Name: flow cytometric analysis of extracellular vesicles from cell-conditioned media
Uploaded: 2019-02-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media at JoVE.com

L.B. हेल्मुट Horten Stiftung और Velux Stiftung, ज्यूरिख (स्विट्जरलैंड) के अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । G.V. स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन, सीसिलिया-Augusta फाउंडेशन, लूगानो, और SHK Stiftung फर Herz-und Kreislaufkrankheiten (स्विट्जरलैंड) के अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था

1. वातानुकूलित मीडिया का संग्रह और संसाधन
<ol><li>कोट ५५ cm2 पंजाबियों में ०.०२% सुअर का त्वचा जिलेटिन के साथ पेट्री व्यंजन ।</li>
	<li>प्लेट सीपीसी (8000/सेमी2) है Iscove संशोधित Dulbecco मध्यम (IMDM) के 7 मिलीलीटर के साथ पूर्?...

<ol>
	<li>Barile, L., Vassalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+Therapy+delivery+tools+and+biomarkers+of+diseases.">Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. , (2017).</li><li>Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+secreted+vesicles+and+intercellular+communications.">Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications.</a> Molecular Biology Reports. 3, 15 (2011).</li><li>Yadav, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsy+in+pancreatic+cancer:+the+beginning+of+a+new+era.">Liquid biopsy in pancreatic cancer: the beginning of a new era.</a> Oncotarget. 9, 26900-26933 (2018).</li><li>Balbi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+Characterization+of+Human+Amniotic+Fluid+Stem+Cell+Extracellular+Vesicles+as+a+Powerful+Paracrine+Tool+Endowed+with+Regenerative+Potential.">First Characterization of Human Amniotic Fluid Stem Cell Extracellular Vesicles as a Powerful Paracrine Tool Endowed with Regenerative Potential.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6, 1340-1355 (2017).</li><li>Andriolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+From+Human+Cardiac+Progenitor+Cells+for+Therapeutic+Applications:+Development+of+a+GMP-Grade+Manufacturing+Method.">Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method.</a> Frontiers in Physiology. 9, (2018).</li><li>Lai, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+secreted+by+MSC+reduces+myocardial+ischemia/reperfusion+injury.">Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury.</a> Stem Cell Research. 4, (2009).</li><li>Doeppner, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles+Improve+Post-Stroke+Neuroregeneration+and+Prevent+Postischemic+Immunosuppression.">Extracellular Vesicles Improve Post-Stroke Neuroregeneration and Prevent Postischemic Immunosuppression.</a> Stem Cells Translational Medicine. 4, 1131-1143 (2015).</li><li>Kordelas, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC-derived+exosomes:+a+novel+tool+to+treat+therapy-refractory+graft-versus-host+disease.">MSC-derived exosomes: a novel tool to treat therapy-refractory graft-versus-host disease.</a> Leukemia. 28, 970-973 (2014).</li><li>Barile, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+human+cardiac+progenitor+cells+inhibit+cardiomyocyte+apoptosis+and+improve+cardiac+function+after+myocardial+infarction.">Extracellular vesicles from human cardiac progenitor cells inhibit cardiomyocyte apoptosis and improve cardiac function after myocardial infarction.</a> Cardiovascular Research. 103, 530-541 (2014).</li><li>Longatti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+affinity+single-chain+variable+fragments+are+specific+and+versatile+targeting+motifs+for+extracellular+vesicles.">High affinity single-chain variable fragments are specific and versatile targeting motifs for extracellular vesicles.</a> Nanoscale. 10, 14230-14244 (2018).</li><li>Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Microvesicles+from+Peripheral+Blood.">Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li><li>Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+analysis+of+extracellular+vesicles+using+flow+cytometry.">Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2015).</li><li>Arakelyan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Virometry+to+Analyze+Antigenic+Spectra+of+Virions+and+Extracellular+Vesicles.">Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li><li>Chimenti, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+adult+cardiac+stem/progenitor+cells+in+the+form+of+cardiospheres+from+human+cardiac+biopsies+and+murine+hearts.">Isolation and expansion of adult cardiac stem/progenitor cells in the form of cardiospheres from human cardiac biopsies and murine hearts.</a> Methods Molecular Biology. 879, 327-338 (2012).</li><li>van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry.">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nature Protocols. 7, 1311-1326 (2012).</li><li>Pospichalova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+protocol+for+flow+cytometry+analysis+of+fluorescently+labeled+exosomes+and+microvesicles+using+dedicated+flow+cytometer.">Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 25530 (2015).</li><li>van der Pol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+size+distribution+of+exosomes+and+microvesicles+determined+by+transmission+electron+microscopy,+flow+cytometry,+nanoparticle+tracking+analysis,+and+resistive+pulse+sensing.">Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12, 1182-1192 (2014).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updating+the+MISEV+minimal+requirements+for+extracellular+vesicle+studies:+building+bridges+to+reproducibility.">Updating the MISEV minimal requirements for extracellular vesicle studies: building bridges to reproducibility.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1396823 (2017).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cellular Biology. , (2006).</li><li>Suarez, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bead-assisted+flow+cytometry+method+for+the+semi-quantitative+analysis+of+Extracellular+Vesicles.">A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles.</a> Scientific Reports. 7, 11271 (2017).</li><li>Sodar, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-density+lipoprotein+mimics+blood+plasma-derived+exosomes+and+microvesicles+during+isolation+and+detection.">Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection.</a> Scientific Reports. 6, 24316 (2016).</li><li>Sluijter, J. P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+diagnostics+and+therapy+of+the+ischaemic+heart:+Position+Paper+from+the+Working+Group+on+Cellular+Biology+of+the+Heart+of+the+European+Society+of+Cardiology.">Extracellular vesicles in diagnostics and therapy of the ischaemic heart: Position Paper from the Working Group on Cellular Biology of the Heart of the European Society of Cardiology.</a> Cardiovascular Research. 114, 19-34 (2018).</li></ol>

