Name: construction and use of an electrical stimulation chamber for enhancing osteogenic differentiation in mesenchymal stem/stromal cells in vitro
Uploaded: 2019-01-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro at JoVE.com

Este trabajo fue financiado en parte por una subvención de puesta en marcha de la Fundación AO (S-14-03 H) y la Fundación de Friedrichsheim (Stiftung Friedrichsheim) con sede en Fráncfort del Meno, Alemania.

1. construcción del compartimiento de la cultura de la estimulación eléctrica de la célula
<ol><li>Para construir la cámara EStim, recoger dos tapas de placas de cultivo estándar celular 6-bien; cable 99.99% platino, 60 cm de longitud con un diámetro de 0,5 a 1 mm; alambre de cobre recubierto de plata, 70 cm de longitud con un diámetro de 0,6 mm; alicates de corte; kit de soldador; un tubo de pegamento superconductor; conector del bloque de terminal de un cable, pequeño seis 2,2 V LED (opcional); un tubo de pe...

<ol>
	<li>Oryan, A., Kamali, A., Moshiri, A., Baghaban Eslaminejad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Bone+Regenerative+Medicine:+What+Is+the+Evidence?.">Role of Mesenchymal Stem Cells in Bone Regenerative Medicine: What Is the Evidence?.</a> Cells, Tissues, Organs. 204 (2), 59-83 (2017).</li><li>Mauney, J. R., Volloch, V., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Adult+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Bone+Tissue+Engineering+Applications:+Current+Status+and+Future+Prospects.">Role of Adult Mesenchymal Stem Cells in Bone Tissue Engineering Applications: Current Status and Future Prospects.</a> Tissue Engineering. 11 (5-6), 787-802 (2005).</li><li>Mobini, S., Leppik, L., Thottakkattumana Parameswaran, V., Barker, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+effect+of+direct+current+electrical+stimulation+on+rat+mesenchymal+stem+cells.">In vitro effect of direct current electrical stimulation on rat mesenchymal stem cells.</a> PeerJ. 5, e2821 (2017).</li><li>Leppik, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+electrical+stimulation+and+tissue+engineering+to+treat+large+bone+defects+in+a+rat+model.">Combining electrical stimulation and tissue engineering to treat large bone defects in a rat model.</a> Scientific Reports. 8 (1), S1 (2018).</li><li>Song, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+direct+current+electric+fields+to+cells+and+tissues+in+vitro+and+modulation+of+wound+electric+field+in+vivo.">Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo.</a> Nature Protocols. 2 (6), 1479-1489 (2007).</li><li>Hronik-Tupaj, M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+responses+of+two-+and+three-dimensional+engineered+tissues+to+electric+fields.">A review of the responses of two- and three-dimensional engineered tissues to electric fields.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 18 (3), 167-180 (2012).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+for+isolation+and+culture+of+mesenchymal+stem+cells+from+mouse+bone+marrow.">An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow.</a> Journal of Orthopaedic Translation. 3 (1), 26-33 (2015).</li><li>Nau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineered+vascularized+periosteal+flap+enriched+with+MSC/EPCs+for+the+treatment+of+large+bone+defects+in+rats.">Tissue engineered vascularized periosteal flap enriched with MSC/EPCs for the treatment of large bone defects in rats.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 907-917 (2017).