Name: construction and use of an electrical stimulation chamber for enhancing osteogenic differentiation in mesenchymal stem/stromal cells in vitro
Uploaded: 2019-01-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro at JoVE.com

Detta arbete stöds delvis av ett AO Foundation startpeng (S-14-03 H) och stiftelsen Friedrichsheim (Stiftung Friedrichsheim) är baserat i Frankfurt am Main, Tyskland.

1. konstruktion av elektrisk stimulering cell kultur avdelningen
<ol><li>För att bygga EStim kammaren, samla två locken på standard 6-väl cell kultur plåtar. 99,99% platina tråd, 60 cm i längd med en diameter av 0,5 – 1 mm; Silver-överdragen koppartråd, 70 cm i längd med en diameter av 0,6 mm; Avbitartänger; lödkolv kit; en tub supraledande lim; en sladdkopplingsdonet kopplingsplint, sex små 2,2 V lysdioder (valfritt). en tub av galvaniserade silikon lim beläggning (valfritt). en rulle svart elektrisk i...

<ol>
	<li>Oryan, A., Kamali, A., Moshiri, A., Baghaban Eslaminejad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Bone+Regenerative+Medicine:+What+Is+the+Evidence?.">Role of Mesenchymal Stem Cells in Bone Regenerative Medicine: What Is the Evidence?.</a> Cells, Tissues, Organs. 204 (2), 59-83 (2017).</li><li>Mauney, J. R., Volloch, V., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Adult+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Bone+Tissue+Engineering+Applications:+Current+Status+and+Future+Prospects.">Role of Adult Mesenchymal Stem Cells in Bone Tissue Engineering Applications: Current Status and Future Prospects.</a> Tissue Engineering. 11 (5-6), 787-802 (2005).</li><li>Mobini, S., Leppik, L., Thottakkattumana Parameswaran, V., Barker, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+effect+of+direct+current+electrical+stimulation+on+rat+mesenchymal+stem+cells.">In vitro effect of direct current electrical stimulation on rat mesenchymal stem cells.</a> PeerJ. 5, e2821 (2017).</li><li>Leppik, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+electrical+stimulation+and+tissue+engineering+to+treat+large+bone+defects+in+a+rat+model.">Combining electrical stimulation and tissue engineering to treat large bone defects in a rat model.</a> Scientific Reports. 8 (1), S1 (2018).</li><li>Song, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+direct+current+electric+fields+to+cells+and+tissues+in+vitro+and+modulation+of+wound+electric+field+in+vivo.">Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo.</a> Nature Protocols. 2 (6), 1479-1489 (2007).</li><li>Hronik-Tupaj, M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+responses+of+two-+and+three-dimensional+engineered+tissues+to+electric+fields.">A review of the responses of two- and three-dimensional engineered tissues to electric fields.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 18 (3), 167-180 (2012).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+for+isolation+and+culture+of+mesenchymal+stem+cells+from+mouse+bone+marrow.">An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow.</a> Journal of Orthopaedic Translation. 3 (1), 26-33 (2015).</li><li>Nau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineered+vascularized+periosteal+flap+enriched+with+MSC/EPCs+for+the+treatment+of+large+bone+defects+in+rats.">Tissue engineered vascularized periosteal flap enriched with MSC/EPCs for the treatment of large bone defects in rats.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 907-917 (2017).