Name: flow cytometric analysis of extracellular vesicles from cell-conditioned media
Uploaded: 2019-02-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media at JoVE.com

L.B. נתמכה על ידי מענקי מחקר של הלמוט Horten Stiftung ו Velux Stiftung, ציריך (שווייץ). G.V. נתמך על ידי מענקי מחקר של קרן המדע הלאומית השוויצרית, קרן ססיליה-אוגוסטה, לוגאנו לדנציג SHK Stiftung את הרץ-und Kreislaufkrankheiten (שוויץ)

1. איסוף ועיבוד של מדיה ממוזגים
<ol><li>מעיל 55 ס מ2 צלחות פטרי עם ג'לטין העור חזירי 0.02% ב- PBS.</li>
	<li>צלחת CPC (8,000/cm2) במנות מצופים מראש עם 7 מ של Iscove שונה Dulbecco בינוני (IMDM) בתוספת 20% FBS (סרום שור עוברית) ו- 1% פניצילין/סטרפטומיצין (P/S). הערה: המונח "עלות לקליק" מתייחס לתאים אנושיים explant נ?...

<ol>
	<li>Barile, L., Vassalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+Therapy+delivery+tools+and+biomarkers+of+diseases.">Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. , (2017).</li><li>Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+secreted+vesicles+and+intercellular+communications.">Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications.</a> Molecular Biology Reports. 3, 15 (2011).</li><li>Yadav, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsy+in+pancreatic+cancer:+the+beginning+of+a+new+era.">Liquid biopsy in pancreatic cancer: the beginning of a new era.</a> Oncotarget. 9, 26900-26933 (2018).</li><li>Balbi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+Characterization+of+Human+Amniotic+Fluid+Stem+Cell+Extracellular+Vesicles+as+a+Powerful+Paracrine+Tool+Endowed+with+Regenerative+Potential.">First Characterization of Human Amniotic Fluid Stem Cell Extracellular Vesicles as a Powerful Paracrine Tool Endowed with Regenerative Potential.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6, 1340-1355 (2017).</li><li>Andriolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+From+Human+Cardiac+Progenitor+Cells+for+Therapeutic+Applications:+Development+of+a+GMP-Grade+Manufacturing+Method.">Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method.</a> Frontiers in Physiology. 9, (2018).</li><li>Lai, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+secreted+by+MSC+reduces+myocardial+ischemia/reperfusion+injury.">Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury.</a> Stem Cell Research. 4, (2009).</li><li>Doeppner, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles+Improve+Post-Stroke+Neuroregeneration+and+Prevent+Postischemic+Immunosuppression.">Extracellular Vesicles Improve Post-Stroke Neuroregeneration and Prevent Postischemic Immunosuppression.</a> Stem Cells Translational Medicine. 4, 1131-1143 (2015).</li><li>Kordelas, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC-derived+exosomes:+a+novel+tool+to+treat+therapy-refractory+graft-versus-host+disease.">MSC-derived exosomes: a novel tool to treat therapy-refractory graft-versus-host disease.</a> Leukemia. 28, 970-973 (2014).</li><li>Barile, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+human+cardiac+progenitor+cells+inhibit+cardiomyocyte+apoptosis+and+improve+cardiac+function+after+myocardial+infarction.">Extracellular vesicles from human cardiac progenitor cells inhibit cardiomyocyte apoptosis and improve cardiac function after myocardial infarction.</a> Cardiovascular Research. 103, 530-541 (2014).</li><li>Longatti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+affinity+single-chain+variable+fragments+are+specific+and+versatile+targeting+motifs+for+extracellular+vesicles.">High affinity single-chain variable fragments are specific and versatile targeting motifs for extracellular vesicles.</a> Nanoscale. 10, 14230-14244 (2018).</li><li>Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Microvesicles+from+Peripheral+Blood.">Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li><li>Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+analysis+of+extracellular+vesicles+using+flow+cytometry.">Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2015).</li><li>Arakelyan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Virometry+to+Analyze+Antigenic+Spectra+of+Virions+and+Extracellular+Vesicles.">Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li><li>Chimenti, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+adult+cardiac+stem/progenitor+cells+in+the+form+of+cardiospheres+from+human+cardiac+biopsies+and+murine+hearts.">Isolation and expansion of adult cardiac stem/progenitor cells in the form of cardiospheres from human cardiac biopsies and murine hearts.</a> Methods Molecular Biology. 879, 327-338 (2012).</li><li>van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry.">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nature Protocols. 7, 1311-1326 (2012).</li><li>Pospichalova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+protocol+for+flow+cytometry+analysis+of+fluorescently+labeled+exosomes+and+microvesicles+using+dedicated+flow+cytometer.">Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 25530 (2015).</li><li>van der Pol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+size+distribution+of+exosomes+and+microvesicles+determined+by+transmission+electron+microscopy,+flow+cytometry,+nanoparticle+tracking+analysis,+and+resistive+pulse+sensing.">Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12, 1182-1192 (2014).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updating+the+MISEV+minimal+requirements+for+extracellular+vesicle+studies:+building+bridges+to+reproducibility.">Updating the MISEV minimal requirements for extracellular vesicle studies: building bridges to reproducibility.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1396823 (2017).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cellular Biology. , (2006).</li><li>Suarez, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bead-assisted+flow+cytometry+method+for+the+semi-quantitative+analysis+of+Extracellular+Vesicles.">A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles.</a> Scientific Reports. 7, 11271 (2017).</li><li>Sodar, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-density+lipoprotein+mimics+blood+plasma-derived+exosomes+and+microvesicles+during+isolation+and+detection.">Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection.</a> Scientific Reports. 6, 24316 (2016).</li><li>Sluijter, J. P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+diagnostics+and+therapy+of+the+ischaemic+heart:+Position+Paper+from+the+Working+Group+on+Cellular+Biology+of+the+Heart+of+the+European+Society+of+Cardiology.">Extracellular vesicles in diagnostics and therapy of the ischaemic heart: Position Paper from the Working Group on Cellular Biology of the Heart of the European Society of Cardiology.</a> Cardiovascular Research. 114, 19-34 (2018).</li></ol>

טכניקת FC המקובלת נשאר השיטה האנליטית הברור ביותר לאפיון סמני הביע על גבי המשטח של EV. בהקשר זה, בחירת הפרוטוקול המתאים ביותר הוא חיוני כדי לקבל מידע שימושי בשברים חלקיקים בודדים של עניין על ידי הימנעות מגבלות עקב רגישות המכשיר. אנחנו תיאר שיטה באמצעות חלקיקים מגנטיים בשילוב עם נוגדנים מזהה...

תאים מפרישים חוץ-תאית שלפוחית (EV) בגדלים שונים, כולל שלפוחיות זעירות (MV) ו exosomes (מסכות). האחרון ניתן להבדיל בין MV גם בגודל וגם תא subcellular המקור. MV (200 – 1,000 ננומטר בגודל) משתחררים מתאי האב על ידי ששפך של קרום פלזמה. לעומת זאת, Exo (30-150 ננומטר) שמקורם ממברנות endosomal, משתחררים לחלל חוץ-תאית, כאשר הגופים multivesicular (MVB). להתמזג עם קרום התא1,2.
EV יותר ויותר משמש האבחון סמנים ביולוגיים כמו גם, באופן פוטנציאלי, כלים טיפוליים בתחומים רבים, לרבות אונקולוגיה, נוירולוגיה, קרדיולוגיה, מחלות שריר-שלד3,4,5. הרוב המכריע של מחקרים מתמשכת באמצעות EV כמו סוכני טיפולית לנצל את ניתוקה של שלפוחית מ תאים ממוזגים בינוני (ס מ) של תאים בתרבית במבחנה. גזע mesenchymal (MSCs) מפעילים השפעות מועילות בהקשרים מספר, MSC-derived EV הראו יתרונות במודלים של שריר הלב איסכמיה/פגיעה reperfusion פציעה6 ו במוח פציעה7. MSC-derived EV התערוכה גם המערכת החיסונית פעילויות modulatory, שעלולים להיות מנוצלים לרעה לטיפול הדחייה החיסונית, כפי שמתואר במודל של טיפול-חסיני אש שתל – מול – מארח מחלות8. תאי גזע נוזל מי השפיר (hAFS) להעשיר באופן פעיל ס מ עם MVs, מסכות, heterogeneously מופץ בגודלם (50 – 1,000 ננומטר), אשר לתווך מספר אפקטים ביולוגיים, כגון התפשטות של תאים, אנגיוגנזה, עיכוב של פיברוזיס, ו cardioprotection4. לאחרונה הראו לנו EV, במיוחד מסכות, מופרש על ידי האדם, נגזר הלב ובתאים (Exo-CPC) להקטין לאוטם שריר הלב ב חולדות5,9.
Exo שיתוף ערכה משותפת של חלבונים על פני השטח שלהם, כולל tetraspanins (CD63, CD81, CD9), מתחם מרכזי histocompatibility מחלקה אני (MHC-אני). בנוסף זו ערכה משותפת של חלבונים, Exo מכילים גם חלבונים ספציפיים עבור המשנה EV סוג התא מפיק. Exo סמני צוברות חשיבות עליונה כי הם לשחק תפקיד מכריע בתקשורת הבין-תאית, ובכך ויסות תהליכים ביולוגיים רבים5,10. בשל גודלם הקטן, מציאת דרך קלה כדי לנתח EV באמצעות זרימה קלאסית cytometry (FC) שרידים משימה מאתגרת.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול פשוטה לניתוח EV באמצעות FC, אשר יכול להיות מיושם דגימות מראש מועשר שהושג דרך ultracentrifugation או ישירות ס"מ (איור 1). השיטה משתמשת חרוזים מצופים נוגדן ספציפי המאגד הקנוני Exo-הקשורים משטח epitopes (CD63, CD9, CD81) בלי שוטף נוספים. ניתוחים FC יכול להתבצע באמצעות cytometer המקובלת ללא צורך התאמות לפני מדידות. שיטות אפיון אנטיגנים על חלקיקים קטנים בודדים באמצעות זרימת cytometers תוארו על ידי קבוצות אחרות לגבי יישומים שונים11,12,13. כאן השתמשנו beads מגנטי functionalized ללכידתו של חלקיקים קטנים, מסכות, ואחריו phenotyping החלקיקים שנלכדו על ידי מועדון הכדורגל. אמנם ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לאפיין את ההרכב antigenic של שלפוחית קטנה שפורסמו על ידי כל סוג התא במבחנה, כאן אנחנו סיפקנו התרבות תאים מסוים התנאים החלים על התרבות של האדם ובתאים הלב (CPC) ואת ביותר הסביבה המתאימה לייצור של EV על ידי תאים אלה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:816px;" width="816">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:369px;">IMDM</td>
			<td style="width:113px;">Gibco</td>
			<td style="width:235px;">12440061</td>
			<td style="width:99px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100&#160;kDa&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CytoFlex, Flow Cytometer Platform</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>CytoFlex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21063045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s PBS (PBS) Ca- and Mg-free</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-512F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExoCap CD63 Capture Kit</td>
			<td>JSR Life Sciences</td>
			<td>Ex-C63-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExoCap CD81 Capture Kit</td>
			<td>JSR Life Sciences</td>
			<td>Ex-C81-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExoCap CD9 Capture Kit</td>
			<td>JSR Life Sciences</td>
			<td>Ex-C9-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Exosome-Depleted FBS</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A2720801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Exosome-depleted FBS Media Supplement</td>
			<td>SBI</td>
			<td>EXO-FBS-250A-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS-Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-human CD9 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>312104&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; RRID: AB_2075894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow Cytometer analysis software</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Kaluza</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoSight LM10</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NanoSight LM10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoSight Software</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NTA 2.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optima Max-XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE anti-human CD63 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>353004&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; RRID:AB_10897809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE anti-human CD81 (TAPA-1) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>349505&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; RRID:AB_10642024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermomixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382 000 015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">TLA-110</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>TLA-110 rotors</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of extracellular vesicles from cell-conditioned media

Cytometry זרימה (FC) היא שיטת הבחירה למדידה כמותית למחצה של סמני אנטיגן פני התא. לאחרונה, נעשה שימוש בטכניקה זו עבור ניתוחים פנוטיפי של שלפוחית חוץ-תאית (EV) כולל exosomes (מסכות) הדם ההיקפיים, נוזלי גוף אחרים. גודל קטן של EV מנדטים שימוש בכלים ייעודיים שיש סף גילוי סביב 50-100 ננומטר. לחלופין, EV יכולות להיות קשורות לטקס. גרגרי שניתן לאתר על ידי מועדון הכדורגל. . גרגרי, מצומדת עם נוגדנים מזהה EV-הקשורים סמני/אשכול של בידול CD63, CD9, CD81 יכול לשמש עבור EV לכידה. Exo מבודד ס מ ניתן לנתח עם או בלי העשרה מראש על-ידי ultracentrifugation. גישה זו מתאימה ניתוחים EV באמצעות מכשירים FC המקובלת. התוצאות שלנו להפגין מתאם ליניארי בין ערכי עוצמת קרינה פלואורסצנטית מתכוון (MFI) וריכוז EV. שיבוש EV דרך sonication באופן דרמטי ירד MFI, המציין כי השיטה אינו מזהה את קרום פסולת. . מדווחים שיטה מדויקת ואמינה עבור הניתוח של אנטיגנים משטח EV, אשר ניתן ליישם בקלות במעבדה כלשהי.

המספר הכולל של חלקיקים עבור צביעת יחיד
מאז חרוז אחד באפשרותך לאגוד יותר מחלקיק אחד, בדקנו תנאים שונים כדי לקבוע את הכמות הקטנה ביותר של EV הכולל (יחיד נוגדנים למחזור) כדי להגיע אל השלב מעריכי מוקדם של עקומת MFI. ריכוז קבוע של נוגדן ש?...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media at JoVE.com

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

הפרוטוקול מתאר שיטה ישימה מיועד לשימוש עם תא תרבות supernatants לאתר epitopes משטח על שלפוחית קטנה חוץ-תאית (EV). הוא מנצל immunoprecipitation EV ספציפי באמצעות חרוזים בשילוב עם נוגדנים מזהה אנטיגן פני שטח CD9, CD63, CD81. השיטה ממוטבים לניתוח cytometry במורד הזרם.

זרימה Cytometric ניתוח של שלפוחית חוץ-תאית ממדיה ממוזגים-תא

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

צלבים חוץ-תאיים משמשים יותר ויותר כסמן ביולוגי אבחוני וכלי טיפולי פוטנציאלי בתחום רב. זרימה Cytometric היא השיטה האנליטית ישר קדימה ביותר לאפיון על ידי סמנים פנים חליפה פרוטוקול זה יכול לשמש בניתוח חלקיק בגודל, הוא מהיר, והוא חל על סיסמומטרים קונבנציונליים ללא צורך בהגדרה מיוחדת או המכשיר הייעודי. למרות פרוטוקול זה משמש כדי לסווג Vesicles חוץ תאיים מן המצב אמר ובינוני, זה יכול להיות מורחב לקראת סיווג של דם הגיע AVs, כדי להחליף ביופסיות רקמות פולשניות בחולים.עבור חוקרים חדשים בפרוטוקול, חיוני לבצע צעדים המתוארים בסעיף שיטת ההגדרה, ולעקוב מקרוב אחר אסטרטגיות ההזנה המודגמות בגין על ידי ציפוי 55 ס"מ בריבוע פטרי-כלים עם 02%porcine עור ג'לטין, ב PBS. אחרי 15 דקות, לשטוף את המנה ואת הצלחת 4.4 פעמים 10 לתאי אבי הלב החמישי על כל מנה ב 7 מיליליטר של המדיום של Iscove שונה Dulbecco, או IMDM, בתוספת 20% סרום שור עוברי, ו 1% פניצילין וסטרפטומיצין עבור הדגירה שלהם ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. כאשר התאים מגיעים כ 80% confluency, לשטוף את התרבויות פעמיים עם PBS של Dulbecco ללא סידן ומגנזיום ולהאכיל את התאים עם 10 milileters של מדיום ייצור exosome ללא סרום.לאחר 7 ימים, בריכת המדיום הממוזג מכל צלחת, לתוך צינור צנטריפוגה פוליפרופילן יחיד צנטריפוגה המדיום כדי להסיר את כל פסולת התא. מעבירים את העל-טבעי לצינור מסנן צנטריפוגה של 100 קילודלטון, ומרכזים את המדיום המטוהר, הממוזג, עם צנטריפוגה נוספת. מעבירים את התרכיז לצינור מיקרו צנטריפוגה לצנטריפוגה סופית על הספסל ומוסיפים את העל-טבעי לצינור מיקרו צנטריפוגה עבה של קיר פוליקרבונט.מלא את הצינור עם PBS, לנפח סופי של 3.2 milileters, טען את המדגם לתוך רוטור מלאך קבוע טיטניום. לאחר מכן לטעון את הרוטור לתוך אולטרהצנטריפוגה שולחן עבור ultracentrifugation, ו resuspend את גלולה ב 100 microliters של PBS טרי. עבור מעקב חלקיקים וכימות ניתוח, לדלל 1 microliter של המדגם אולטרה מרכזי, ב 999 microliters של PBS, ולטעון את המדגם לתוך מזרק 1 milileter ללא בועות.טען את המזרק לתוך יציאת המזרק של תא הבדיקה, והדליק את הלייזר. השתמש בלחצן הלכידה כדי לפתוח את המצלמה ולהתאים את המוקד. לאחר מכן הקליט לפחות שלוש מסגרות שונות של 60 שניות כל אחת, ולהשתמש באפשרות תהליך האצווה בתוכנה, כדי לנתח את שלוש הרכישות השונות.כדי להכין את הדגימה לרכישה, תחילה להוסיף את הנוגדן המונוקלוני הניסיוני המתאים חסידות לכידה ביחס 1:1:1, לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה, ומערבולת בריכת חרוזים לכידת וכתוצאה מכך. לאחר מכן, להוסיף את הנפח המתאים של מדגם 1 microliter של בריכת חרוזים ללכוד כדי ליצור 1 פעמים 10 ל 8 חלקיקים בתוספת 1.2 פעמים 10 כדי 5 חרוזים לכל ריכוז הבדיקה. הוסף 1 microliter של חרוזים לצינור שכותרתו חרוזים כמו שליטה שלילית, ולהתאים את עוצמת הקול בכל צינור ל 100 microliters עם PBS טרי.לאחר מכן מניחים את הצינורות במיקסר תרמו, עם רעידות, ב 400 סיבובים לדקה, ו 4 עד 10 צלזיוס, לילה. למחרת, להעביר את הדגימות לתחתית עגולה 96 צלחת היטב, ולהוסיף את הנוגדנים חידה florescence המתאים לכל באר. לאחר דגירה של שעה ב-4 עד 10 מעלות צלזיוס, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של PBS לכל באר, פתחו את תוכנת הרכישה.בחר ציטומטר ותוכנית הפעלת מערכת, כדי להפעיל את המכשיר ולפתוח ניסוי חדש. צרו תבנית ניסיונית ובחרו לוח והוסיפו צלחת. בחרו במיקום הדגימות על הלוח ולחצו גם על 'קבע' כדגימה.הזינו את השם לדוגמה בכללי מתן השמות, פתחו את לשונית הערוץ ובחרו בערוצי האות המתאימים. עכשיו תעמיס את הלוחית לתוך המכשיר. ולחצו על התוויית נקודה, כדי ליצור אזור פיזור קדמי חדש לעומת חלקת נקודה של אזור פיזור צד.בחר אתחל כדי להפעיל את הלייזר ואת fluidics ולחץ על לרוץ כדי להתחיל את הרכישה. התאם את קנה המידה כדי להראות את האוכלוסייה באמצע חלקת פיזור קדימה לעומת צד, ולצייר שער חרוזים סביב כל אוכלוסיית המדגם כדי לא לכלול את ההריסות. לחץ על עצור ועל חלקת נקודה כדי ליצור גובה פיזור קדימה לעומת חלקת נקודה של אזור פיזור קדימה, ושער המדגם על אוכלוסיית חרוזים.ציירו שער חדש סביב האוכלוסייה הגדולה יותר ותנו לו Singlets, ולחצו על חלקת נקודה כדי ליצור אות פלואורסצנטי אחד לעומת חלקת נקודה של אזור פיזור צד, לכל פלואורופור ניסיוני בשימוש. שער חלקת הנקודה החדשה על סינגלים. לאחר מכן בחר את מספר האירועים שיש להקליט ובחר רשומה כדי להתחיל את הרכישה הניסיונית.בסוף הניתוח, טען את קבצי הרכישה לתוכנה המתאימה לניתוח ופתח פרוטוקול חדש. צור התוויות נקודה עבור כל קובץ כפי שהודגם זהה, והגדר את כל ציר ההתפזרות לקנה מידה ליניארי ואת כל הציר הפרחי כדי לשנות את קנה המידה של הרישום. לאחר מכן הצג את הממוצע הגיאומטרי florescence בערוצי האותות הרלוונטיים, כדי לחשב את השינוי המלא בעוצמת florescence ממוצע, בהכנות ורידים חוץ תאיים שונים.לאחר בדיקת תנאים שונים כדי להגדיר את הכמות הכוללת הקטנה ביותר של ורידים חוץ-תאיים כדי להגיע לשלב המעריכי המוקדם של עקומת עוצמת פלורסנס ממוצעת, המספר המינימלי של חלקיקים נקבע להיות 1 פעמים 10 עד 8 חלקיקים לכל הכתמה. הריכוז האופטימלי של נוגדנים עבור 1 פעמים 10 כדי 8 חלקיקים כדי להשיג את האות הגבוה ביותר ללא מחייב נוגדנים לא ספציפיים, נקבע להיות 10 מיקרוגרם למיליליטר עבור נוגדנים נגד CD9_FITC ואנטי CD63_PE וחמישה מיקרוגרם למיליליטר עבור נוגדן אנטי CD81_PE. כדי לאשר את התאמת השיטה, לניתוח ורידים חוץ-תאיים בצורת, ולא פסולת קרום, הווסקולים החוץ-תאיים היו sonicated, וכתוצאה מכך ירידה בעוצמת הפלורזנס הממוצע, לאחר 30 שניות בלבד של sonication, ללא florescence זוהה בכלל לאחר דקה אחת של הפרעה מכנית.הטיהור של X עצמו מתאי הצאצאים הלב כפי שהודגם, מניב יבולים חוץ-תאיים, המבטאים רמות נמוכות של CD9 ורמות גבוהות של CD63 ו- CD81 משתי אוכלוסיות התאים. יתר על כן, בעוד סמני פני השטח של X עצמם ניתנים לזיהוי בבירור ללא אולטרהצנטריפוגציה, צעד העשרה זה משפר מאוד את עוצמת הפלורסנטיות הממוצעת של סמנים אלה. כאשר עובדים עם ערכות חוץ-תאיות, ניתן לפספס בקלות כדורי חלקיקי ננו רשלנים יותר.לכן, חיוני לבצע את כל הצעד כפי שהוכח בפרוטוקול. שימוש בווסקולים חוץ-תאיים כסמן ביולוגי הוא כיום אחד ממחקרי השטח המתעוררים ביותר. ובקרוב, עשוי להיות מתורגם לאבחון הקליני המשמש ככלי סינון חלופי.

Research

JoVE Journal

Biology

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

זיהוי וניתוח של אבות עכבר Erythroid באמצעות CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

טכניקות לניתוח של תאית שלפוחית ​​שימוש cytometry הזרימה

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

טיהור וניתוח מסחטות של האלקאים ושלפוחיות

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

ניתוח מעקב חלקיקים לכימות וקביעת גודל של שלל חוץ-תאי

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

בידוד וטיהור מדרגיים של שלפוחיות חוץ-תאיות מ-Escherichia coli וחיידקים אחרים

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

בידוד ואפיון של שלפוחיות חוץ-תאיות ציאנובקטריאליות

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

בידוד של מיקרו-רנ"א מתרביות בלוטת הרוק של Tick Ex Vivo ושלפוחיות חוץ-תאיות

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

בידוד וניתוח של שלפוחיות חוץ-תאיות ניתנות למעקב ומתפקדות מהפלזמה והרקמות המוצקות

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

בידוד, אפיון ויישום טיפולי של שלפוחיות חוץ-תאיות מתאי גזע מזנכימליים אנושיים בתרבית

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...