</li><li>Eischen-Loges, M., Oliveira, K. M. C., Bhavsar, M. B., Barker, J. H., Leppik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretreating+mesenchymal+stem+cells+with+electrical+stimulation+causes+sustained+long-lasting+pro-osteogenic+effects.">Pretreating mesenchymal stem cells with electrical stimulation causes sustained long-lasting pro-osteogenic effects.</a> PeerJ. 6, 4959 (2018).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Curtis, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EF1alpha+and+RPL13a+represent+normalization+genes+suitable+for+RT-qPCR+analysis+of+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells.">EF1alpha and RPL13a represent normalization genes suitable for RT-qPCR analysis of bone marrow derived mesenchymal stem cells.</a> BMC Molecular Biology. 11, 61 (2010).</li><li>Wang, L., Li, Z. -. y., Wang, Y. -. p., Wu, Z. -. h., Yu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Expression+Profiles+of+Marker+Genes+in+Osteogenic+Differentiation+of+Human+Bone+Marrow-derived+Mesenchymal+Stem+Cells.">Dynamic Expression Profiles of Marker Genes in Osteogenic Differentiation of Human Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Chinese Medical Sciences Journal (Chung-kuo i hsueh k'o hsueh tsa chih). 30 (2), 108-113 (2015).</li><li>Kim, H. B., Ahn, S., Jang, H. J., Sim, S. B., Kim, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+corrosion+behaviors+and+surface+profiles+of+platinum-coated+electrodes+by+electrochemistry+and+complementary+microscopy:+biomedical+implications+for+anticancer+therapy.">Evaluation of corrosion behaviors and surface profiles of platinum-coated electrodes by electrochemistry and complementary microscopy: biomedical implications for anticancer therapy.</a> Micron. 38 (7), 747-753 (2007).</li><li>Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+field-induced+migration+and+intercellular+stress+alignment+in+a+collective+epithelial+monolayer.">Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer.</a> Molecular Biology of the Cell. , mbcE18010077 (2018).</li><li>Tai, G., Tai, M., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrically+stimulated+cell+migration+and+its+contribution+to+wound+healing.">Electrically stimulated cell migration and its contribution to wound healing.</a> Burns &amp; Trauma. 6, 20 (2018).</li><li>Love, M. R., Palee, S., Chattipakorn, S. C., Chattipakorn, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+electrical+stimulation+on+cell+proliferation+and+apoptosis.">Effects of electrical stimulation on cell proliferation and apoptosis.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (3), 1860-1876 (2018).</li><li>Adams, D. S., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+principles+for+measuring+resting+membrane+potential+and+ion+concentration+using+fluorescent+bioelectricity+reporters.">General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 385-397 (2012).</li><li>Jin, G., Li, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electrically+conductive+scaffold+as+the+skeleton+of+stem+cell+niche+in+regenerative+medicine.">The electrically conductive scaffold as the skeleton of stem cell niche in regenerative medicine.</a> Materials Science &amp; Engineering. C, Materials for Biological Applications. 45, 671-681 (2014).</li><li>Hronik-Tupaj, M., Rice, W. L., Cronin-Golomb, M., Kaplan, D. L., Georgakoudi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblastic+differentiation+and+stress+response+of+human+mesenchymal+stem+cells+exposed+to+alternating+current+electric+fields.">Osteoblastic differentiation and stress response of human mesenchymal stem cells exposed to alternating current electric fields.</a> Biomedical Engineering Online. 10, 9 (2011).</li></ol>

Aquí describimos la construcción de una cámara y un método para el tratamiento de células madre mesenquimales con EStim que se traduce en mayor diferenciación osteogénica.
La configuración de EStim presentada no requiere equipo especial/conocimientos y se puede realizar en un laboratorio de Biología/Bioquímica de la célula de vástago estándar por jóvenes investigadores. Sin embargo, al construir y utilizar la cámara EStim, especial debe tener cuidado en algunos pasos críticos. ...

Un aumento de traumas o defectos óseos inducidos por la enfermedad son tratados con diferentes combinaciones de tecnologías de la medicina regenerativa y terapia celular. MSCs son la célula de elección en estos tratamientos, debido a su relativamente alta actividad osteogénica, aislamiento y eficiencia de expansión y seguridad1. Para maximizar su actividad osteogénica y, así, optimizar su eficacia terapéutica, se han introducido varios métodos para manipular MSCs antes de su uso en estos tratamientos (ya revisado por Mauney et al.2). Un tal método es EStim, que se ha demostrado para mejorar la diferenciación osteogénica de MSC en vitro3 y promover hueso curativo en vivo4. A pesar del creciente número de estudios centrados en el tratamiento de MSCs con EStim, un régimen óptimo para maximizar el efecto pro-osteogénica de EStim todavía tiene que definirse.
Otros métodos in vitro utilizando EStim utilizan puentes de sal sumergidos en el medio de cultivo, que separa las células de electrodos metálicos5. La ventaja es que entrega EStim a través de puentes de sal elimina la introducción de subproductos químicos (por ejemplo, corrosión de los electrodos metálicos) que pueden ser citotóxicos. A pesar de esta ventaja, puentes de sal son engorrosos para trabajar con, y EStim que difiere de la que en los modelos in vivo, lo que es difícil correlacionar los resultados obtenidos al utilizar los dos sistemas. Configuraciones que EStim vía los electrodos metálicos o carbono fijados dentro de los pozos de la cultura de célula (ya revisado por Tupaj Hronik y Kaplan6) simulan mejor los dispositivos usados en vivo; sin embargo, estos dispositivos son difíciles de limpiar/esterilizar entre los usos y el número de células que pueden ser estudiados por experimento está limitado. Diseñamos la cámara EStim presentada específicamente para hacer frente a las limitaciones de estas otras configuraciones. Aunque la mayor parte de nuestra experiencia con esta cámara EStim ha sido con 2D y 3D culturas que contiene médula ósea adiposo-tejido-derivadas y MSCs3,4, una gran ventaja de esta cámara es es versátil y, con relativamente menores cambios, pueden ser adaptados a otros tipos celulares bajo una variedad de diferentes condiciones de estudio.
Aquí describimos la construcción de una sala de cultura de célula EStim; Luego, se demuestra su uso por MSCs tratando con diferentes regímenes de EStim y medir el efecto resultante sobre la diferenciación osteogénica. Diferenciación osteogénica MSC es evaluada a través de la deposición de calcio, actividad de la fosfatasa alcalina y expresión génica de marcadores osteogénicos. Lo importante, más allá de experimentos que utilizan esta configuración, observamos que estos efectos pro-osteogénica persisten mucho después de que se suspendió el tratamiento de EStim.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Estim fabrication</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Banana connector/Jack adaptor</td>
			<td>Poppstars</td>
			<td>1008554</td>
			<td>2 pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutting pliers</td>
			<td>Knipex</td>
			<td>78 03 125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC power supply (0-30V/0-3A)</td>
			<td>B&#38;K Precision</td>
			<td>Model 9130B</td>
			<td>Any simular model could be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulated flexible wires (0.14 mm2)</td>
			<td>Conrad Electronic International</td>
			<td>604794, 604093</td>
			<td>2 pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-corrosive silicone rubber</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3140 RTV</td>
			<td>*could be purchased by many stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Wire (999,5/1000; 1mm &#248;)</td>
			<td>Junker Edelmetalle</td>
			<td>00D-3010</td>
			<td>0.6 m needed for 1 Estim chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol solution</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td>Sterilisation of Estim chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver coated copper wire (0.6 mm &#248;)</td>
			<td>Conrad Electronic International</td>
			<td>409334 - 62</td>
			<td>&#8776;70 cm needed for 1 Estim device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering iron Set</td>
			<td>Conrad Electronic International</td>
			<td>1611410 - 62</td>
			<td>Any simular model could be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP 6-well plate lid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z707759-126EA</td>
			<td>2 lids for Estim chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.2V wired circular LEDs</td>
			<td>Conrad Electronic International</td>
			<td>599525 - 62</td>
			<td>6 pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UHU Super glue</td>
			<td>UHU GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>n/a</td>
			<td>*could be purchased by many stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Glycerophosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td>osteogenic cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>21885025</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td>osteogenic cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Falcon tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,547,004</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td>osteogenic cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague-Dawley (SD) rat mesenchymal stem cells, bone marrow origin</td>
			<td>Cyagen</td>
			<td>RASMX-01001</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell detachment solution</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>cell culture, cell detachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Flask, T75</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833911302</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP 6-well plates</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z707759-126EA</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Dye, 0.4% solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1450021</td>
			<td>cell count</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction and use of an electrical stimulation chamber for enhancing osteogenic differentiation in mesenchymal stem/stromal cells in vitro

Células madre/estromales mesenquimales (MSCs) se han utilizado extensivamente para promover el hueso curativo en enfoques de ingeniería de tejidos. Estimulación eléctrica (EStim) se ha demostrado para aumentar la diferenciación osteogénica de MSC in vitro y promover hueso curativo en ajustes clínicos. Aquí describimos la construcción de una cámara de cultivo celular de EStim y su uso en el tratamiento de MSC de médula ósea para mejorar la diferenciación osteogénica de la rata. Se encontró que el tratamiento de MSCs con EStim durante 7 días da lugar a un aumento significativo en la diferenciación osteogénica, y lo importante, este efecto osteogénico pro persiste mucho tiempo después (7 días) EStim. Este enfoque de pretratamiento de MSCs con EStim para mejorar la diferenciación osteogénica podría utilizarse para optimizar los resultados del tratamiento de recreando el tejido del hueso y, así, ayudarles a alcanzar su potencial completo terapéutico. Además de esta aplicación, esta EStim compartimiento de la cultura de célula y protocolo pueden también utilizar para investigar otros comportamientos de célula EStim-sensibles, tales como la migración, proliferación, apoptosis y accesorio del andamio.

Para evaluar el efecto de 100 mV/mm de EStim en la diferenciación osteogénica de MSCs, las células tratadas con EStim para 3, 7 y 14 días o no tratada (control) fueron analizadas en el día 14 de cultivo mediante la evaluación de cambios morfológicos y la deposición de calcio (figura 2 ). Esto fue hecha por las células mediante microscopía de campo brillante (cambios de morfología) la proyección de imagen o por fijación de células en solución de...

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Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

Aquí presentamos un protocolo para la construcción de una cámara de cultivo celular diseñada para exponer distintos tipos de estimulación eléctrica y su uso en el tratamiento de células madre mesenquimales para realzar la diferenciación osteogénica de las células.

Construcción y uso de una cámara de estimulación eléctrica para mejorar la diferenciación osteogénica de células madre mesenquimales, estromales In Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Aquí, mostramos cómo construir una cámara de estimulación eléctrica utilizando seis placas comunes de cultivo de pared, y cómo usarla para estimular la diferenciación osteogénica en células madre mesenquimales. Esta cámara es fácil y no costosa de construir, y se puede reutilizar en múltiples experimentos. Después de ser pretratado con estimulación eléctrica en nuestra cámara, las células madre mesenquimales se pueden utilizar para mejorar los resultados en los tratamientos de ingeniería de tejido óseo.Esta cámara también se puede utilizar para investigar otros tipos de células y comportamientos celulares electrosensibles como la migración, la proliferación, los cambios en el potencial de la membrana, la apoptosis y la fijación cuidadosa. En una tapa de placa de seis pozos, marque y luego taladre dos agujeros de un milímetro de diámetro, separados por 25 milímetros, cerca del borde exterior de cada uno de los seis pozos. A continuación, corte un alambre de platino en secciones de 12 cinco centímetros de largo.Dobla manualmente cada sección de cinco centímetros en forma de L, dejando un extremo de tres centímetros de largo, y los otros dos centímetros de largo. Luego, corte el alambre recubierto de plata en dos longitudes de 35 centímetros. Inserte el extremo doblado más largo de un alambre de platino en el agujero perforado, dejando de uno a dos milímetros sobresaliendo del exterior de la tapa.Doblarlo usando fórceps. Después, fije los cables de platino en los orificios de la tapa con pegamento superconductor y déjelos secar durante aproximadamente seis horas. Para preparar los cátodos, suelde las puntas de los seis cables de platino que sobresalen de la tapa a uno de los cables recubiertos de plata.Para preparar los ánodos, suelde los seis alambres de platino restantes a otros cables recubiertos de plata. Posteriormente, agregue LED en el circuito entre cada uno de los seis pares de platino-electrodo de ánodo-cátodo para confirmar la funcionalidad. Coloque un pedazo de cinta de aislamiento negro debajo de cada LED para evitar exponer las células de las placas de cultivo a la luz LED.A continuación, pegue el conector del bloque de terminales de alambre a la esquina superior izquierda de la tapa de la placa de seis pozos y conecte ambos cables recubiertos de plata a los terminales de entrada. A continuación, corte una sección cuadrada de 20 milímetros por 20 milímetros de la esquina superior izquierda de una segunda tapa de placa de seis pozos, para acomodar el conector de bloque de terminales en la primera tapa. Cubra la primera tapa, equipada con los electrodos, con la segunda tapa, y fíbralos junto con cinta adhesiva.Conecte un extremo de los dos cables de cobre aislados estándar a los terminales de salida del conector de cable y los otros extremos a conectores macho de plátano. Encienda la fuente de alimentación pulsando el botón ON-OFF del panel frontal. Active el canal uno pulsando el botón uno.Después, pulse el botón cuatro para ajustar la tensión. Ajuste la salida de carga a 2,5 voltios. A continuación, pulse Intro.El día en que las células son tratadas con tallo E, esterilizar los electrodos en 70%solución de etanol durante 30 minutos. Luego, séquelos bajo luz UV en un armario de seguridad durante 30 minutos adicionales. En una campana de flujo laminar, cubra la placa de seis pozos que contiene los MSC cultivados con la tapa equipada con los electrodos, asegurándose