</li><li>Eischen-Loges, M., Oliveira, K. M. C., Bhavsar, M. B., Barker, J. H., Leppik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretreating+mesenchymal+stem+cells+with+electrical+stimulation+causes+sustained+long-lasting+pro-osteogenic+effects.">Pretreating mesenchymal stem cells with electrical stimulation causes sustained long-lasting pro-osteogenic effects.</a> PeerJ. 6, 4959 (2018).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Curtis, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EF1alpha+and+RPL13a+represent+normalization+genes+suitable+for+RT-qPCR+analysis+of+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells.">EF1alpha and RPL13a represent normalization genes suitable for RT-qPCR analysis of bone marrow derived mesenchymal stem cells.</a> BMC Molecular Biology. 11, 61 (2010).</li><li>Wang, L., Li, Z. -. y., Wang, Y. -. p., Wu, Z. -. h., Yu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Expression+Profiles+of+Marker+Genes+in+Osteogenic+Differentiation+of+Human+Bone+Marrow-derived+Mesenchymal+Stem+Cells.">Dynamic Expression Profiles of Marker Genes in Osteogenic Differentiation of Human Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Chinese Medical Sciences Journal (Chung-kuo i hsueh k'o hsueh tsa chih). 30 (2), 108-113 (2015).</li><li>Kim, H. B., Ahn, S., Jang, H. J., Sim, S. B., Kim, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+corrosion+behaviors+and+surface+profiles+of+platinum-coated+electrodes+by+electrochemistry+and+complementary+microscopy:+biomedical+implications+for+anticancer+therapy.">Evaluation of corrosion behaviors and surface profiles of platinum-coated electrodes by electrochemistry and complementary microscopy: biomedical implications for anticancer therapy.</a> Micron. 38 (7), 747-753 (2007).</li><li>Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+field-induced+migration+and+intercellular+stress+alignment+in+a+collective+epithelial+monolayer.">Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer.</a> Molecular Biology of the Cell. , mbcE18010077 (2018).</li><li>Tai, G., Tai, M., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrically+stimulated+cell+migration+and+its+contribution+to+wound+healing.">Electrically stimulated cell migration and its contribution to wound healing.</a> Burns &amp; Trauma. 6, 20 (2018).</li><li>Love, M. R., Palee, S., Chattipakorn, S. C., Chattipakorn, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+electrical+stimulation+on+cell+proliferation+and+apoptosis.">Effects of electrical stimulation on cell proliferation and apoptosis.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (3), 1860-1876 (2018).</li><li>Adams, D. S., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+principles+for+measuring+resting+membrane+potential+and+ion+concentration+using+fluorescent+bioelectricity+reporters.">General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 385-397 (2012).</li><li>Jin, G., Li, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electrically+conductive+scaffold+as+the+skeleton+of+stem+cell+niche+in+regenerative+medicine.">The electrically conductive scaffold as the skeleton of stem cell niche in regenerative medicine.</a> Materials Science &amp; Engineering. C, Materials for Biological Applications. 45, 671-681 (2014).</li><li>Hronik-Tupaj, M., Rice, W. L., Cronin-Golomb, M., Kaplan, D. L., Georgakoudi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblastic+differentiation+and+stress+response+of+human+mesenchymal+stem+cells+exposed+to+alternating+current+electric+fields.">Osteoblastic differentiation and stress response of human mesenchymal stem cells exposed to alternating current electric fields.</a> Biomedical Engineering Online. 10, 9 (2011).</li></ol>

Här beskriver vi byggandet av en kammare och en metod för behandling av mesenkymala stamceller med EStim som resulterar i förbättrad osteogent differentiering.
EStim installationen presenteras kräver inte speciell utrustning/kunskap och kan utföras i ett standard stamcell biologi/biokemi laboratorium av juniora forskare. Dock när bygga och använda EStim kammaren, måste särskild försiktighet iakttas i några kritiska steg. Vid hantering av platina elektroderna, måste extra vara för...

En ökning av trauma eller sjukdom-inducerad ben defekter behandlas med hjälp av olika kombinationer av cellterapi och regenerativ medicin-teknik. MSCs är cellen i val i sådana behandlingar, på grund av sin relativt höga osteogent aktivitet, isolering och expansion effektivitet och säkerhet1. För att maximera deras osteogent aktivitet och, således, optimera deras terapeutiska effektivitet, har flera metoder införts för att manipulera MSCs innan används i dessa behandlingar (som granskas av Mauney et al.2). En sådan metod är EStim, som har visat sig förbättra MSC osteogent differentiering i vitro3 och främja ben healing invivo4. Trots det växande antalet studier med fokus på behandling av MSCs med EStim, ännu en optimal regim för att maximera Estim's pro-osteogent effekt definieras.
Andra in vitro-metoder som använder EStim utnyttja salt broar nedsänkt i odlingsmediet, som separerar celler från metalliska elektroder5. Fördelen med detta är att leverera EStim igenom salt överbryggar eliminerar införandet av kemiska biprodukter (t.ex., korrosion av metalliska elektroder) som kan vara cytotoxiska. Trots denna fördel, salt broar är omständligt att arbeta med, och den EStim de levererar skiljer sig från att levereras i in vivo modeller, vilket gör det svårt att korrelera resultat när du använder de två systemen. Uppställningar som levererar EStim via metallic eller kol elektroder fast inuti cellen kultur brunnarna simulera (som granskas av Hronik-Tupaj och Kaplan6) bättre enheter används i vivo; emellertid, dessa enheter är svåra att rengöra/sterilisera mellan användningar och antalet celler som kan studeras per experiment är begränsad. Vi designade EStim kammaren presenteras här specifikt för att hantera begränsningar i dessa andra uppställningar. Medan de flesta av vår erfarenhet av att använda kammaren EStim har varit med 2D och 3D kulturer som innehåller benmärg - och adipose-vävnad-härledda MSCs3,4, en stor fördel med denna kammare är att den är mångsidig och, med små relativt förändringar, kan anpassas att studera andra celltyper under en mängd olika förhållanden.
Här beskriver vi byggandet av en EStim cell kultur kammare; sedan visar vi dess användning av behandlande MSCs med olika regimer av EStim och mäta den resulterande effekten på osteogent differentiering. MSC osteogent differentiering bedöms via kalcium nedfall, alkaliskt fosfatasaktiviteten och osteogent markör genuttryck. Allt observerat i tidigare experiment som används här installationen vi att dessa pro-osteogent effekter kvarstår långt efter EStim behandlingen avbröts.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Estim fabrication</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Banana connector/Jack adaptor</td>
			<td>Poppstars</td>
			<td>1008554</td>
			<td>2 pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutting pliers</td>
			<td>Knipex</td>
			<td>78 03 125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC power supply (0-30V/0-3A)</td>
			<td>B&#38;K Precision</td>
			<td>Model 9130B</td>
			<td>Any simular model could be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulated flexible wires (0.14 mm2)</td>
			<td>Conrad Electronic International</td>
			<td>604794, 604093</td>
			<td>2 pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-corrosive silicone rubber</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3140 RTV</td>
			<td>*could be purchased by many stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Wire (999,5/1000; 1mm &#248;)</td>
			<td>Junker Edelmetalle</td>
			<td>00D-3010</td>
			<td>0.6 m needed for 1 Estim chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol solution</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td>Sterilisation of Estim chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver coated copper wire (0.6 mm &#248;)</td>
			<td>Conrad Electronic International</td>
			<td>409334 - 62</td>
			<td>&#8776;70 cm needed for 1 Estim device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering iron Set</td>
			<td>Conrad Electronic International</td>
			<td>1611410 - 62</td>
			<td>Any simular model could be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP 6-well plate lid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z707759-126EA</td>
			<td>2 lids for Estim chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.2V wired circular LEDs</td>
			<td>Conrad Electronic International</td>
			<td>599525 - 62</td>
			<td>6 pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UHU Super glue</td>
			<td>UHU GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>n/a</td>
			<td>*could be purchased by many stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Glycerophosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td>osteogenic cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>21885025</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td>osteogenic cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Falcon tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,547,004</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td>osteogenic cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague-Dawley (SD) rat mesenchymal stem cells, bone marrow origin</td>
			<td>Cyagen</td>
			<td>RASMX-01001</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell detachment solution</td>
			<td>Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>cell culture, cell detachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Flask, T75</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833911302</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP 6-well plates</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z707759-126EA</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Dye, 0.4% solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1450021</td>
			<td>cell count</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction and use of an electrical stimulation chamber for enhancing osteogenic differentiation in mesenchymal stem/stromal cells in vitro

Mesenkymala stamceller/stromaceller (MSCs) har använts i stor utsträckning främja läkning i Vävnadsrekonstruktion metoder. Elektrisk stimulering (EStim) har visat sig öka MSC osteogent differentiering in vitro- och främja ben healing i kliniska inställningar. Beskriver här vi byggandet av en EStim cell kultur avdelningen och dess användning vid behandling av råtta ben-märg-härledda MSC att förbättra osteogent differentiering. Vi fann att behandling av MSCs med EStim för 7 dagar resulterar i en betydande ökning i osteogent differentiering, och viktigast av allt, denna pro-osteogent effekt kvarstår länge efter (7 dagar) EStim sätts. Detta tillvägagångssätt av förbehandling MSCs med EStim att förbättra osteogent differentiering kunde användas för att optimera benvävnad engineering behandlingsresultat och, således, hjälpa dem att uppnå sin fulla terapeutiska potential. Förutom denna ansökan, kan denna EStim cell kultur avdelningen och protokoll även användas att undersöka andra EStim-känsliga cell beteenden, såsom migration, proliferation, apoptos och byggnadsställning fastsättning.

För att utvärdera effekten av 100 mV/mm för EStim på osteogent differentiering av MSCs celler behandlas med EStim för 3, analyserades 7, och 14 dagar eller nontreated (kontroll) dag 14 av odling genom att bedöma morfologiska förändringar och kalcium nedfall (figur 2 ). Detta skedde genom imaging celler med ljusa fält mikroskopi (morfologi ändringar) eller genom fastställande celler i 4% PARAFORMALDEHYD lösning, färgning dem med 0,02% alizarin rö...

Watch this Scientific Journal Video about Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro at JoVE.com

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

Här presenterar vi ett protokoll för byggandet av en cell kultur kammare för att exponera celler till olika typer av elektrisk stimulering, och dess användning vid behandling av mesenkymala stamceller för att förbättra osteogent differentiering.

Konstruktion och användning av en elektrisk stimulering kammare för att förbättra osteogent differentiering i mesenkymala stamceller/stromaceller In Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Här visar vi hur man bygger en elektrisk stimuleringskammare med vanliga sex väggkulturplattor, och hur man använder den för att stimulera osteogen differentiering i mesenkymala stamceller. Denna kammare är lätt och inte dyrt att bygga, och kan återanvändas i flera experiment. Efter att ha förbehandlats med elektrisk stimulering i vår kammare, mesenkymala stamceller kan användas för att förbättra resultaten i benvävnad engineering behandlingar.Denna kammare kan också användas för att undersöka andra celltyper och elektrokänsliga cell beteenden som migration, proliferation, förändringar i membranet potential, apoptos, och noggranna bilaga. I en sex brunn tallrik lock, markera och sedan borra två en millimeter diameter hål, 25 millimeter isär, nära den yttre kanten av var och en av de sex brunnarna. Därefter skär en platinatråd i 12 fem centimeter långa sektioner.Böj varje femcentimeterssektion manuellt till en L-form, och lämna ena änden tre centimeter lång, och den andra två centimeter lång. Sedan skär den silverbelagda tråden i två 35-centimeterslängder. Sätt in den längre böjda änden av en platinatråd i det borrade hålet och lämna en till två millimeter utstående från lockets utsida.Böj den med hjälp av tänjningar. Efteråt, säkra platinatrådarna i lockhålen med superledande lim och låt dem torka i cirka sex timmar. För att förbereda katoderna, löda spetsarna på alla sex platinatrådar som sticker ut från locket till en av de silverbelagda trådarna.För att förbereda anoderna, löda de återstående sex platinatrådarna till andra silverbelagda trådar. Därefter, lägga till lysdioder i kretsen mellan var och en av de sex anod-katod platina-elektrod par för att bekräfta funktionaliteten. Placera en bit svart isoleringstejp under varje LED för att förhindra att cellerna i odlingsplattorna exponeras för LED-ljus.Därefter limma trådplintens kontakt till det övre vänstra hörnet av sex-brunnsplattans lock och anslut båda silverbelagda trådarna till ingångsterminalerna. Sedan skär ut en 20-millimeters med 20-millimeters kvadratisk sektion från det övre vänstra hörnet av en andra sex-väl tallrik lock, för att rymma terminalen blockkontakt på det första locket. Täck det första locket, utrustad med elektroderna, med det andra locket, och tejpa ihop dem med tejp.Anslut ena änden av de två vanliga isolerade koppartrådarna till trådkontaktens utgående poler, och de andra ändarna till bananhanarkontakter. Slå på nätaggregatet genom att trycka på ON-OFF-knappen på frontpanelen. Aktivera kanal ett genom att trycka på knapp ett.Efteråt, tryck på knapp fyra för att ställa in spänningen. Ställ in belastningsutgången på 2,5 volt. Tryck sedan på Retur.Den dag cellerna behandlas med E-stam, sterilisera elektroderna i 70%etanollösning i 30 minuter. Torka dem sedan i UV-belysning i ett säkerhetsskåp i ytterligare 30 minuter. I en laminär flödeshuv, täck den sex-brunnsplatta som innehåller de odlade MSC:erna med locket utrustat med elektroderna, var förvissa sig om att elektroderna är helt nedsänkta i mediet.Sedan överför den täckta sex-brunnsplattan med celler till inkubatorn och anslut dess ledningar till strömförsörjningen. Därefter ställer du in strömförsörjningen till 2,5 volts belastningsutgång och behandlar cellerna med E-stam i en timme. Efter stimulering, koppla bort strömförsörjningen och avlägsna E-stjälkkammaren från inkubatorn.Under sterila förhållanden, byt locket, utrustad med elektroder, med en standard sex-väl tallrik lock. Därefter, returnera cellerna till inkubatorn, och lämna dem över natten. Rengör elektroderna, först med PBS, och sedan med 70%etanollösning.Rengör sedan de ackumulerade korrosionsprodukterna från elektrodytan med fint sandpapper. Upprepa E-stambehandlingen under sex dagar i följd. På dag fyra, innan den applicerar elektrisk stimulering, och under sterila förhållanden, ändrar kulturmediet genom att aspirera 1,5 milliliter medium och ersätta det med 1,5 milliliter förvmat, färskt osteogeniskt differentieringsmedium.Efter applicering av elektrisk stimulering i sju dagar i följd, behålla cellerna i kultur i ytterligare sju dagar, utbyta mediet var tredje till fyra dagar. När behandlingen är avslutad, analysera cellen morfologi förändringar under ett mikroskop. För att bedöma effekten av elektrisk stimulering på MSC osteogenic differentiering, mäta kalcium nedfall, alkaliska fosfatas aktivitet och osteogenic markör genuttryck, som beskrivs på andra ställen.För att utvärdera effekten av 100 millivolt per millimeter av elektrisk stimulering på MSC osteogenic differentiering, celler som behandlats med elektrisk stimulering för tre, sju och 14 dagar och icke-behandlade celler, analyserades på dag 14 av kultur genom att bedöma morfologiska förändringar och kalcium nedfall. Betydande förändringar i cell morfologi och kalcium avlagringar var synliga i celler som behandlats med elektrisk stimulering i sju och 14 dagar. En detaljerad analys av osteogenic markör gen uttryck förändringar utfördes på dag tre, sju och 14 av kultur.Vid dag sju av kultur, RunX2 uttryck var betydligt högre i celler som behandlats med elektrisk stimulering i sju dagar. Medan Colla1 uttryck var betydligt högre i celler som behandlats i sju dagar, mätt vid dag 14 av kultur. Uttrycket av osteopontin ökades signifikant i elektriskt stimulerade celler vid dag tre, sju och 14 av kultur.Osterix uttryck var frånvarande i kontroll celler vid alla tidpunkter, och sågs endast vid sju och 14 dagar av kultur i celler som utsätts för elektrisk stimulering. Den elektriska stimuleringskammaren är relativt lätt att bygga. Särskild försiktighet måste dock tas vid hantering av platinatrådarna, och även vid rengöring och sterilisering av elektroderna.Celler som förbehandlas till elektricitet i vår kammare, ensamma eller sitter på ett byggnadsmaterial, skulle kunna implanteras i djurmodeller, för att studera hur den positiva effekten av elektrisk stimulering kvarstår in vitro. Denna teknik ger ett enkelt men kraftfullt verktyg för att studera mekanismen genom vilken elektrisk stimulering reglerar cellens funktioner. Denna kunskap kan finnas tillgänglig i regenerativa medicinceller.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Engineering Skelettmuskulatur Vävnader från murinceller myoblast progenitorceller och tillämpning av elektrisk stimulering

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Ögonirritationstest (EIT) för Hazard Identifiering av Eye irriterande kemikalier med hjälp av rekonstruerad Human Cornea liknande Epithelial (RHCE) Tissue Modell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

Polyelektrolytkomplex för Heparin Binding Domain osteogent Growth Factor Leverans

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Kultur Modell av murina mellankotskivan

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Förbättrad 3D Hydrogel kulturer av primära gliaceller för In Vitro modellering av Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Isolering av mesenkymala stamceller från mänskliga alveolära periostet och effekter av D-Vitamin på osteogent aktivitet av periostet-derived celler

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential

Samtidiga elektrisk och mekanisk stimulering att öka cellernas Cardiomyogenic Potential

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Avancerade 3D-levermodeller för in vitro-genotoxicitytestning efter långvarig nanomaterialexponering

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling

Kiselnanotrådar och optisk stimulering för undersökningar av intra- och intercellulär elektrisk koppling

Myofibroblasts can spontaneously internalize silicon nanowires (SiNWs), making them an attractive target for bioelectronic applications. These ...

Simple, Affordable, and Modular Patterning of Cells using DNA

Enkel, prisvärd och modulär mönstra av celler med HJÄLP AV DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells ...