Name: flow cytometric analysis of extracellular vesicles from cell-conditioned media
Uploaded: 2019-02-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media at JoVE.com

L.b. wurde von Forschungsstipendien der Helmut Horten Stiftung und Velux Stiftung, Zürich (Schweiz) unterstützt. G.V wurde von Forschungsstipendien des Schweizerischen Nationalfonds, die Cecilia-Augusta-Stiftung, Lugano und der SHK-Stiftung Für Herz Und Kreislaufkrankheiten (Schweiz) unterstützt.

1. Erhebung und Verarbeitung von konditionierten Medien
<ol><li>55 cm2 Petrischalen mit 0,02 % Schweinehaut Gelatine mit PBS-Puffer zu beschichten.</li>
	<li>CPC (8.000/cm2) in vorbeschichtete Gerichte-Platte mit 7 mL von Iscoves geändert Dulbecco Medium (IMDM) ergänzt mit 20 % FBS (fetale Rinderserum) und 1 % Penicillin/Streptomycin (P/S). Hinweis: Der Begriff "CPC" bezieht sich auf menschliche Explant abgeleitete Zellen, die beschrieben an anderer Stelle14...

<ol>
	<li>Barile, L., Vassalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+Therapy+delivery+tools+and+biomarkers+of+diseases.">Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. , (2017).</li><li>Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+secreted+vesicles+and+intercellular+communications.">Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications.</a> Molecular Biology Reports. 3, 15 (2011).</li><li>Yadav, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsy+in+pancreatic+cancer:+the+beginning+of+a+new+era.">Liquid biopsy in pancreatic cancer: the beginning of a new era.</a> Oncotarget. 9, 26900-26933 (2018).</li><li>Balbi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+Characterization+of+Human+Amniotic+Fluid+Stem+Cell+Extracellular+Vesicles+as+a+Powerful+Paracrine+Tool+Endowed+with+Regenerative+Potential.">First Characterization of Human Amniotic Fluid Stem Cell Extracellular Vesicles as a Powerful Paracrine Tool Endowed with Regenerative Potential.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6, 1340-1355 (2017).</li><li>Andriolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+From+Human+Cardiac+Progenitor+Cells+for+Therapeutic+Applications:+Development+of+a+GMP-Grade+Manufacturing+Method.">Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method.</a> Frontiers in Physiology. 9, (2018).</li><li>Lai, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+secreted+by+MSC+reduces+myocardial+ischemia/reperfusion+injury.">Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury.</a> Stem Cell Research. 4, (2009).</li><li>Doeppner, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles+Improve+Post-Stroke+Neuroregeneration+and+Prevent+Postischemic+Immunosuppression.">Extracellular Vesicles Improve Post-Stroke Neuroregeneration and Prevent Postischemic Immunosuppression.</a> Stem Cells Translational Medicine. 4, 1131-1143 (2015).</li><li>Kordelas, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC-derived+exosomes:+a+novel+tool+to+treat+therapy-refractory+graft-versus-host+disease.">MSC-derived exosomes: a novel tool to treat therapy-refractory graft-versus-host disease.</a> Leukemia. 28, 970-973 (2014).</li><li>Barile, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+human+cardiac+progenitor+cells+inhibit+cardiomyocyte+apoptosis+and+improve+cardiac+function+after+myocardial+infarction.">Extracellular vesicles from human cardiac progenitor cells inhibit cardiomyocyte apoptosis and improve cardiac function after myocardial infarction.</a> Cardiovascular Research. 103, 530-541 (2014).</li><li>Longatti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+affinity+single-chain+variable+fragments+are+specific+and+versatile+targeting+motifs+for+extracellular+vesicles.">High affinity single-chain variable fragments are specific and versatile targeting motifs for extracellular vesicles.</a> Nanoscale. 10, 14230-14244 (2018).</li><li>Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Microvesicles+from+Peripheral+Blood.">Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li><li>Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+analysis+of+extracellular+vesicles+using+flow+cytometry.">Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2015).</li><li>Arakelyan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Virometry+to+Analyze+Antigenic+Spectra+of+Virions+and+Extracellular+Vesicles.">Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li><li>Chimenti, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+adult+cardiac+stem/progenitor+cells+in+the+form+of+cardiospheres+from+human+cardiac+biopsies+and+murine+hearts.">Isolation and expansion of adult cardiac stem/progenitor cells in the form of cardiospheres from human cardiac biopsies and murine hearts.</a> Methods Molecular Biology. 879, 327-338 (2012).</li><li>van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry.">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nature Protocols. 7, 1311-1326 (2012).</li><li>Pospichalova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+protocol+for+flow+cytometry+analysis+of+fluorescently+labeled+exosomes+and+microvesicles+using+dedicated+flow+cytometer.">Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 25530 (2015).</li><li>van der Pol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+size+distribution+of+exosomes+and+microvesicles+determined+by+transmission+electron+microscopy,+flow+cytometry,+nanoparticle+tracking+analysis,+and+resistive+pulse+sensing.">Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12, 1182-1192 (2014).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updating+the+MISEV+minimal+requirements+for+extracellular+vesicle+studies:+building+bridges+to+reproducibility.">Updating the MISEV minimal requirements for extracellular vesicle studies: building bridges to reproducibility.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1396823 (2017).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cellular Biology. , (2006).</li><li>Suarez, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bead-assisted+flow+cytometry+method+for+the+semi-quantitative+analysis+of+Extracellular+Vesicles.">A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles.</a> Scientific Reports. 7, 11271 (2017).</li><li>Sodar, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-density+lipoprotein+mimics+blood+plasma-derived+exosomes+and+microvesicles+during+isolation+and+detection.">Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection.</a> Scientific Reports. 6, 24316 (2016).</li><li>Sluijter, J. P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+diagnostics+and+therapy+of+the+ischaemic+heart:+Position+Paper+from+the+Working+Group+on+Cellular+Biology+of+the+Heart+of+the+European+Society+of+Cardiology.">Extracellular vesicles in diagnostics and therapy of the ischaemic heart: Position Paper from the Working Group on Cellular Biology of the Heart of the European Society of Cardiology.</a> Cardiovascular Research. 114, 19-34 (2018).</li></ol>

Konventionelle FC Technik bleibt die einfachste analytische Methode Marker auf die Oberfläche des EV ausgedrückt zu charakterisieren. In diesem Zusammenhang ist die Auswahl des am besten geeigneten Protokolls wichtig, nützliche Informationen über die einzelnen Teilchen Bruchteile von Interesse zu erhalten, durch die Vermeidung von Einschränkungen aufgrund der Empfindlichkeit des Instruments. Wir beschrieben eine Methode mit magnetischen Partikeln gepaart mit Antikörpern, die erkennen Exo und kleine EV Oberflächena...

Zellen sezernieren extrazelluläre Vesikel (EV) in verschiedenen Größen, einschließlich Microvesicles (MV) und Exosomen (Exo). Letzteres kann aus MV durch Größe und subzelluläre Abteil des Ursprungs unterschieden werden. MV (200 – 1.000 nm Größe) von Vergießen von der Plasmamembran von übergeordneten Zellen freigesetzt werden. Im Gegensatz dazu Exo (30-150 nm) stammen aus Endosomal Membranen und in den Extrazellulärraum freigesetzt werden, wenn die multivesicular Körper (MVB) verschmelzen mit der Zellmembran1,2.
EV werden zunehmend als diagnostischen Biomarkern verwendet, sowie als, potenziell, therapeutische Hilfsmittel in vielen Bereichen, einschließlich Onkologie, Neurologie, Kardiologie und Erkrankungen des Bewegungsapparates3,4,5. Eine große Mehrheit der laufenden Studien mit EV als Therapeutika die Isolation von Vesikeln aus Zelle konditioniertes Medium (CM) der in-vitro kultivierten Zellen nutzen. Mesenchymaler Stammzellen (MSCs) ausüben, wohltuende Wirkung in mehreren Kontexten und MSC-abgeleitete EV haben Vorteile in den Modellen der myokardialen Ischämie/Reperfusion Verletzungen6 und Gehirn Verletzungen7gezeigt. MSC-abgeleitete EV auch ausstellen Immunsystem modulierende Aktivitäten, die zur Immunabwehr, Behandlung genutzt werden können, wie in einem Modell der Therapie-refraktären Graft - Versus - Host-Seuche8gezeigt. Amniotische Flüssigkeit Stammzellen (hAFS) bereichern aktiv CM mit MVs und Exo, heterogen verteilt in der Größe (50-1.000 nm), die mehrere biologische Wirkungen, z. B. Verbreitung von differenzierten Zellen, Angiogenese, Hemmung der Fibrose, vermitteln und Herzschutz-4. Wir haben vor kurzem gezeigt, dass EV und vor allem Exo, abgesondert von menschlichen Herz-Kreislauf-abgeleitete Vorläuferzellen (Exo-CPC) verkleinern myokardialen Infarkt in Ratten5,9.
Exo-Aktie einen gemeinsamen Satz von Proteine auf ihrer Oberfläche, einschließlich Tetraspanins (CD63, CD81, CD9) und großen Histocompatibility complex Klasse I (MHC-ich). Neben dieser gemeinsamen Reihe von Proteinen Exo enthalten auch Proteine spezifisch für die EV-Teilmenge des Zelltyps Produzent. Exo-Marker gewinnen größter Bedeutung, weil sie eine entscheidende Rolle bei Inter Zellkommunikation, dadurch regulieren viele biologische Prozesse5,10spielen. Aufgrund ihrer geringen Größe, zu finden einer einfachen Möglichkeit, analysieren, EV mit klassischen Flow Cytometry (FC) bleibt eine große Herausforderung.
Hier präsentieren wir Ihnen ein vereinfachtes Protokoll für EV-Analyse mit FC, die in Pre-angereicherten Proben durch Ultrazentrifugation oder direkt in CM (Abbildung 1) angewendet werden können. Die Methode verwendet Perlen mit einem spezifischen Antikörper, der kanonischen Exo-assoziierten Oberfläche Epitope (CD63, CD9, CD81) bindet beschichtet ohne zusätzliche Waschungen. FC-Analysen können mit einer herkömmlichen Cytometer ohne die Notwendigkeit für Anpassungen vor Messungen durchgeführt werden. Methoden zur Charakterisierung von Antigenen auf einzelne kleine Teilchen mit fließen Cytometers wurden von anderen Gruppen in Bezug auf verschiedene Anwendungen11,12,13beschrieben. Hier verwendeten wir funktionalisierten magnetische Beads für den Fang von kleinen Partikeln und Exo, gefolgt von Phänotypisierung von erfassten Partikel von FC. Obwohl diese Methode verwendet werden kann, um die Antigenen Zusammensetzung von kleinen Vesikeln freigesetzt durch jeden Zelltyp in-vitro-zu charakterisieren, hier zur Verfügung gestellten wir bestimmte Zelle Kulturbedingungen, die gelten für die Kultur der menschlichen kardialen Vorläuferzellen (CPC) und die meisten geeigneter Rahmenbedingungen für die Produktion von EV von diesen Zellen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:816px;" width="816">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:369px;">IMDM</td>
			<td style="width:113px;">Gibco</td>
			<td style="width:235px;">12440061</td>
			<td style="width:99px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100&#160;kDa&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CytoFlex, Flow Cytometer Platform</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>CytoFlex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21063045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s PBS (PBS) Ca- and Mg-free</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-512F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExoCap CD63 Capture Kit</td>
			<td>JSR Life Sciences</td>
			<td>Ex-C63-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExoCap CD81 Capture Kit</td>
			<td>JSR Life Sciences</td>
			<td>Ex-C81-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExoCap CD9 Capture Kit</td>
			<td>JSR Life Sciences</td>
			<td>Ex-C9-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Exosome-Depleted FBS</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A2720801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Exosome-depleted FBS Media Supplement</td>
			<td>SBI</td>
			<td>EXO-FBS-250A-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS-Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-human CD9 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>312104&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; RRID: AB_2075894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow Cytometer analysis software</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Kaluza</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoSight LM10</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NanoSight LM10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoSight Software</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NTA 2.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optima Max-XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE anti-human CD63 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>353004&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; RRID:AB_10897809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE anti-human CD81 (TAPA-1) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>349505&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; RRID:AB_10642024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermomixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382 000 015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">TLA-110</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>TLA-110 rotors</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of extracellular vesicles from cell-conditioned media

Durchflusszytometrie (FC) ist die Methode der Wahl zur semi-quantitativen Messung der Zelloberfläche Antigen Marker. Vor kurzem hat diese Technik für phänotypische Analysen von extrazellulären Vesikeln (EV) einschließlich Exosomen (Exo) im peripheren Blut und anderen Körperflüssigkeiten verwendet worden. Die geringe Größe des EV schreibt die Verwendung von speziellen Instrumenten mit einer Nachweisgrenze um 50-100 nm. Alternativ kann EV an Latex Microbeads gebunden werden, die vom FC erkannt werden können. Microbeads, konjugiert mit Antikörpern, die EV-assoziierten Marker/Cluster Differenzierung CD63, CD9 und CD81 erkennen kann verwendet werden für EV erfassen. Exo isoliert von CM kann mit oder ohne Voranreicherung durch Ultrazentrifugation analysiert werden. Dieser Ansatz eignet sich für EV-Analysen mit konventionellen FC Instrumenten. Unsere Ergebnisse zeigen eine lineare Korrelation zwischen bedeuten Fluoreszenz Intensität (MFI) Werte und EV-Konzentration. Stören EV durch Beschallung drastisch verringerte MFI, darauf hinweist, dass die Methode nicht Membran Schutt erkennt. Wir berichten über eine genaue und zuverlässige Methode für die Analyse von Oberflächenantigenen EV, die leicht in jedem Labor durchgeführt werden können.

Gesamtzahl der Partikel für einheitliche Färbung
Da eine einzelne Perle mehr als ein Teilchen binden kann, testeten wir verschiedene Bedingungen, die kleinste Menge des gesamten EV (einzelne Antikörper pro Röhre) festgelegt, um die exponentielle Frühphase der MFI-Kurve zu erreichen. Eine feste Konzentration des Antikörpers wurde verwendet, während die Gesamtzahl der Partikel reichte von 5 x 105...

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Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Das Protokoll beschreibt eine reproduzierbare Methode zur Verwendung mit Zelle Kultur Überstände, Oberfläche Epitope auf kleine extrazelluläre Vesikel (EV) zu erkennen. Es nutzt spezifische EV Immunopräzipitation mit Perlen mit Antikörpern, die Oberflächenantigen CD9, erkennen CD63 und CD81 gekoppelt. Die Methode ist für nachgeschaltete Flow Cytometry Analyse optimiert.

Fließen Sie durchflusszytometrischen Analyse der extrazellulären Vesikel aus Zelle konditioniertes Medien

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Extrazelluläre Vesikel werden zunehmend als diagnostischer Biomarker und potenzielles therapeutisches Werkzeug in vielen Bereichen eingesetzt. Flow Cytometric ist die geradlinigste Analysemethode zur Charakterisierung durch anzuggerichtete Marker, bei der die Analyse eines assized Partikels verwendet werden kann, ist schnell und eignet sich für herkömmliche Seismometer, ohne dass eine spezielle Einstellung oder das dedizierte Instrument erforderlich ist. Obwohl dieses Protokoll verwendet wird, um extrazelluläre Vesikel aus diesem Zustand und Medium zu kategorisieren, kann es in Richtung Kategorisierung von Blut angekommenEn AVs erweitert werden, um invasive Gewebebiopsien bei Patienten zu ersetzen.Für Forscher, die neu im Protokoll sind, ist es wichtig, die im Abschnitt der Einrichtungsmethode beschriebenen Schritte durchzuführen und die demonstrierten Strategien genau zu verfolgen, indem 55 Zentimeter quadratische Petri-Gerichte mit 02%porcine Hautgelatine in PBS beschichtet werden. Nach 15 Minuten die Schale und den Teller 4,4 mal 10 auf die fünfte Herzvorläuferzellen in 7 Millilitern von Iscoves modifiziertem Dulbecco-Medium oder IMDM, ergänzt mit 20% fetalem Rinderserum, und 1% Penicillin und Streptomycin für ihre Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid, waschen. Wenn die Zellen etwa 80% Konfluenz erreichen, waschen Sie die Kulturen zweimal mit Dulbeccos PBS ohne Kalzium und Magnesium und füttern Sie die Zellen mit 10 Milletern serumfreiem Exosomen-Produktionsmedium.Nach 7 Tagen das konditionierte Medium von jeder Platte in ein einzelnes Polypropylen-Zentrifugenrohr bündeln und das Medium zentrifugieren, um Zellablagerungen zu entfernen. Übertragen Sie den Überstand in ein 100 Kilodalton Zentrifugenfilterrohr und konzentrieren Sie das gereinigte, konditionierte Medium mit einer zusätzlichen Zentrifugation. Übertragen Sie das Konzentrat für eine abschließende Tischzentrifugierung in ein Mikrozentrifugenrohr und fügen Sie den Überstand in ein polykarbonat dickes Wand-Mikrozentrifugenrohr ein.Füllen Sie das Rohr mit PBS, bis zu einem Endvolumen von 3,2 Milileter, und laden Sie die Probe in einen Titan festen EngelRotor. Dann den Rotor zur Ultrazentrifugation in eine Tischplatte ultrazentrifugieren und das Pellet in 100 Mikroliter frischer PBS wieder aufhängen. Zur Nanopartikelverfolgung und Analysequantifizierung 1 Mikroliter der ultrazentrifugierten Probe in 999 Mikroliter PBS verdünnen und die Probe ohne Blasen in eine 1-Milileter-Spritze laden.Legen Sie die Spritze in den Einlassanschluss der Untersuchungskammer und schalten Sie den Laser ein. Verwenden Sie die Aufnahmetaste, um die Kamera zu öffnen und den Fokus anzupassen. Zeichnen Sie dann mindestens drei verschiedene Frames mit jeweils 60 Sekunden auf, und verwenden Sie die Batch-Prozessoption in der Software, um die drei verschiedenen Erfassungen zu analysieren.Um die Probe für den Erwerb vorzubereiten, fügen Sie zunächst die entsprechenden experimentellen monoklonalen Antikörper konjugierten Aufnahmeperlen im Verhältnis 1:1:1 in ein Mikrozentrifugenrohr ein und wirbeln den resultierenden Erfassungsperlenpool. Als nächstes fügen Sie das entsprechende Probenvolumen zu 1 Mikroliter Fangperlenpool hinzu, um 1 mal 10 zu den 8 Partikeln plus 1,2 mal 10 bis zu den 5. Perlen pro Testkonzentration zu erzeugen. Fügen Sie 1 Mikroliter Perlen in eine Tube mit etikettierten Perlen als Negativkontrolle hinzu und passen Sie das Volumen in jedem Rohr auf 100 Mikroliter mit frischem PBS an.Dann legen Sie die Rohre in einem Thermomischer, mit Schütteln, bei 400 Umdrehungen pro Minute und 4 bis 10 Grad Celsius, über Nacht. Am nächsten Tag, übertragen Sie die Proben auf eine runde untere 96 Brunnenplatte, und fügen Sie die entsprechenden Blütenstand konjugierte Antikörper zu jedem Brunnen. Nach einer 1 Stunde Inkubation bei 4 bis 10 Grad Celsius, fügen Sie 100 Mikroliter PBS zu jedem Brunnen hinzu, und öffnen Sie die Erfassungssoftware.Wählen Sie Zytometer und Systemstartprogramm, um das Instrument zu starten und ein neues Experiment zu öffnen. Erstellen Sie eine experimentelle Vorlage, und wählen Sie die Platte aus, und fügen Sie die Platte hinzu. Wählen Sie die Position der Proben auf der Platte aus, und klicken Sie auch auf Set als Probe.Geben Sie den Beispielnamen in die Namensregeln ein, öffnen Sie die Kanalregisterkarte, und wählen Sie die entsprechenden Floreszenzsignalkanäle aus. Laden Sie nun die Platte in das Instrument. Klicken Sie auf Punktdiagramm, um einen neuen Vorwärtsstreubereich im Vergleich zum Seitenstreubereich-Punktdiagramm zu erstellen.Wählen Sie Initialisieren aus, um den Laser und die Fluidik zu starten, und klicken Sie auf Ausführen, um die Erfassung zu starten. Passen Sie die Skala an, um die Grundgesamtheit in der Mitte des vorwärts- versus seitenseitigen Streudiagramms anzuzeigen, und zeichnen Sie ein Perlentor um die gesamte Stichprobenpopulation, um die Trümmer auszuschließen. Klicken Sie auf Stopp- und Punktdiagramm, um eine Vorwärtsstreuhöhe im Vergleich zum Punktdiagramm für den vorwärts gerichteten Streubereich zu erstellen und die Stichprobe auf die Perlenpopulation zu beenden.Zeichnen Sie ein neues Tor um die größere Population und nennen Sie es Singlets, und klicken Sie auf Punktdiagramm, um ein fluoreszierendes Signal im Vergleich zu seitenstreuenden Punktdiagrammen zu erstellen, pro experimentellem Fluorophor. Tor das neue Punkt-Plot auf den Singlets. Wählen Sie dann die Anzahl der aufzuzeichnenden Ereignisse aus, und wählen Sie Datensatz aus, um die experimentelle Erfassung zu starten.Laden Sie am Ende der Analyse die Erfassungsdateien in die entsprechende Analysesoftware, und öffnen Sie ein neues Protokoll. Erstellen Sie Punktdiagramme für jede Datei, wie gerade gezeigt, und legen Sie die gesamte Streuachse auf einen linearen Maßstab und die gesamte Floreszenzachse für die Protokollskalierung fest. Zeigen Sie dann den floreszenz geometrischen Mittelwert in den relevanten Signalkanälen, um die volle Veränderung der mittleren Blütensflorzintensität in den verschiedenen extrazellulären Vesikelpräparaten zu berechnen.Nach dem Testen verschiedener Bedingungen, um die kleinste Gesamtmenge an extrazellulären Vesikeln festzulegen, um die frühe exponentielle Phase einer mittleren Blütenstoffintensitätskurve zu erreichen, wurde die minimale Anzahl von Partikeln auf 1 mal 10 bis zu den 8 Partikeln pro Färbung festgelegt. Die optimale Konzentration von Antikörpern für 1 mal 10 bis zu den 8 Partikeln, um das höchste Signal ohne unspezifische Antikörperbindung zu erreichen, wurde auf 10 Mikrogramm pro Milliliter sowohl für Anti-CD9_FITC- als auch für Anti-CD63_PE-Antikörper und fünf Mikrogramm pro Milliliter für den Anti-CD81_PE-Antikörper s. Um die Eignung der Methode zu bestätigen, zur Analyse von becherförmigen extrazellulären Vesikeln und nicht membranförmigen Ablagerungen, wurden die extrazellulären Vesikel beschallt, was zu einer Abnahme der mittleren Blütensfloritätsintensität nach nur 30 Sekunden Beschallung führte, ohne dass nach einer Minute mechanischer Störung überhaupt keine Blütenstand festgestellt wurde.X eigene Reinigung aus Herzvorläuferzellen, wie gezeigt, ergibt extrazelluläre Vesikel, die niedrige Konzentrationen von CD9 und hohe Konzentrationen von CD63 und CD81 aus beiden Zellpopulationen ausdrücken. Während x eigene Oberflächenmarker ohne Ultrazentrifugation eindeutig identifizierbar sind, erhöht dieser Anreicherungsschritt die mittlere Blütenstandintensität dieser Marker erheblich. Bei der Arbeit mit extrazellulären Vesikeln gibt es mehr sorglose Nanopartikelpellets können leicht verpasst werden.Daher ist es wichtig, alle Schritte zu befolgen, wie im Protokoll gezeigt. Die Verwendung extrazellulärer Vesikel als Biomarker ist heute eine der neuaufstrebendsten Feldforschungen. Und bald, kann in die klinische Diagnostik als alternatives Screening-Tool verwendet übersetzt werden.

Research

JoVE Journal

Biology

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

Identifikation und Analyse von Maus Erythroid Vorläufern mit dem CD71/TER119 Durchflusszytometrische Assay

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

Forschung

Biologie

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Techniken für die Analyse der extrazellulären Vesikeln mittels Durchflusszytometrie

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Reinigung und Analyse von Caenorhabditis elegans Extrazelluläre Vesikel

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

Nanopartikel-Tracking-Analyse zur Quantifizierung und Größenbestimmung extrazellulärer Vesikel

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Skalierbare Isolierung und Reinigung extrazellulärer Vesikel aus Escherichia coli und anderen Bakterien

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

Isolierung und Charakterisierung von zyanobakteriellen extrazellulären Vesikeln

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolierung von microRNAs aus Zecken-Ex-vivo-Speicheldrüsenkulturen und extrazellulären Vesikeln

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

Isolierung und Analyse von nachweisbaren und funktionalisierten extrazellulären Vesikeln aus dem Plasma und festen Geweben

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Isolierung, Charakterisierung und therapeutische Anwendung extrazellulärer Vesikel aus kultivierten humanen mesenchymalen Stammzellen

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...