पारंपरिक एफसी तकनीक सबसे सरल विश्लेषणात्मक तरीका EV की सतह पर व्यक्त मार्करों की विशेषता बनी हुई है । इस संबंध में, सबसे उपयुक्त प्रोटोकॉल का चयन साधन संवेदनशीलता के कारण सीमाओं से परहेज द्वारा ब्याज क?...

कोशिकाओं microvesicles (एमवी) और exosomes (Exo) सहित विभिन्न आकारों के extracellular बुलबुले (EV) स्रावित । बाद दोनों आकार और मूल के उपसेलुलर डिब्बे से एमवी से प्रतिष्ठित किया जा सकता है । एमवी (200 – आकार में 1000 एनएम) प्लाज्मा झिल्ली से बहा द्वारा माता पिता की कोशिकाओं से जारी कर रहे हैं । इसके विपरीत, Exo (30-150 एनएम) endosomal झिल्ली से शुरू होता है और extracellular अंतरिक्ष में जारी किए जाते है जब multivesicular शरीर (MVB) सेल झिल्ली1,2के साथ फ्यूज ।
EV तेजी से नैदानिक के रूप में के रूप में अच्छी तरह के रूप में उपयोग किया जाता है, संभवतः, कैंसर विज्ञान, तंत्रिका विज्ञान, कार्डियोलोजी, और पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस3,4,5सहित कई क्षेत्रों में चिकित्सीय उपकरण । चल रहे अध्ययनों का एक विशाल बहुमत चिकित्सीय एजेंटों के रूप में EV का उपयोग सेल से बुलबुले के अलगाव का फायदा उठाने के वातानुकूलित माध्यम (सेमी) इन विट्रो में प्रसंस्कृत कोशिकाओं । Mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) कई संदर्भों में लाभकारी प्रभाव डालती है, और एमएससी-व्युत्पंन EV के मॉडल में लाभ दिखाया गया है रोधगलन/reperfusion चोट6 और मस्तिष्क चोट7। एमएससी-व्युत्पंन EV भी प्रतिरक्षा modulatory गतिविधियों है कि प्रतिरक्षा अस्वीकृति के इलाज के लिए शोषण किया जा सकता है प्रदर्शन, के रूप में चिकित्सा के एक मॉडल में प्रदर्शन-दुर्दम्य भ्रष्टाचार बनाम-मेजबान रोग8। एमनियोटिक द्रव स्टेम कोशिकाओं (hAFS) सक्रिय रूप से MVs और Exo के साथ सेमी समृद्ध, विषम रूप से आकार में वितरित (50-1000 एनएम), जो इस तरह के विभेदित कोशिकाओं के प्रसार के रूप में कई जैविक प्रभाव, मध्यस्थता, angiogenesis, फाइब्रोसिस के निषेध, और cardioprotection4. हम हाल ही में दिखाया है कि EV, और विशेष रूप से Exo, मानव कार्डियक द्वारा स्रावित जनक कोशिकाओं (Exo-सीपीसी) चूहों में infarct आकार कम रोधगलन5,9.
Exo tetraspanins (CD63, CD81, CD9) और प्रमुख histocompatibility जटिल वर्ग मैं (MHC-i) सहित, उनकी सतह पर प्रोटीन का एक आम सेट साझा करें । प्रोटीन के इस आम सेट के अलावा, Exo भी उत्पादक सेल प्रकार के EV सबसेट के लिए विशिष्ट प्रोटीन होते हैं । Exo मार्करों सर्वोपरि महत्व प्राप्त कर रहे है क्योंकि वे अंतर में एक महत्वपूर्ण भूमिका सेलुलर संचार, जिससे कई जैविक प्रक्रियाओं को विनियमित5,10। क्योंकि उनके छोटे आकार के, एक आसान तरीका है EV शास्त्रीय प्रवाह cytometry (एफसी) का उपयोग कर एक चुनौतीपूर्ण कार्य रहता है खोज ।
यहां, हम EV एफसी का उपयोग कर विश्लेषण के लिए एक सरलीकृत प्रोटोकॉल मौजूद है, जो ultracentrifugation के माध्यम से या सीधे सेमी (चित्रा 1) के माध्यम से प्राप्त पूर्व समृद्ध नमूनों के लिए लागू किया जा सकता है । विधि अतिरिक्त बहाकर बिना विहित Exo-संबद्ध सतह epitopes (CD63, CD9, CD81) बांधता है कि एक विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ लेपित मोतियों का उपयोग करता है । एफसी विश्लेषण समायोजन के लिए कोई ज़रूरत नहीं माप से पहले के साथ एक पारंपरिक cytometer का उपयोग किया जा सकता है । प्रतिजनों के लक्षण वर्णन के लिए विधियां अलग छोटे प्रवाह cytometers का उपयोग कर कणों पर विभिंन अनुप्रयोगों के संबंध में अंय समूहों द्वारा वर्णित किया गया है11,12,13। यहां, हम छोटे कणों और Exo, एफसी द्वारा कब्जा कर लिया कणों के phenotyping के बाद के कब्जा के लिए कार्यात्मक चुंबकीय मोतियों का इस्तेमाल किया । हालांकि इस विधि के लिए छोटे इन विट्रो में किसी भी कोशिका प्रकार द्वारा जारी बुलबुले की प्रतिजनी संरचना विशेषताएं इस्तेमाल किया जा सकता है, यहां हम विशिष्ट सेल संस्कृति की स्थिति है कि मानव कार्डियक जनक कोशिकाओं की संस्कृति के लिए आवेदन (सीपीसी) प्रदान की और सबसे इन कोशिकाओं द्वारा EV के उत्पादन के लिए उपयुक्त वातावरण ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:816px;" width="816">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:369px;">IMDM</td>
			<td style="width:113px;">Gibco</td>
			<td style="width:235px;">12440061</td>
			<td style="width:99px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100&#160;kDa&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CytoFlex, Flow Cytometer Platform</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>CytoFlex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21063045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s PBS (PBS) Ca- and Mg-free</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-512F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExoCap CD63 Capture Kit</td>
			<td>JSR Life Sciences</td>
			<td>Ex-C63-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExoCap CD81 Capture Kit</td>
			<td>JSR Life Sciences</td>
			<td>Ex-C81-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExoCap CD9 Capture Kit</td>
			<td>JSR Life Sciences</td>
			<td>Ex-C9-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Exosome-Depleted FBS</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A2720801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Exosome-depleted FBS Media Supplement</td>
			<td>SBI</td>
			<td>EXO-FBS-250A-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS-Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-human CD9 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>312104&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; RRID: AB_2075894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow Cytometer analysis software</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Kaluza</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoSight LM10</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NanoSight LM10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoSight Software</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NTA 2.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optima Max-XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE anti-human CD63 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>353004&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; RRID:AB_10897809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE anti-human CD81 (TAPA-1) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>349505&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; RRID:AB_10642024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermomixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382 000 015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">TLA-110</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>TLA-110 rotors</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of extracellular vesicles from cell-conditioned media