de que los electrodos estén completamente sumergidos en el medio.Luego, transfiera la placa cubierta de seis pozos con las células a la incubadora y conecte sus cables a la fuente de alimentación. A continuación, establezca la fuente de alimentación en una salida de carga de 2,5 voltios y trate las células con el vástago E durante una hora. Después de la estimulación, desconecte la fuente de alimentación y retire la cámara del vástago E de la incubadora.En condiciones estériles, reemplace la tapa, equipada con electrodos, con una tapa de placa estándar de seis pozos. Posteriormente, devuelva las células a la incubadora y déjelas durante la noche. Limpie los electrodos, primero con PBS y luego con una solución de etanol al 70%.A continuación, limpie los productos de corrosión acumulados de la superficie del electrodo con papel de lija fino. Repita el tratamiento del tallo E durante seis días consecutivos. El cuarto día, antes de aplicar la estimulación eléctrica, y en condiciones estériles, cambiar el medio de cultivo aspirando 1,5 mililitros de medio y sustituyéndolo por 1,5 mililitros de medio de diferenciación osteogénico fresco precalentó.Después de aplicar la estimulación eléctrica durante siete días consecutivos, mantener las células en cultivo durante siete días adicionales, intercambiando el medio cada tres a cuatro días. Cuando se complete el tratamiento, analice los cambios de morfología celular bajo un microscopio. Para evaluar el efecto de la estimulación eléctrica en la diferenciación osteogénica de MSC, mida la deposición de calcio, la actividad de fosfatasa alcalina y la expresión génica del marcador osteogénico, como se describe en otros lugares.Para evaluar el efecto de 100 milivoltios por milímetro de estimulación eléctrica en la diferenciación osteogénica de MSC, las células tratadas con estimulación eléctrica durante tres, siete y 14 días y las células no tratadas, se analizaron en el día 14 del cultivo mediante la evaluación de los cambios morfológicos y la deposición de calcio. Los cambios significativos en la morfología celular y los depósitos de calcio fueron visibles en las células tratadas con estimulación eléctrica durante siete y 14 días. Se realizó un análisis detallado de los cambios osteogénicos de la expresión génica del marcador en los días tres, siete y 14 del cultivo.En el séptimo día de cultivo, la expresión De RunX2 fue significativamente mayor en células tratadas con estimulación eléctrica durante siete días. Mientras que la expresión de Colla1 fue significativamente mayor en las células tratadas durante siete días, medidas en el día 14 del cultivo. La expresión de osteopontina se incrementó significativamente en las células estimuladas eléctricamente en los días tres, siete y 14 del cultivo.La expresión de Osterix estaba ausente en las células de control en todos los puntos de tiempo, y sólo se vio a los siete y 14 días de cultivo en células expuestas a la estimulación eléctrica. La cámara de estimulación eléctrica es relativamente fácil de construir. Sin embargo, se debe tener especial cuidado al manipular los cables de platino, y también al limpiar y esterilizar los electrodos.Las células pretratadas a la electricidad en nuestra cámara, solas o sentadas en un material de andamio, podrían implantarse en modelos animales, para estudiar cómo el efecto positivo de la estimulación eléctrica persiste in vitro. Esta técnica proporciona una herramienta simple pero potente para estudiar el mecanismo por el cual la estimulación eléctrica regula las funciones celulares. Este conocimiento puede estar disponible en células de medicina regenerativa.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Investigación

Bioingeniería

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Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Modelos avanzados de hígado 3D para pruebas de genotoxicidad in vitro tras la exposición a nanomateriales a largo plazo

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling

Nanohilos de silicio y estimulación óptica para investigaciones de acoplamiento eléctrico intra e intercelular

Myofibroblasts can spontaneously internalize silicon nanowires (SiNWs), making them an attractive target for bioelectronic applications. These ...

Simple, Affordable, and Modular Patterning of Cells using DNA

Patrones simples, asequibles y modulares de células utilizando ADN

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells ...