Name: flow cytometric analysis of extracellular vesicles from cell-conditioned media
Uploaded: 2019-02-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media at JoVE.com

L.B. werd gesteund door onderzoekssubsidies van Helmut Horten Stiftung en Velux Stiftung, Zurich (Zwitserland). G.V. werd gesteund door onderzoekssubsidies van Zwitserse National Science Foundation, de Cecilia-Augusta-Stichting, Lugano en de SHK Stiftung für Herz-und Kreislaufkrankheiten (Zwitserland)

1. verzameling en verwerking van geconditioneerde Media
<ol><li>Jas 55 cm2 petrischaaltjes met 0,02% varkens huid gelatine in PBS.</li>
	<li>Plaat (8000/cm2) CPC in vooraf gecoate gerechten met 7 mL van Iscove van bewerkt Dulbecco Medium (IMDM) aangevuld met 20% FBS (foetale runderserum) en 1% penicilline/streptomycine (P/S). Opmerking: De term "CPC" verwijst naar menselijke explant afgeleide cellen die al beschreven elders14. CM kan worden verzameld van...

<ol>
	<li>Barile, L., Vassalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+Therapy+delivery+tools+and+biomarkers+of+diseases.">Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. , (2017).</li><li>Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+secreted+vesicles+and+intercellular+communications.">Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications.</a> Molecular Biology Reports. 3, 15 (2011).</li><li>Yadav, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsy+in+pancreatic+cancer:+the+beginning+of+a+new+era.">Liquid biopsy in pancreatic cancer: the beginning of a new era.</a> Oncotarget. 9, 26900-26933 (2018).</li><li>Balbi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+Characterization+of+Human+Amniotic+Fluid+Stem+Cell+Extracellular+Vesicles+as+a+Powerful+Paracrine+Tool+Endowed+with+Regenerative+Potential.">First Characterization of Human Amniotic Fluid Stem Cell Extracellular Vesicles as a Powerful Paracrine Tool Endowed with Regenerative Potential.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6, 1340-1355 (2017).</li><li>Andriolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+From+Human+Cardiac+Progenitor+Cells+for+Therapeutic+Applications:+Development+of+a+GMP-Grade+Manufacturing+Method.">Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method.</a> Frontiers in Physiology. 9, (2018).</li><li>Lai, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+secreted+by+MSC+reduces+myocardial+ischemia/reperfusion+injury.">Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury.</a> Stem Cell Research. 4, (2009).</li><li>Doeppner, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles+Improve+Post-Stroke+Neuroregeneration+and+Prevent+Postischemic+Immunosuppression.">Extracellular Vesicles Improve Post-Stroke Neuroregeneration and Prevent Postischemic Immunosuppression.</a> Stem Cells Translational Medicine. 4, 1131-1143 (2015).</li><li>Kordelas, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC-derived+exosomes:+a+novel+tool+to+treat+therapy-refractory+graft-versus-host+disease.">MSC-derived exosomes: a novel tool to treat therapy-refractory graft-versus-host disease.</a> Leukemia. 28, 970-973 (2014).</li><li>Barile, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+human+cardiac+progenitor+cells+inhibit+cardiomyocyte+apoptosis+and+improve+cardiac+function+after+myocardial+infarction.">Extracellular vesicles from human cardiac progenitor cells inhibit cardiomyocyte apoptosis and improve cardiac function after myocardial infarction.</a> Cardiovascular Research. 103, 530-541 (2014).</li><li>Longatti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+affinity+single-chain+variable+fragments+are+specific+and+versatile+targeting+motifs+for+extracellular+vesicles.">High affinity single-chain variable fragments are specific and versatile targeting motifs for extracellular vesicles.</a> Nanoscale. 10, 14230-14244 (2018).</li><li>Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Microvesicles+from+Peripheral+Blood.">Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li><li>Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+analysis+of+extracellular+vesicles+using+flow+cytometry.">Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2015).</li><li>Arakelyan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Virometry+to+Analyze+Antigenic+Spectra+of+Virions+and+Extracellular+Vesicles.">Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li><li>Chimenti, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+adult+cardiac+stem/progenitor+cells+in+the+form+of+cardiospheres+from+human+cardiac+biopsies+and+murine+hearts.">Isolation and expansion of adult cardiac stem/progenitor cells in the form of cardiospheres from human cardiac biopsies and murine hearts.</a> Methods Molecular Biology. 879, 327-338 (2012).</li><li>van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry.">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nature Protocols. 7, 1311-1326 (2012).</li><li>Pospichalova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+protocol+for+flow+cytometry+analysis+of+fluorescently+labeled+exosomes+and+microvesicles+using+dedicated+flow+cytometer.">Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 25530 (2015).</li><li>van der Pol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+size+distribution+of+exosomes+and+microvesicles+determined+by+transmission+electron+microscopy,+flow+cytometry,+nanoparticle+tracking+analysis,+and+resistive+pulse+sensing.">Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12, 1182-1192 (2014).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updating+the+MISEV+minimal+requirements+for+extracellular+vesicle+studies:+building+bridges+to+reproducibility.">Updating the MISEV minimal requirements for extracellular vesicle studies: building bridges to reproducibility.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1396823 (2017).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cellular Biology. , (2006).</li><li>Suarez, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bead-assisted+flow+cytometry+method+for+the+semi-quantitative+analysis+of+Extracellular+Vesicles.">A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles.</a> Scientific Reports. 7, 11271 (2017).</li><li>Sodar, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-density+lipoprotein+mimics+blood+plasma-derived+exosomes+and+microvesicles+during+isolation+and+detection.">Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection.</a> Scientific Reports. 6, 24316 (2016).</li><li>Sluijter, J. P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+diagnostics+and+therapy+of+the+ischaemic+heart:+Position+Paper+from+the+Working+Group+on+Cellular+Biology+of+the+Heart+of+the+European+Society+of+Cardiology.">Extracellular vesicles in diagnostics and therapy of the ischaemic heart: Position Paper from the Working Group on Cellular Biology of the Heart of the European Society of Cardiology.</a> Cardiovascular Research. 114, 19-34 (2018).</li></ol>

Conventionele FC techniek blijft de meest eenvoudige analytische methode te karakteriseren markeringen uitgedrukt op het oppervlak van EV. In dit verband is het meest geschikte protocol selecteren cruciaal voor het verkrijgen van nuttige informatie over individuele deeltjes breuken van belang door het vermijden van beperkingen als gevolg van gevoeligheid van het instrument. We beschreven een methode met behulp van magnetische deeltjes in combinatie met de antilichamen die Exo en kleine EV oppervlakte antigenen die geschi...

Cellen afscheiden extracellulaire blaasjes (EV) van verschillende grootte, met inbegrip van microvesicles (MV) en exosomes (Exo). De laatste kan worden onderscheiden van MV door zowel de grootte als de subcellular compartiment van herkomst. MV (200-1000 nm in grootte) worden vrijgegeven uit bovenliggende cellen door het vergieten van het plasma-membraan. Omgekeerd, Exo (30 – 150 nm) zijn afkomstig uit de endosomal membranen en worden vrijgegeven in de extracellulaire ruimte wanneer de multivesicular instanties (MVB) zekering met de celmembraan1,2.
EV worden steeds meer gebruikt als diagnostische biomarkers zo goed als, potentieel, therapeutische instrumenten op veel gebieden zoals oncologie, neurologie, cardiologie en musculoskeletale aandoeningen3,4,5. Een overgrote meerderheid van lopende studies met behulp van de EV als therapeutische middelen het isolement van de blaasjes van cel-geconditioneerd medium (CM) van de in vitro gekweekte cellen benutten. Mesenchymale stamcellen (MSCs) uitoefenen gunstige effecten in verschillende contexten, en MSC-afgeleide EV voordelen in modellen van myocardiale ischemie/reperfusie letsel6 en hersenen verwonding7hebben aangetoond. MSC-afgeleide EV vertonen ook immuun f activiteiten die kunnen worden benut om de behandeling van de verwerping van het immuunsysteem, zoals aangetoond in een model van therapie-vuurvaste graft - versus - host-ziekte8. Vruchtwater vloeistof stamcellen (hAFS) actief verrijken CM met MVs en Exo, ongelijkmatig verdeeld in grootte (50 – 1.000 nm), die verschillende biologische effecten, zoals verspreiding van gedifferentieerde cellen, angiogenese, remming van de fibrose, bemiddelen en cardioprotection4. Wij hebben onlangs aangetoond dat EV, en met name Exo, uitgescheiden door menselijke cardiale afkomstige voorlopercellen (Exo-CPC) verkleinen myocardiale infarct in ratten5,9.
Exo delen een gemeenschappelijke set van eiwitten op hun oppervlak, met inbegrip van tetraspanins (CD63, CD81, CD9) en grote histocompatibility complex klasse I (MHC-ik). Naast deze gemeenschappelijke set van eiwitten, Exo bevatten ook eiwitten specifiek voor de EV subset van het celtype producent. Exo-markeringen zijn vaandel wint, omdat ze een cruciale rol in de Inter cellulaire communicatie spelen, waardoor vele biologische processen5,10te reguleren. Vanwege het kleine formaat, het vinden van een gemakkelijke manier om het analyseren van de EV met behulp van klassieke stroom cytometry (FC) blijft een uitdagende taak.
Hier presenteren we een vereenvoudigde protocol voor EV-analyse met behulp van FC, die kan worden toegepast op verkregen via ultracentrifugatie vooraf verrijkte monsters of rechtstreeks naar CM (Figuur 1). Zonder extra wasbeurten gebruikt de methode kralen bedekt met een specifiek antilichaam dat canonieke Exo-geassocieerde oppervlakte epitopes (CD63, CD9, CD81 bindt). FC analyses kunnen worden uitgevoerd met behulp van een conventionele cytometer met geen noodzaak van aanpassingen voorafgaand aan metingen. Methoden voor de karakterisatie van antigenen op individuele kleine deeltjes met behulp van flow cytometers zijn beschreven door andere fracties met betrekking tot diverse toepassingen11,-12,13. Hier, we matiemaatschappij magnetische kralen gebruikt voor het vangen van kleine deeltjes en Exo, gevolgd door fenotypering van gevangen deeltjes door FC. Hoewel deze methode kan worden gebruikt voor het karakteriseren van de antigene samenstelling van kleine blaasjes uitgebracht door elk celtype in vitro, mits hier we specifieke cel cultuur voorwaarden die van toepassing zijn voor de cultuur van menselijke cardiale voorlopercellen (CPC) en de meeste passende omgeving voor de productie van de EV door deze cellen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:816px;" width="816">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:369px;">IMDM</td>
			<td style="width:113px;">Gibco</td>
			<td style="width:235px;">12440061</td>
			<td style="width:99px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100&#160;kDa&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CytoFlex, Flow Cytometer Platform</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>CytoFlex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21063045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s PBS (PBS) Ca- and Mg-free</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-512F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExoCap CD63 Capture Kit</td>
			<td>JSR Life Sciences</td>
			<td>Ex-C63-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExoCap CD81 Capture Kit</td>
			<td>JSR Life Sciences</td>
			<td>Ex-C81-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExoCap CD9 Capture Kit</td>
			<td>JSR Life Sciences</td>
			<td>Ex-C9-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Exosome-Depleted FBS</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A2720801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Exosome-depleted FBS Media Supplement</td>
			<td>SBI</td>
			<td>EXO-FBS-250A-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS-Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-human CD9 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>312104&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; RRID: AB_2075894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow Cytometer analysis software</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Kaluza</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoSight LM10</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NanoSight LM10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoSight Software</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NTA 2.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optima Max-XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE anti-human CD63 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>353004&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; RRID:AB_10897809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE anti-human CD81 (TAPA-1) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>349505&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; RRID:AB_10642024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermomixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382 000 015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">TLA-110</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>TLA-110 rotors</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of extracellular vesicles from cell-conditioned media

Stroom cytometry (FC) is de methode van keuze voor semi-kwantitatieve meting van celoppervlak antigeen markers. Onlangs, is deze techniek gebruikt voor analyses van de fenotypische van extracellulaire blaasjes (EV) met inbegrip van exosomes (Exo) in het perifere bloed en andere lichaamsvloeistoffen. De kleine grootte van EV mandaten het gebruik van speciale instrumenten met een detectie-drempel rond 50-100 nm. EV kan als alternatief worden gebonden aan latex microbeads die kunnen worden gedetecteerd door FC. Microbeads, geconjugeerd met antilichamen die EV-geassocieerde markeringen/Cluster van differentiatie CD63, CD9 en CD81 herkent kunnen worden gebruikt voor het vastleggen van de EV. Exo geïsoleerd van CM kan met of zonder pre verrijking door ultracentrifugatie worden geanalyseerd. Deze aanpak is geschikt voor EV analyses met behulp van conventionele FC instrumenten. Onze resultaten tonen aan dat een lineaire correlatie tussen bedoel fluorescentie intensiteit (MFI) waarden en EV concentratie. EV verstoren door ultrasoonapparaat dramatisch gedaald MFI, die aangeeft dat de methode geen membraan puin detecteert. Wij rapporteren een nauwkeurige en betrouwbare methode voor de analyse van EV oppervlakte antigenen, die eenvoudig kan worden geïmplementeerd in een laboratorium.

Totaal aantal deeltjes voor één kleuring
Aangezien een enkele kraal meer dan één deeltje binden kan, testten we verschillende voorwaarden om in te stellen van de kleinste hoeveelheid totale EV (één antilichaam per buis) tot de vroege exponentiële fase van MFI-curve. Een vaste concentratie van antilichaam werd gebruikt terwijl het totale aantal deeltjes varieerden van 5 x 10,5 tot en met 2.5 x 1...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media at JoVE.com

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Het protocol wordt een reproduceerbare methode ontworpen voor gebruik met cel cultuur supernatant voor het opsporen van oppervlakte epitopes op kleine extracellulaire blaasjes (EV) beschreven. Het maakt gebruik van specifieke EV immunoprecipitation met parels in combinatie met de antilichamen die surface antigeen CD9 herkent, CD63, en CD81. De methode is geoptimaliseerd voor downstream stroom cytometry analyse.

Cytometrische analyse van extracellulaire blaasjes van cel-geconditioneerd Media stromen

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Extracellulaire vesicles worden steeds vaker gebruikt als een diagnostische biomarker en potentiële therapeutische tool op vele veld. Flow Cytometric is de meest rechttoe rechtaan analytische methode voor het karakteriseren door pak geconfronteerd markers dit protocol kan worden gebruikt bij het analyseren van een assized deeltje, is snel, en is van toepassing op conventionele seismometers zonder de noodzaak van speciale instelling of het speciale instrument. Hoewel dit protocol wordt gebruikt om extracellulaire vesikels te categoriseren van genoemde aandoening en medium, kan het worden uitgebreid naar categorisering van bloed aangekomen AVs, ter vervanging van invasieve weefselbiopten bij patiënten.Voor onderzoekers die nieuw zijn in het protocol, is het van cruciaal belang om stappen uit te voeren die in de sectie set-upmethode worden beschreven, en om de aangetoonde opsporingsstrategieën op de voet te volgen Begin met het coaten van 55 centimeter kwadraat Petri-gerechten met 02%varkenshuidgelatine, in PBS. Na 15 minuten was je de schotel en plaat 4,4 keer 10 tot de vijfde hartvererver cellen op elk gerecht in 7 milliliter van Iscove's Modified Dulbecco's Medium, of IMDM, aangevuld met 20%foetaal runderserum, en 1%penicilline en streptomycine voor hun incubatie bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide. Wanneer de cellen ongeveer 80% samenvloeiing bereiken, was de culturen twee keer met Dulbecco's PBS zonder calcium en magnesium en voer de cellen met 10 milileters serumvrij exosoomproductiemedium.Vermeer na 7 dagen het geconditioneerde medium van elke plaat in één polypropyleencentrifugebuis en centrifugeer het medium om celafval te verwijderen. Breng de supernatent in een 100 kilodalton centrifuge filter buis, En concentraat de gewist, geconditioneerd, medium met een extra centrifugatie. Breng het concentraat in een microcentrifugebuis voor een laatste benchtop centrifugatie en voeg de supernatent toe in een polycarbonaat dikke wandmicrocentrifugebuis.Vul de buis met PBS, tot een uiteindelijk volume van 3,2 milileters, en laad het monster in een titanium vaste angeled rotor. Laad vervolgens de rotor in een tafelblad ultracentrifuge voor ultracentrifugatie, en resuspend de pellet in 100 microliters van verse PBS. Voor nanodeeltjestracking en analyse kwantificering verdunt u 1 microliter van het ultracentrifuged monster, in 999 microliters PBS, en laad het monster in een 1 milileter spuit zonder bellen.Laad de spuit in de inlaatpoort van de onderzoekskamer en zet de laser aan. Gebruik de opnameknop om de camera te openen en de scherpstelling aan te passen. Neem vervolgens ten minste drie verschillende frames van elk 60 seconden op en gebruik de batchprocesoptie in de software om de drie verschillende acquisities te analyseren.Om het monster voor te bereiden op de verwerving, voeg eerst de juiste experimentele monoklonale antilichaam geconjugeerde vangkralen toe met een verhouding van 1:1:1, in een microcentrifugebuis en draaikolk de resulterende vangkralen. Voeg vervolgens het juiste volume van het monster toe aan 1 microliter van de afvang van de kraal om een 1 keer 10 te genereren tot de 8 deeltjes plus 1,2 keer 10 tot de 5e kralen per testconcentratie. Voeg 1 microliter kralen toe aan een buis met het label kralen als de negatieve controle, en pas het volume in elke buis aan op 100 microliters met verse PBS.Plaats vervolgens de buizen in een thermomixer, met schudden, op 400 rotaties per minuut, en 4 tot 10 Celsius, 's nachts. De volgende dag, breng de monsters naar een ronde bodem 96 goed plaat, en voeg de juiste florescence geconjugeerde antilichamen aan elke put. Na een incubatie van 1 uur bij 4 tot 10 graden Celsius voegt u 100 microliters PBS toe aan elke put en opent u de acquisitiesoftware.Selecteer cytometer- en systeemopstartprogramma om het instrument te starten en een nieuw experiment te openen. Maak een experimentele sjabloon en selecteer plaat en voeg plaat toe. Selecteer de positie van de monsters op de plaat en klik ook op set als voorbeeld.Voer de voorbeeldnaam in de naamgevingsregels in, open het kanaaltabblad en selecteer de juiste floessiesignaalkanalen. Laad nu de plaat in het instrument. En klik op puntplot, om een nieuw voorwaarts strooigebied versus zijverstringsgebied puntplot te maken.Selecteer initialiseren om de laser en de fluidics te starten en klik op uitvoeren om de acquisitie te starten. Pas de schaal aan om de populatie in het midden van de voorwaartse versus zijverstrooiingsplot weer te geven en teken een kralenpoort rond de hele steekproefpopulatie om het puin uit te sluiten. Klik op stop en puntplot om een voorwaartse spreidingshoogte te maken versus het puntpuntplot voor voorwaartse verspreidingsgebied en poort het monster op de kralenpopulatie.Teken een nieuwe poort rond de grotere bevolking en noem het Singlets, en klik op punt plot om een fluorescerend signaal versus kant scatter gebied dot plot te creëren, per experimentele fluorofolaat gebruikt. Gate de nieuwe stip plot op de Singlets. Selecteer vervolgens het aantal gebeurtenissen dat u wilt opnemen en selecteer record om de experimentele acquisitie te starten.Aan het einde van de analyse laadt u de acquisitiebestanden in de juiste analysesoftware en opent u een nieuw protocol. Maak stipplospunten voor elk bestand zoals dat zojuist is aangetoond en stel alle spreidingsas in op lineaire schaal en alle tl-as op logschaal. Toon vervolgens het geometrische gemiddelde van de bloei in de relevante signalenkanalen, om de volledige verandering in gemiddelde florescentieintensiteit te berekenen, in de verschillende extracellulaire blaasjespreparaten.Na het testen van verschillende omstandigheden om de kleinste totale hoeveelheid extracellulaire vesikels in te stellen om de vroege exponentiële fase van een gemiddelde florescentieintensiteitscurve te bereiken, werd het minimumaantal deeltjes vastgesteld op 1 keer 10 tot de 8 deeltjes per kleuring. De optimale concentratie van antilichamen voor 1 keer 10 tot de 8 deeltjes om het hoogste signaal te bereiken zonder niet-specifieke antilichaambinding, werd vastgesteld op 10 microgram per milliliter voor zowel anti-CD9_FITC als anti-CD63_PE antilichamen en vijf microgram per milliliter voor het anti-CD81_PE antilichaam. Om de geschiktheid van de methode te bevestigen, voor het analyseren van cupvormige extracellulaire vikjes, en niet membraanpuin, werden de extracellulaire vikjes gesoniceerd, wat resulteerde in een afname van de gemiddelde bloeiintensiteit, na slechts 30 seconden van sonicatie, zonder dat de floresescentie na één minuut mechanische verstoring werd gedetecteerd.X's eigen zuivering van cardiale voorlopercellen zoals aangetoond, levert extracellulaire vikjes, het uitdrukken van lage niveaus van CD9 en hoge niveaus van CD63 en CD81 van beide celpopulaties. Bovendien, terwijl X's eigen oppervlak markers zijn duidelijk herkenbaar zonder ultracentrifugatie, deze verrijking stap sterk verbetert de gemiddelde florescentie intensiteit van deze markers. Bij het werken met extracellulaire vesicles, er is meer onzorgvuldig nano deeltjes pellets kunnen gemakkelijk worden gemist.Daarom is het essentieel om alle stappen te volgen zoals aangetoond in het protocol. Het gebruik van extracellulaire vesicles als biomarker is nu een van de meest opkomende veldonderzoek. En binnenkort, kan worden vertaald in de klinische diagnostische gebruikt als een alternatieve screening tool.

Research

JoVE Journal

Biology

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

Identificatie en analyse van de muis erytroïde voorouders met behulp van de CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Technieken voor de Analyse van de extracellulaire blaasjes Met behulp van flowcytometrie

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Zuivering en analyse van Caenorhabditis elegans Extracellular Blaasjes

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

Nanodeeltjes tracking analyse voor de kwantificering en groottebepaling van extracellulaire blaasjes

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Schaalbare isolatie en zuivering van extracellulaire blaasjes van Escherichia coli en andere bacteriën

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

Isolatie en karakterisering van cyanobacteriële extracellulaire blaasjes

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolatie van microRNA's van Tick Ex Vivo Speekselklierculturen en Extracellulaire Blaasjes

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

Isolatie en analyse van traceerbare en gefunctionaliseerde extracellulaire blaasjes uit het plasma en vaste weefsels

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Isolatie, karakterisering en therapeutische toepassing van extracellulaire blaasjes uit gekweekte menselijke mesenchymale stamcellen

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...