Name: flow cytometric analysis of extracellular vesicles from cell-conditioned media
Uploaded: 2019-02-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media at JoVE.com

L.B. blev støttet af forskningsbevillinger Helmut Horten Stiftung og Velux Stiftung, Zürich (Schweiz). G.V. blev støttet af forskningsbevillinger for Swiss National Science Foundation, Cecilia-Augusta Foundation, Lugano og SHK Stiftung für Herz-und Kreislaufkrankheiten (Schweiz)

1. indsamling og behandling af konditioneret medier
<ol><li>Coat 55 cm2 petriskåle med 0,02% svin hud gelatine i PBS.</li>
	<li>Plade CPC (8.000/cm2) i præ-coatede retter med 7 mL af Iscoves modificerede Dulbecco Medium (IMDM) suppleret med 20% FBS (føtal bovint Serum) og 1% Penicillin/Streptomycin (P/S). Bemærk: Udtrykket "CPC" refererer til menneskelige eksplantat afledte celler, der har været beskrevet andetsteds14. CM kan indsamles fra forskelli...

<ol>
	<li>Barile, L., Vassalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+Therapy+delivery+tools+and+biomarkers+of+diseases.">Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. , (2017).</li><li>Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+secreted+vesicles+and+intercellular+communications.">Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications.</a> Molecular Biology Reports. 3, 15 (2011).</li><li>Yadav, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsy+in+pancreatic+cancer:+the+beginning+of+a+new+era.">Liquid biopsy in pancreatic cancer: the beginning of a new era.</a> Oncotarget. 9, 26900-26933 (2018).</li><li>Balbi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+Characterization+of+Human+Amniotic+Fluid+Stem+Cell+Extracellular+Vesicles+as+a+Powerful+Paracrine+Tool+Endowed+with+Regenerative+Potential.">First Characterization of Human Amniotic Fluid Stem Cell Extracellular Vesicles as a Powerful Paracrine Tool Endowed with Regenerative Potential.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6, 1340-1355 (2017).</li><li>Andriolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+From+Human+Cardiac+Progenitor+Cells+for+Therapeutic+Applications:+Development+of+a+GMP-Grade+Manufacturing+Method.">Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method.</a> Frontiers in Physiology. 9, (2018).</li><li>Lai, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+secreted+by+MSC+reduces+myocardial+ischemia/reperfusion+injury.">Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury.</a> Stem Cell Research. 4, (2009).</li><li>Doeppner, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles+Improve+Post-Stroke+Neuroregeneration+and+Prevent+Postischemic+Immunosuppression.">Extracellular Vesicles Improve Post-Stroke Neuroregeneration and Prevent Postischemic Immunosuppression.</a> Stem Cells Translational Medicine. 4, 1131-1143 (2015).</li><li>Kordelas, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC-derived+exosomes:+a+novel+tool+to+treat+therapy-refractory+graft-versus-host+disease.">MSC-derived exosomes: a novel tool to treat therapy-refractory graft-versus-host disease.</a> Leukemia. 28, 970-973 (2014).</li><li>Barile, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+human+cardiac+progenitor+cells+inhibit+cardiomyocyte+apoptosis+and+improve+cardiac+function+after+myocardial+infarction.">Extracellular vesicles from human cardiac progenitor cells inhibit cardiomyocyte apoptosis and improve cardiac function after myocardial infarction.</a> Cardiovascular Research. 103, 530-541 (2014).</li><li>Longatti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+affinity+single-chain+variable+fragments+are+specific+and+versatile+targeting+motifs+for+extracellular+vesicles.">High affinity single-chain variable fragments are specific and versatile targeting motifs for extracellular vesicles.</a> Nanoscale. 10, 14230-14244 (2018).</li><li>Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Microvesicles+from+Peripheral+Blood.">Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li><li>Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+analysis+of+extracellular+vesicles+using+flow+cytometry.">Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2015).</li><li>Arakelyan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Virometry+to+Analyze+Antigenic+Spectra+of+Virions+and+Extracellular+Vesicles.">Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li><li>Chimenti, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+adult+cardiac+stem/progenitor+cells+in+the+form+of+cardiospheres+from+human+cardiac+biopsies+and+murine+hearts.">Isolation and expansion of adult cardiac stem/progenitor cells in the form of cardiospheres from human cardiac biopsies and murine hearts.</a> Methods Molecular Biology. 879, 327-338 (2012).</li><li>van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry.">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nature Protocols. 7, 1311-1326 (2012).</li><li>Pospichalova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+protocol+for+flow+cytometry+analysis+of+fluorescently+labeled+exosomes+and+microvesicles+using+dedicated+flow+cytometer.">Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 25530 (2015).</li><li>van der Pol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+size+distribution+of+exosomes+and+microvesicles+determined+by+transmission+electron+microscopy,+flow+cytometry,+nanoparticle+tracking+analysis,+and+resistive+pulse+sensing.">Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12, 1182-1192 (2014).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updating+the+MISEV+minimal+requirements+for+extracellular+vesicle+studies:+building+bridges+to+reproducibility.">Updating the MISEV minimal requirements for extracellular vesicle studies: building bridges to reproducibility.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1396823 (2017).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cellular Biology. , (2006).</li><li>Suarez, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bead-assisted+flow+cytometry+method+for+the+semi-quantitative+analysis+of+Extracellular+Vesicles.">A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles.</a> Scientific Reports. 7, 11271 (2017).</li><li>Sodar, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-density+lipoprotein+mimics+blood+plasma-derived+exosomes+and+microvesicles+during+isolation+and+detection.">Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection.</a> Scientific Reports. 6, 24316 (2016).</li><li>Sluijter, J. P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+diagnostics+and+therapy+of+the+ischaemic+heart:+Position+Paper+from+the+Working+Group+on+Cellular+Biology+of+the+Heart+of+the+European+Society+of+Cardiology.">Extracellular vesicles in diagnostics and therapy of the ischaemic heart: Position Paper from the Working Group on Cellular Biology of the Heart of the European Society of Cardiology.</a> Cardiovascular Research. 114, 19-34 (2018).</li></ol>

Konventionelle FC teknik er fortsat den mest enkle analytisk metode til at karakterisere markører udtrykkes på overfladen af EV. I denne henseende, er at vælge den mest hensigtsmæssige protokol afgørende for at få nyttige oplysninger om individuelle partikel fraktioner af interesse ved at undgå begrænsninger på grund af instrument følsomhed. Vi beskrevet en metode, ved hjælp af magnetiske partikler kombineret med antistoffer, der genkender Exo og små EV overflade antigener, som er egnet til downstream FC ans?...

Celler udskiller ekstracellulære vesikler (EV) i forskellige størrelser, herunder microvesicles (MV) og exosomes (Exo). Sidstnævnte kan skelnes fra MV ved både størrelse og subcellulært rummet af oprindelse. MV (200-1000 nm i størrelse) frigives fra overordnede celler ved at udgyde fra plasmamembran. Omvendt Exo (30-150 nm) stammer fra endosomal membraner og er udgivet i det ekstracellulære rum, når de multivesicular organer (MVB) fuse med cellemembranen1,2.
EV i stigende grad bruges som diagnostisk biomarkører så godt som, potentielt, terapeutiske værktøjer på mange områder herunder onkologi, neurologi, kardiologi og bevægeapparatet sygdomme3,4,5. Et stort flertal af igangværende undersøgelser ved hjælp af EV som terapeutiske agenter udnytter isolation af vesikler fra celle-aircondition medium (CM) af in vitro-kulturperler celler. Mesenchymale stamceller (msc) udøve gavnlige virkninger i flere sammenhænge, og MSC-afledte EV har vist fordele i modeller af Myokardie iskæmi/reperfusion skade6 og hjerne skade7. MSC-afledte EV også udviser immun modulerende aktiviteter, der kan udnyttes til at behandle immun afvisning, som påvist i en model af terapi-ildfaste graft - versus - host-sygdommen8. Fostervand væske stamceller (hAFS) aktivt berige CM MVs og Exo, uensartet fordelt i størrelse (50-1000 nm), der mægle flere biologiske effekter, såsom spredning af differentierede celler, angiogenese, hæmning af fibrose, og cardioprotection4. Vi har for nylig vist, at EV, og især Exo, udskilles af menneskelige hjerte-afledte stamceller (Exo-CPC) reducere Myokardie infarkt størrelse i rotter5,9.
EXO deler et fælles sæt af proteiner på deres overflade, herunder tetraspanins (CD63, CD81, CD9) og store histocompatibility komplekse klasse I (MHC-jeg). Ud over denne fælles proteiner, Exo også indeholder proteiner specifikke for EV delmængde af typen producent celle. EXO markører få afgørende betydning, fordi de spiller en afgørende rolle i Inter cellulære kommunikation, derved regulere mange biologiske processer5,10. På grund af deres lille størrelse, at finde en nem måde at analysere EV ved hjælp af klassisk flow flowcytometri (FC) forbliver en udfordrende opgave.
Vi præsenterer her, en forenklet protokol for EV analyse ved hjælp af FC, som kan anvendes til pre beriget prøver gennem ultracentrifugering eller direkte til CM (figur 1). Metoden bruger perler belagt med en bestemt antistof, der bindes kanoniske Exo-associerede overflade epitoper (CD63, CD9, CD81) uden yderligere vasker. FC analyser kan udføres ved hjælp af en konventionel Flowcytometret uden behov for justeringer før målinger. Metoder til karakterisering af antigener på enkelte små partikler ved hjælp af flow cytometers har været beskrevet af andre grupper med hensyn til forskellige applikationer11,12,13. Her, brugte vi functionalized magnetiske perler til fangst af små partikler og Exo, efterfulgt af fænotyper fanget partikler af FC. Selv om denne metode kan bruges til at karakterisere antigene sammensætning af små blærer udgivet af enhver in vitro-celletype, givet her vi specifikke celle kultur betingelser, der gælder for kulturen i menneskers hjerte stamceller (CPC) og mest passende miljø til produktion af EV af disse celler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:816px;" width="816">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:369px;">IMDM</td>
			<td style="width:113px;">Gibco</td>
			<td style="width:235px;">12440061</td>
			<td style="width:99px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100&#160;kDa&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CytoFlex, Flow Cytometer Platform</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>CytoFlex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21063045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s PBS (PBS) Ca- and Mg-free</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-512F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExoCap CD63 Capture Kit</td>
			<td>JSR Life Sciences</td>
			<td>Ex-C63-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExoCap CD81 Capture Kit</td>
			<td>JSR Life Sciences</td>
			<td>Ex-C81-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExoCap CD9 Capture Kit</td>
			<td>JSR Life Sciences</td>
			<td>Ex-C9-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Exosome-Depleted FBS</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A2720801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Exosome-depleted FBS Media Supplement</td>
			<td>SBI</td>
			<td>EXO-FBS-250A-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS-Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-human CD9 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>312104&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; RRID: AB_2075894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow Cytometer analysis software</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Kaluza</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoSight LM10</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NanoSight LM10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoSight Software</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NTA 2.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optima Max-XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE anti-human CD63 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>353004&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; RRID:AB_10897809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE anti-human CD81 (TAPA-1) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>349505&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; RRID:AB_10642024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermomixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382 000 015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">TLA-110</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>TLA-110 rotors</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of extracellular vesicles from cell-conditioned media

Flowcytometri (FC) er den foretrukne metode til semi-kvantitative målinger af celle-overflade antigen markører. For nylig, denne teknik er blevet brugt for fænotypiske analyser af ekstracellulære vesikler (EV) herunder exosomes (Exo) i det perifere blod og andre kropsvæsker. Den lille størrelse af EV mandater brugen af dedikerede instrumenter at have en påvisningsgrænse omkring 50-100 nm. Alternativt, EV kan være bundet til latex microbeads, der kan registreres af FC. Microbeads, konjugeret med antistoffer, der genkender EV-associerede markører/klynge af differentiering CD63, CD9 og CD81 kan bruges til EV capture. EXO isoleret fra CM kan analyseres med eller uden forudgående berigelse af ultracentrifugering. Denne fremgangsmåde er egnet til EV analyser ved hjælp af konventionelle FC instrumenter. Vores resultater viser en lineær korrelation mellem betyde fluorescens intensitet (MFI) værdier og EV koncentration. Forstyrre EV gennem sonikering dramatisk faldt MFI, der angiver, at metoden ikke registrerer membran rester. Vi rapporterer en nøjagtig og pålidelig metode til analyse af EV overflade antigener, som nemt kan implementeres i alle laboratorier.

Samlede antal partikler for enkelt farvning
Da en enkelt perle kan binde mere end én partikel, testede vi forskellige betingelser for at angive den mindste samlede EV (enkelt antistof pr tube) at nå frem til den tidlige eksponentielle fase af MFI kurve. En bestemt koncentration af antistof blev brugt mens det samlede antal partikler varierede fra 5 x 105 til 2,5 x 108. Som vist i <strong ...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media at JoVE.com

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Protokollen beskriver en reproducerbar metode udviklet til brug med celle kultur analysere at opdage overflade epitoper på små ekstracellulære vesikler (EV). Det udnytter specifikke EV immunoprecipitation ved hjælp af perler kombineret med antistoffer, der genkender overflade antigen CD9, CD63 og CD81. Metoden er optimeret til downstream flow flowcytometri analyse.

Flow Cytometric analyse af ekstracellulære vesikler fra celle-aircondition medier

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Ekstracellulære vesikler bruges i stigende grad som en diagnostisk biomarkør og potentielt terapeutisk værktøj på mange områder. Flow Cytometric er den mest ligetil analytiske metode til at karakterisere ved kulør står markører denne protokol kan bruges til at analysere en assized partikel, er hurtig, og gælder for konventionelle seismometre uden behov for særlig indstilling eller den dedikerede instrument. Selv om denne protokol bruges til at kategorisere ekstracellulære vesikler fra nævnte tilstand og medium, Det kan udvides til kategorisering af blod ankom AVs, at erstatte invasive væv biopsier hos patienter.For forskere nye til protokollen, er det afgørende at udføre trin, der er beskrevet i set-up metode sektion, og nøje følge de demonstrerede få strategier Begynd med belægning 55 centimeter kvadrerede petriskåle med 02% svineskind gelatine, i PBS. Efter 15 minutter vaskes skålen og pladen 4,4 gange 10 til de femte hjertefogenitorceller på hver skål i 7 milliliter af Iscoves Modified Dulbecco's Medium eller IMDM, suppleret med 20% føtalt kvægserum og 1% penicillin og streptomycin for deres inkubation ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. Når cellerne når omkring 80% sammenløb, vaskes kulturerne to gange med Dulbeccos PBS uden calcium og magnesium og fodres cellerne med 10 milileters af serumfrit exosom produktionsmedium.Efter 7 dage, pool det konditionerede medium fra hver plade, i en enkelt polypropylen centrifuge rør og centrifuge mediet for at fjerne eventuelle cellerester. Overfør supernatenten i en 100 kilodalton centrifuge filter rør, Og koncentrere den ryddede, konditioneret, medium med en ekstra centrifugering. Koncentratet overføres til et mikrocentrifugerør til en sidste centrifugering af bænk og tilsættes supernatenten i et polycarbonat tykt mikrocentrifugerør.Fyld røret med PBS, til et endeligt volumen på 3,2 milileters, og læg prøven i en titanium fast engle rotor. Læg derefter rotoren i en bordplade ultracentrifuge for ultracentrifugering, og resuspend pellet i 100 mikroliter af frisk PBS. Til nanopartikelsporing og analysekvantificering fortyndes 1 mikroliter af den ultracentrifugerede prøve i 999 mikroliter PBS, og prøven indlæses i en 1 mililetersprøjt uden bobler.Læg sprøjten i indløbsporten i undersøgelseskammeret, og tænd for laseren. Brug optageknappen til at åbne kameraet, og juster fokus. Derefter optage mindst tre forskellige rammer på 60 sekunder hver, og bruge batch-processen mulighed i softwaren, til at analysere de tre forskellige erhvervelser.For at forberede prøven til erhvervelse, først tilføje den relevante eksperimentelle monoklonale antistof konjugerede fange perler på en 1:1:1 forhold, i en mikro centrifuge rør, og vortex den resulterende fange perle pool. Dernæst tilsættes det passende volumen af prøven til 1 mikroliter af indfangningsperlepulje for at generere en 1 gange 10 til de 8 partikler plus 1,2 gange 10 til 5. Tilføj 1 mikroliter af perler til et rør mærket perler som den negative kontrol, og justere lydstyrken i hvert rør til 100 mikroliter med frisk PBS.Derefter placere rørene i en termo mixer, med omrystning, ved 400 rotationer i minuttet, og 4 til 10 Celsius, natten over. Den næste dag, overføre prøverne til en rund bund 96 godt plade, og tilsæt de relevante florescence konjugerede antistoffer til hver brønd. Efter en 1 timers inkubation ved 4 til 10 grader Celsius, tilføje 100 mikroliter af PBS til hver brønd, og åbne erhvervelse software.Vælg cytometer og system opstart program, for at starte instrumentet og åbne et nyt eksperiment. Opret en eksperimentel skabelon, og vælg plade og tilføj plade. Vælg placeringen af prøverne på pladen, og klik også som prøvesæt.Angiv eksempelnavnet i navngivningsreglerne, åbn kanalfanen, og vælg de relevante lyssignalkanaler. Læg nu pladen i instrumentet. Og klik prik plot, for at skabe en ny fremad scatter område versus side scatter område prik plot.Vælg initialiser for at starte laseren og fluidics og klik køre for at starte erhvervelsen. Juster skalaen for at vise populationen i midten af det fremadrettede versus side scatter plot, og tegn en perler port omkring hele prøven befolkning for at udelukke snavs. Klik stop og prik plot for at skabe en fremad scatter højde versus fremad scatter område prik plot, og gate prøven på perlerne befolkning.Tegn en ny port rundt om større befolkning og navngive det Singlets, og klik prik plot for at skabe en fluorescerende signal versus side scatter område prik plot, pr eksperimentel fluorophore anvendes. Gate den nye prik plot på Singlets. Vælg derefter det antal hændelser, der skal registreres, og vælg post for at starte forsøgsopekøbet.I slutningen af analysen skal du indlæse anskaffelsesfilerne i den relevante analysesoftware og åbne en ny protokol. Opret punktdiagrammer for hver fil, som det netop er påvist, og indstil hele punktaksen til lineær skala og alle lysstofaksen for at logge skalaen. Derefter vises florescence geometriske middel i de relevante signaler kanaler, at beregne den fulde ændring i gennemsnitlige florescence intensitet, i de forskellige ekstracellulære vesicle præparater.Efter at have testet forskellige betingelser for at indstille den mindste samlede mængde ekstracellulære vesikler for at nå den tidlige eksponentielle fase af en gennemsnitlig florescence intensitet kurve, det mindste antal partikler blev bestemt til at være 1 gange 10 til de 8 partikler pr farvning. Den optimale koncentration af antistof i 1 gange 10 til de 8 partikler for at opnå det højeste signal uden uspecifikke antistofbinding, blev bestemt til at være 10 mikrogram pr. milliliter for både anti CD9_FITC og anti CD63_PE antistoffer og fem mikrogram pr. milliliter for anti CD81_PE antistof. For at bekræfte metodens egnethed, til analyse af kopformede ekstracellulære vesikler og ikke membranrester, blev de ekstracellulære vesikler sonikeret, hvilket resulterede i et fald i den gennemsnitlige lysintensitet efter så lidt som 30 sekunders sonikering, uden at der overhovedet blev opdaget lysér efter et minuts mekanisk afbrydelse.X's egen rensning fra hjertekomgenitorceller som påvist giver ekstracellulære vesikler, der udtrykker lave niveauer af CD9 og høje niveauer af CD63 og CD81 fra begge cellepopulationer. Selv om X's egne overflademarkører tydeligt kan identificeres uden ultracentrifugering, øger dette berigelsestrin i høj grad disse markørers gennemsnitlige florescenceintensitet. Når du arbejder med ekstracellulære vesikler, er der mere skødesløse nanopartikelpiller, der let kan gå glip af.Derfor er det vigtigt at følge alle trin, som det fremgår af protokollen. Brug af ekstracellulære vesikler som biomarkør er nu en af de mest nye feltforskning. Og snart, kan oversættes til den kliniske diagnostiske anvendes som en alternativ screening værktøj.

Research

JoVE Journal

Biology

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Teknikker til analyse af ekstracellulær Vesikler anvendelse af flowcytometri

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Rensning og analyse af Caenorhabditis elegans Ekstracellulære Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

Nanopartikler Tracking Analyse for kvantificering og størrelse bestemmelse af ekstracellulære vesikler

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Skalerbar isolering og oprensning af ekstracellulære vesikler fra Escherichia coli og andre bakterier

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

Isolering og karakterisering af cyanobakterielle ekstracellulære vesikler

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolering af mikroRNA'er fra Tick Ex Vivo spytkirtelkulturer og ekstracellulære vesikler

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

Isolering og analyse af sporbare og funktionaliserede ekstracellulære vesikler fra plasma og fast væv

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Isolering, karakterisering og terapeutisk anvendelse af ekstracellulære vesikler fra dyrkede humane mesenkymale stamceller

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...