elétrica persiste in vitro. Esta técnica fornece uma ferramenta simples, mas poderosa, para estudar o mecanismo pelo qual a estimulação elétrica regula as funções celulares. Esse conhecimento pode estar disponível em células medicinais regenerativas.

Research

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Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential

Estimulação simultânea de elétrica e mecânica para aumentar o potencial de Cardiomyogenic das células

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Modelos avançados de fígado 3D para testes de genotoxicidade in vitro após exposição nanomaterial de longo prazo

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling

Nanofios de Silício e Estimulação Óptica para Investigações de Acoplamento Elétrico Intra e Intercelular

Myofibroblasts can spontaneously internalize silicon nanowires (SiNWs), making them an attractive target for bioelectronic applications. These ...

Simple, Affordable, and Modular Patterning of Cells using DNA

Padronização simples, acessível e modular de células usando DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells ...