Name: flow cytometric analysis of extracellular vesicles from cell-conditioned media
Uploaded: 2019-02-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media at JoVE.com

وأيد L.B. المنح البحثية هلموت هورتين ستيفتونغ وفيلا شتيفتونغ، زيوريخ (سويسرا). وأيده كل المنح البحثية لمؤسسة العلوم الوطنية السويسرية، ومؤسسة سيسيليا-أوغوستا، لوغانو، و "الشيخ ستيفتونغ" für هيرز أوند كريسلاوفكرانخيتين (سويسرا)

1-جمع وتجهيز الوسائط مكيفة
<ol><li>معطف 55 سم2 أطباق بيتري مع الجيلاتين من جلد الخنزير 0.02 في المائة في برنامج تلفزيوني.</li>
	<li>لوحة لجنة البرنامج والتنسيق (8,000/سم2) في أطباق المغلفة مسبقاً مع 7 مل من المتوسطة (إيمدم "تعديل دولبيكو" ل Iscove) وتستكمل مع 20% FBS (مصل بقرى الجنين) و 1% البنسلين/سترب?...

<ol>
	<li>Barile, L., Vassalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+Therapy+delivery+tools+and+biomarkers+of+diseases.">Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. , (2017).</li><li>Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+secreted+vesicles+and+intercellular+communications.">Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications.</a> Molecular Biology Reports. 3, 15 (2011).</li><li>Yadav, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsy+in+pancreatic+cancer:+the+beginning+of+a+new+era.">Liquid biopsy in pancreatic cancer: the beginning of a new era.</a> Oncotarget. 9, 26900-26933 (2018).</li><li>Balbi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+Characterization+of+Human+Amniotic+Fluid+Stem+Cell+Extracellular+Vesicles+as+a+Powerful+Paracrine+Tool+Endowed+with+Regenerative+Potential.">First Characterization of Human Amniotic Fluid Stem Cell Extracellular Vesicles as a Powerful Paracrine Tool Endowed with Regenerative Potential.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6, 1340-1355 (2017).</li><li>Andriolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+From+Human+Cardiac+Progenitor+Cells+for+Therapeutic+Applications:+Development+of+a+GMP-Grade+Manufacturing+Method.">Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method.</a> Frontiers in Physiology. 9, (2018).</li><li>Lai, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+secreted+by+MSC+reduces+myocardial+ischemia/reperfusion+injury.">Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury.</a> Stem Cell Research. 4, (2009).</li><li>Doeppner, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles+Improve+Post-Stroke+Neuroregeneration+and+Prevent+Postischemic+Immunosuppression.">Extracellular Vesicles Improve Post-Stroke Neuroregeneration and Prevent Postischemic Immunosuppression.</a> Stem Cells Translational Medicine. 4, 1131-1143 (2015).</li><li>Kordelas, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC-derived+exosomes:+a+novel+tool+to+treat+therapy-refractory+graft-versus-host+disease.">MSC-derived exosomes: a novel tool to treat therapy-refractory graft-versus-host disease.</a> Leukemia. 28, 970-973 (2014).</li><li>Barile, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+human+cardiac+progenitor+cells+inhibit+cardiomyocyte+apoptosis+and+improve+cardiac+function+after+myocardial+infarction.">Extracellular vesicles from human cardiac progenitor cells inhibit cardiomyocyte apoptosis and improve cardiac function after myocardial infarction.</a> Cardiovascular Research. 103, 530-541 (2014).</li><li>Longatti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+affinity+single-chain+variable+fragments+are+specific+and+versatile+targeting+motifs+for+extracellular+vesicles.">High affinity single-chain variable fragments are specific and versatile targeting motifs for extracellular vesicles.</a> Nanoscale. 10, 14230-14244 (2018).</li><li>Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Microvesicles+from+Peripheral+Blood.">Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li><li>Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+analysis+of+extracellular+vesicles+using+flow+cytometry.">Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2015).</li><li>Arakelyan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Virometry+to+Analyze+Antigenic+Spectra+of+Virions+and+Extracellular+Vesicles.">Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li><li>Chimenti, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+adult+cardiac+stem/progenitor+cells+in+the+form+of+cardiospheres+from+human+cardiac+biopsies+and+murine+hearts.">Isolation and expansion of adult cardiac stem/progenitor cells in the form of cardiospheres from human cardiac biopsies and murine hearts.</a> Methods Molecular Biology. 879, 327-338 (2012).</li><li>van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry.">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nature Protocols. 7, 1311-1326 (2012).</li><li>Pospichalova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+protocol+for+flow+cytometry+analysis+of+fluorescently+labeled+exosomes+and+microvesicles+using+dedicated+flow+cytometer.">Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 25530 (2015).</li><li>van der Pol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+size+distribution+of+exosomes+and+microvesicles+determined+by+transmission+electron+microscopy,+flow+cytometry,+nanoparticle+tracking+analysis,+and+resistive+pulse+sensing.">Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12, 1182-1192 (2014).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updating+the+MISEV+minimal+requirements+for+extracellular+vesicle+studies:+building+bridges+to+reproducibility.">Updating the MISEV minimal requirements for extracellular vesicle studies: building bridges to reproducibility.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1396823 (2017).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cellular Biology. , (2006).</li><li>Suarez, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bead-assisted+flow+cytometry+method+for+the+semi-quantitative+analysis+of+Extracellular+Vesicles.">A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles.</a> Scientific Reports. 7, 11271 (2017).</li><li>Sodar, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-density+lipoprotein+mimics+blood+plasma-derived+exosomes+and+microvesicles+during+isolation+and+detection.">Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection.</a> Scientific Reports. 6, 24316 (2016).</li><li>Sluijter, J. P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+diagnostics+and+therapy+of+the+ischaemic+heart:+Position+Paper+from+the+Working+Group+on+Cellular+Biology+of+the+Heart+of+the+European+Society+of+Cardiology.">Extracellular vesicles in diagnostics and therapy of the ischaemic heart: Position Paper from the Working Group on Cellular Biology of the Heart of the European Society of Cardiology.</a> Cardiovascular Research. 114, 19-34 (2018).</li></ol>

ويظل التقليدية FC تقنية الأسلوب التحليلي الأكثر مباشرة لتوصيف علامات على السطح EV وأعرب عن. وفي هذا الصدد، تحديد بروتوكول أنسب أمر حاسم للحصول على معلومات مفيدة عن الكسور الجسيمات الفردية للاهتمام بتجنب القيود بسبب حساسية الصك. وصفت لنا طريقة استخدام الجسيمات المغناطيسية مقترنة بالأجسام ?...

تفرز خلايا الحويصلات خارج الخلية (EV) ذات أحجام مختلفة بما في ذلك ميكروفيسيكليس (MV) واكسوسوميس (Exo). يمكن التمييز بين هذا الأخير من السيارات حسب الحجم وحجرة سوبسيلولار الأصلية. يتم تحرير MV (200 – 1,000 نانومتر في الحجم) من الخلايا الأصل قبل ذرف من غشاء البلازما. على العكس من ذلك، تنبع من الأغشية اندوسومال أكسو (30-150 nm) وهي التي تطلق في الفضاء خارج الخلية عندما تلتحم الهيئات مولتيفيسيكولار (مفب) مع غشاء الخلية1،2.
EV بصورة متزايدة كالمؤشرات الحيوية التشخيص كذلك، يحتمل أن تكون، أدوات العلاجية في العديد من المجالات بما في ذلك الأورام والأمراض العصبية وأمراض القلب وأمراض العظام والعضلات3،،من45. غالبية العظمى من الدراسات الجارية باستخدام EV باستغلال العوامل العلاجية عزلة حويصلات من تكييف الخلية المتوسطة (سم) من الخلايا المزروعة في المختبر. الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) تأثيراً مفيداً في عدة سياقات، والمستمدة من لجنة السلامة البحرية EV أظهرت فوائد في نماذج من احتشاء عضلة القلب الاسكيمية/ضخه إصابة6 والدماغ إصابة7. كما يحمل EV المستمدة من لجنة السلامة البحرية محصنة ضد الأنشطة مودولاتوري التي يمكن استغلالها لعلاج الرفض المناعي، كما هو موضح في نموذج للعلاج-صهر الاختلاس – مقابل – المضيف المرض8. بنشاط تخصيب الخلايا الجذعية السائل السلوى (حفص) سم مع MVs واكسو، موزعة بين في الحجم (50 – 1,000 nm)، التي تتوسط العديد من الآثار البيولوجية، مثل انتشار الخلايا المتمايزة، والأوعية، وتثبيط التليف، و كارديوبروتيكشن4. ونحن قد أظهرت مؤخرا أن قيمة المنشأة، ولا سيما أكسو، يفرز من الخلايا البشرية السلف المستمدة من القلب (أكسو-الحزب الشيوعي الصيني) تقليل حجم احتشاء عضلة القلب في الفئران5،9.
أكسو حصة مجموعة مشتركة من البروتينات على سطحها، بما في ذلك تيتراسبانينس (CD63، CD81، CD9) و histocompatibility الرئيسية المعقدة الفئة الأولى (MHC--أنا). وبالإضافة إلى هذه المجموعة المشتركة من البروتينات، كما أكسو تحتوي على بروتينات محددة ل EV مجموعة فرعية من نوع الخلية المنتجة. علامات أكسو تكتسب أهمية قصوى لأنها تلعب دوراً حاسما في الاتصالات بين الخلوية، وبالتالي تنظم العديد من العمليات البيولوجية5،10. بسبب صغر حجمها، إيجاد طريقة سهلة لتحليل EV استخدام الكلاسيكية التدفق الخلوي (FC) يظل مهمة صعبة.
وهنا، يقدم بروتوكول مبسط لتحليل EV استخدام FC، التي يمكن تطبيقها للتخصيب قبل العينات التي تم الحصول عليها من خلال تنبيذ فائق أو مباشرة إلى سم (الشكل 1). يستخدم الأسلوب حبات مغلفة بجسم معين التي تربط الكنسي المرتبطة أكسو السطحية [ابيتوبس] (CD63, CD9, CD81) دون يغسل إضافية. يمكن إجراء تحليلات FC استخدام cytometer تقليدية مع عدم وجود حاجة لإجراء تعديلات قبل القياسات. وقد وصف أساليب لتوصيف المستضدات على جزيئات صغيرة فردية باستخدام سيتوميتيرس تدفق مجموعات أخرى فيما يتعلق بمختلف تطبيقات11،،من1213. هنا، استخدمنا حبات المغناطيسية فونكتيوناليزيد لإلقاء القبض على جزيئات صغيرة واكسو، تليها phenotyping الجزيئات الملتقطة بنادي. على الرغم من أن يمكن استخدام هذا الأسلوب لتحديد خصائص مستضدي تكوين حويصلات صغيرة صدر عن أي نوع من الخلايا في المختبر، هنا قدمنا شروط ثقافة الخلية المحددة التي تنطبق لثقافة السلف القلب البشري خلايا (الحزب الشيوعي) وأكثر البيئة المناسبة لإنتاج EV بهذه الخلايا.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:816px;" width="816">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:369px;">IMDM</td>
			<td style="width:113px;">Gibco</td>
			<td style="width:235px;">12440061</td>
			<td style="width:99px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100&#160;kDa&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CytoFlex, Flow Cytometer Platform</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>CytoFlex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21063045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s PBS (PBS) Ca- and Mg-free</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-512F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExoCap CD63 Capture Kit</td>
			<td>JSR Life Sciences</td>
			<td>Ex-C63-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExoCap CD81 Capture Kit</td>
			<td>JSR Life Sciences</td>
			<td>Ex-C81-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExoCap CD9 Capture Kit</td>
			<td>JSR Life Sciences</td>
			<td>Ex-C9-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Exosome-Depleted FBS</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A2720801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Exosome-depleted FBS Media Supplement</td>
			<td>SBI</td>
			<td>EXO-FBS-250A-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS-Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-human CD9 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>312104&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; RRID: AB_2075894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow Cytometer analysis software</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Kaluza</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoSight LM10</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NanoSight LM10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoSight Software</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NTA 2.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optima Max-XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE anti-human CD63 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>353004&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; RRID:AB_10897809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE anti-human CD81 (TAPA-1) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>349505&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; RRID:AB_10642024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermomixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382 000 015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">TLA-110</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>TLA-110 rotors</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of extracellular vesicles from cell-conditioned media

التدفق الخلوي (FC) هو الأسلوب المفضل للقياس الكمي شبه علامات مستضد سطح الخلية. في الآونة الأخيرة، استخدمت هذا الأسلوب لتحليلات المظهرية من حويصلات خارج الخلية (EV) بما في ذلك اكسوسوميس (Exo) في الدم المحيطي وسوائل الجسم الأخرى. صغر حجم EV ولايات استخدام صكوك مخصصة لها عتبة الكشف عن حوالي 50-100 نانومتر. وبدلاً من ذلك، يمكن ربط EV ميكروبيدس مطاط يمكن الكشف عنها بواسطة FC. يمكن استخدام ميكروبيدس، مترافق مع الأجسام المضادة التي تعترف بعلامات/الكتلة المرتبطة EV CD63 التمايز و CD9 و CD81 لالتقاط EV. يمكن تحليل أكسو معزولة عن سم مع أو بدون تخصيب اليورانيوم قبل واسطة تنبيذ فائق. وهذا النهج مناسبة لتحليلات EV باستخدام الصكوك FC التقليدية. وتبين النتائج التي توصلنا إليها ارتباط خطي بين قيم كثافة Fluorescence يعني (MFI) وتركيز EV. تعطيل EV خلال sonication هائلة انخفضت مؤسسة مونتانيار، مما يشير إلى أن الأسلوب لا يكشف عن الحطام الغشاء. ونحن التقرير طريقة دقيقة وموثوق بها لتحليل المستضدات السطحية EV، التي يمكن تنفيذها بسهولة في أي مختبر.

العدد الكلي للجزيئات لتلطيخ واحد
حيث يمكن ربط حبة واحدة أكثر من الجسيمات، اختبرنا الظروف المختلفة لتعيين مقدار أصغر من مجموع EV (جسم واحد كل أنبوب) للوصول إلى المرحلة المبكرة الأسية لمؤسسة مونتانيار منحنى. واستخدمت بتركيز ثابت م?...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media at JoVE.com

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

البروتوكول وصف أسلوب استنساخه مصممة للاستخدام مع supernatants ثقافة الخلية للكشف عن سطح [ابيتوبس] في حويصلات صغيرة خارج الخلية (EV). فإنه يستخدم إيمونوبريسيبيتيشن EV محددة باستخدام الخرز مقترنة بالأجسام المضادة التي تعترف بسطح مستضد CD9، CD63، و CD81. الأسلوب هو الأمثل للتحليل الخلوي تدفق المتلقين للمعلومات.

تحليل سيتوميتريك من حويصلات خارج الخلية من خلية مكيفة وسائل الإعلام تدفق

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

يتم استخدام الفيليات خارج الخلية بشكل متزايد كعلامة حيوية تشخيصية وأداة علاجية محتملة في العديد من المجالات. تدفق Cytometric هو الأسلوب التحليلية الأكثر استقامة لتميز من قبل علامات دعوى تواجه هذا البروتوكول يمكن استخدامها في تحليل الجسيمات assized، هو سريع، وينطبق على مقاييس الزلازل التقليدية دون الحاجة إلى الإعداد الخاص أو أداة مخصصة. على الرغم من أن يتم استخدام هذا البروتوكول لتصنيف الفينات خارج الخلية من الحالة المتوسطة المذكورة ، يمكن توسيعها نحو تصنيف الدم AVs وصلت ، لتحل محل خزعات الأنسجة الغازية في المرضى.بالنسبة للباحثين الجدد على البروتوكول ، من الأهمية بمكان تنفيذ الخطوات الموصوفة في قسم طريقة الإعداد ، والمتابعة عن كثب لاستراتيجيات الحصول على البينة Begin عن طريق طلاء 55 سنتيمترًا مربعة بأطباق بيتري - أطباق مع الجيلاتين الجلدي البورسين بنسبة 02٪، في PBS. بعد 15 دقيقة، اغسل الطبق والصحن 4.4 مرات 10 إلى الخلايا السلف القلبية الخامسة على كل طبق في 7 ملليلتر من متوسطة Dulbecco المعدلة في إيسكو، أو IMDM، وتستكمل مع 20٪ مصل البقر الجنين، و 1٪ من البنسلين وstreptomycin لاحتضانها في 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. عندما تصل الخلايا إلى حوالي 80٪ التقاء، وغسل الثقافات مرتين مع برنامج تلفزيوني دولبيككو دون الكالسيوم والمغنيسيوم وتغذية الخلايا مع 10 milileters من مصل خال من إنتاج الاحتياج المتوسطة.بعد 7 أيام، قم بتجميع الوسيطة المُكيفة من كل صفيحة، في أنبوب واحد من أجهزة الطرد المركزي من البولي بروبلين وطاردة مركزية لإزالة أي حطام خلية. نقل supernatent في أنبوب تصفية الطرد المركزي 100 كيلودالتون، وتركيز مسح، مكيفة، المتوسطة مع طرد مركزي إضافية. نقل التركيز إلى أنبوب جهاز طرد مركزي صغير للطرد المركزي النهائي سطح المقعد وإضافة supernatent في أنبوب جهاز طرد مركزي صغير الجدار سميكة البولي.ملء أنبوب مع برنامج تلفزيوني، إلى حجم النهائي من 3.2 milileters، وتحميل العينة في الدوار التيتانيوم ملائكية ثابتة. ثم تحميل الدوار في الطاولة فائقة الrifuge للطرد فائقة المركز ، وإعادة تعليق بيليه في 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني جديد. لتتبع الجسيمات النانوية وتحليلها، تمييع 1 ميكرولتر من العينة فائقة التركيز، في 999 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني، وتحميل العينة في حقنة 1 milileter دون فقاعات.قم بتحميل الحقنة في مدخل مدخل غرفة الفحص، ثم قم بتشغيل الليزر. استخدم زر الالتقاط لفتح الكاميرا وضبط التركيز. ثم سجل ما لا يقل عن ثلاثة إطارات مختلفة من 60 ثانية لكل من هذه ، واستخدام خيار عملية الدفعة في البرنامج ، لتحليل المقتنيات الثلاثة المختلفة.لإعداد العينة للحصول عليها، أولاً إضافة الأجسام المضادة أحادية النسيلة التجريبية المناسبة الخرز التقاط مترافق في نسبة 1:1:1، في أنبوب جهاز طرد مركزي صغير، ودوامة تجمع حبة التقاط الناتجة. بعد ذلك، إضافة حجم مناسب من العينة إلى 1 ميكرولتر من حمام سباحة التقاط لتوليد 1 مرات 10 إلى 8 جسيمات بالإضافة إلى 1.2 مرات 10 إلى الخرز 5 لكل تركيز الاختبار. إضافة 1 ميكرولتر من الخرز إلى أنبوب يسمى الخرز والتحكم السلبي، وضبط حجم في كل أنبوب إلى 100 ميكرولترات مع برنامج تلفزيوني جديد.ثم ضع الأنابيب في خلاط حراري ، مع اهتزاز ، بمعدل 400 دوران في الدقيقة ، و 4 إلى 10 مئوية ، بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، نقل العينات إلى أسفل 96 لوحة جيدة جولة، وإضافة الأجسام المضادة لمعالجة الفلوريس المناسبة لكل بئر. بعد 1 ساعة حضانة في 4 إلى 10 درجة مئوية، إضافة 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني إلى كل بئر، وفتح البرمجيات اقتناء.حدد مقياس السيت ونظام بدء تشغيل البرنامج، لبدء تشغيل الصك وفتح تجربة جديدة. إنشاء قالب تجريبي، وحدد لوحة وإضافة لوحة. حدد موقف العينات على لوحة، وانقر فوق مجموعة عينة جيدا.أدخل اسم العينة في قواعد التسمية، وافتح علامة التبويب القناة، وحدد قنوات إشارة الفلوركين المناسبة. الآن تحميل لوحة في الصك. وانقر على مؤامرة نقطة، لإنشاء منطقة جديدة إلى الأمام مبعثر مقابل الجانب منطقة نقطة مبعثر مؤامرة.حدد تهيئة لبدء الليزر ومائعات وانقر فوق تشغيل لبدء عملية الاكتساب. ضبط مقياس لإظهار السكان في منتصف مؤامرة إلى الأمام مقابل الجانب مبعثر، ورسم بوابة الخرز حول مجموعة عينة كاملة لاستبعاد الحطام. انقر فوق إيقاف و نقطة مؤامرة لإنشاء ارتفاع مبعثر إلى الأمام مقابل رسم نقطة نقطة مبعثر إلى الأمام، وبوابة العينة على السكان الخرز.رسم بوابة جديدة حول أكبر عدد السكان وتسمي ذلك Singlets، وانقر فوق مؤامرة نقطة لإنشاء إشارة الفلورسنت واحد مقابل الجانب منطقة نقطة نقطة مؤامرة، لكل الفلوروفور التجريبية المستخدمة. بوابة مؤامرة نقطة جديدة على Singlets. ثم حدد عدد الأحداث التي تريد تسجيلها، ثم حدد السجل لبدء عملية الاستحواذ التجريبية.في نهاية التحليل، قم بتحميل ملفات الاكتساب في برنامج التحليل المناسب، ثم افتح بروتوكول جديد. إنشاء نقاط لكل ملف كما هو موضح فقط، وتعيين كل من محور مبعثر إلى مقياس خطي، وجميع من محور فلورسنت لمقياس السجل. ثم إظهار متوسط هندسي florescence في قنوات الإشارات ذات الصلة، لحساب التغيير الكامل في شدة الفلوريس متوسط، في مختلف الاستعدادات خارج الخلية.بعد اختبار ظروف مختلفة لتعيين أصغر كمية إجمالية من العوائل خارج الخلية للوصول إلى المرحلة الأسية المبكرة من منحنى شدة الفلورس المتوسط ، تم تحديد الحد الأدنى لعدد الجسيمات ليكون 1 مرات 10 إلى 8 جزيئات لكل تلطيخ. تم تحديد التركيز الأمثل للأجسام المضادة ل1 مرات 10 إلى 8 جزيئات لتحقيق أعلى إشارة دون ربط الأجسام المضادة غير محددة ، ليكون 10 ميكروغرام لكل ملليلتر لكل من الأجسام المضادة CD9_FITC ومضادة CD63_PE وخمس ميكروغرام لكل ملليلتر للجسم المضاد CD81_PE. لتأكيد ملاءمة الأسلوب، لتحليل كأس على شكل الحويصلات خارج الخلية، وليس الحطام الغشاء، والحويصلات خارج الخلية كانت سونيكاتيد، مما أدى إلى انخفاض في شدة الفلورس متوسط، بعد أقل من 30 ثانية من سونيكيشن، مع عدم اكتشاف فلوركينس على الإطلاق بعد دقيقة واحدة من اضطراب الميكانيكية.X تنقية الخاصة من خلايا السلف القلبية كما هو موضح، وأسفرت عن خلايا خارج الخلية، معربا عن مستويات منخفضة من CD9 ومستويات عالية من CD63 و CD81 من كل من السكان الخلية. وعلاوة على ذلك، في حين أن علامات سطح X الخاصة يمكن التعرف عليها بوضوح دون طرد فائق التركيز، فإن خطوة الإثراء هذه تعزز إلى حد كبير شدة الفلورس الوسطي لهذه العلامات. عند العمل مع الخلايا خارج الخلية، هناك أكثر من الإهمال الجسيمات نانو الكريات يمكن أن يغيب بسهولة.لذلك، من الضروري اتباع كافة الخطوات كما هو موضح في البروتوكول. استخدام الفيليات خارج الخلية كعلامة حيوية هو الآن واحد من البحوث الميدانية الأكثر الناشئة. وقريباً، قد تُترجم إلى التشخيص السريري المستخدم كأداة فحص بديلة.

Research

JoVE Journal

Biology

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

تحديد وتحليل الأسلاف محمر ماوس باستخدام CD71/TER119 التدفق cytometric الفحص

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

تقنيات لتحليل خارج الخلية الحويصلات عن طريق التدفق الخلوي

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

تنقية وتحليل Caenorhabditis elegans خارج الخلية الحويصلات

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

تحليل تتبع الجسيمات النانوية لتحديد كمي وحجم الحويصلات خارج الخلية

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

عزل وتنقية الحويصلات خارج الخلية من الإشريكية القولونية والبكتيريا الأخرى قابلة للتطوير

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

عزل وتوصيف الحويصلات خارج الخلية البكتيرية الزرقاء

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

عزل الحمض النووي الريبي الميكروي عن ثقافات الغدد اللعابية خارج الجسم الحي والحويصلات خارج الخلية

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

عزل وتحليل الحويصلات خارج الخلية التي يمكن تتبعها والوظيفية من البلازما والأنسجة الصلبة

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

عزل وتوصيف وتطبيق علاجي للحويصلات خارج الخلية من الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية المستزرعة

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...