फ्लो cytometry (एफसी) सेल-सतह प्रतिजन मार्कर के अर्द्ध मात्रात्मक माप के लिए पसंद की विधि है । हाल ही में, इस तकनीक को परिधीय रक्त और अन्य शरीर के तरल पदार्थ में exosomes (Exo) सहित extracellular बुलबुले (EV) के phenotypic विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया है । EV जनादेश के छोटे आकार 50-100 एनएम के आसपास एक का पता लगाने दहलीज होने समर्पित उपकरणों का उपयोग करें । वैकल्पिक रूप से, EV लेटेक्स microbeads के लिए बाध्य किया जा सकता है कि एफसी द्वारा पता लगाया जा सकता है । Microbeads, एंटीबॉडी के साथ संयुग्मित जो ev-संबद्ध मार्करों/Cluster of विभेद CD63, CD9, और CD81 का इस्तेमाल ev कैप्चर के लिए किया जा सकता है । सेमी से पृथक Exo के साथ या पूर्व संवर्धन के बिना ultracentrifugation द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है । यह दृष्टिकोण EV विश्लेषण पारंपरिक एफसी उपकरणों का उपयोग करने के लिए उपयुक्त है । हमारे परिणाम प्रतिदीप्ति तीव्रता (MFI) मूल्यों और EV एकाग्रता मतलब के बीच एक रैखिक सहसंबंध प्रदर्शित करता है । इस विधि झिल्ली मलबे का पता नहीं लगाता है, यह दर्शाता है कि sonication के माध्यम से EV नाटकीय रूप से कम MFI में खलल न डालें । हम EV surface एंटीजन के विश्लेषण के लिए एक सटीक और विश्वसनीय विधि की रिपोर्ट करते हैं, जिसे किसी भी प्रयोगशाला में आसानी से लागू किया जा सकता है ।

एकल धुंधला के लिए कणों की कुल संख्या
चूंकि एक एकल मनका एक से अधिक कण बांध कर सकते हैं, हम विभिंन स्थितियों का परीक्षण करने के लिए कुल EV (ट्यूब प्रति एक एंटीबॉडी) क?...

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Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

प्रोटोकॉल छोटे extracellular बुलबुले (EV) पर सतह epitopes का पता लगाने के लिए सेल कल्चर supernatants के साथ प्रयोग के लिए तैयार एक reproducible विधि का वर्णन करता है । यह विशिष्ट EV immunoprecipitation एंटीबॉडी कि सतह प्रतिजन CD9, CD63, और CD81 पहचान के साथ मिलकर मोतियों का उपयोग कर इस्तेमाल करता है । विधि बहाव प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए अनुकूलित है ।

कोशिका-वातानुकूलित मीडिया से Extracellular बुलबुले के प्रवाह Cytometric विश्लेषण

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

कई क्षेत्रों में एक नैदानिक बायोमार्कर और संभावित चिकित्सीय उपकरण के रूप में एक्सासेलुलर वेसिकल्स का तेजी से उपयोग किया जा रहा है। फ्लो साइटोमेट्रिक सूट का सामना करना पड़ा मार्कर द्वारा विशेषता के लिए सबसे सीधे आगे विश्लेषणात्मक विधि है इस प्रोटोकॉल का उपयोग एक आकार के कण का विश्लेषण करने में किया जा सकता है, तेज है, और विशेष सेटिंग या समर्पित उपकरण की आवश्यकता के बिना पारंपरिक भूकंपमीटर पर लागू होता है। यद्यपि इस प्रोटोकॉल का उपयोग अतिरिक्त रूप से उन स्थिति और माध्यम से बाहुलर वेसिकल्स को वर्गीकृत करने के लिए किया जाता है, लेकिन रोगियों में आक्रामक ऊतक बायोप्सी को बदलने के लिए रक्त के वर्गीकरण की दिशा में इसका विस्तार किया जा सकता है।प्रोटोकॉल के लिए नए शोधकर्ताओं के लिए, यह सेट अप विधि अनुभाग में वर्णित कदम प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण है, और बारीकी से प्रदर्शन हो रही रणनीतियों का पालन करने के लिए 02% पोर्सिन त्वचा जिलेटिन के साथ ५५ सेंटीमीटर चुकता पेट्री-व्यंजन कोटिंग द्वारा शुरू, PBS में । 15 मिनट के बाद, डिश और प्लेट 4.4 बार 10 को इस्कोव के संशोधित डल्बेको मीडियम या आईएमडीएम के 7 मिलीलीटर में प्रत्येक डिश पर पांचवें कार्डियक प्रोजेनिटर कोशिकाओं को धोएं, 20% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक, और 37 डिग्री सेल्सियस और 5 कार्बन डाइऑक्साइड पर उनके इनक्यूबेशन के लिए 1% पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन। जब कोशिकाएं लगभग 80% तक पहुंचती हैं, तो कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना दुलबेक्को के पीबीएस के साथ दो बार संस्कृतियों को धोएं और सीरम मुक्त एक्सोसोम उत्पादन माध्यम के 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को खिलाएं।7 दिनों के बाद, प्रत्येक प्लेट से वातानुकूलित माध्यम को एक पॉलीप्रोपाइलीन सेंट्रलाइज ट्यूब में पूल करें और किसी भी सेल मलबे को हटाने के लिए माध्यम को अपकेंद्रित्र करें। सुपरनेटेंट को 100 किलोडलटन सेंट्रलाइज फिल्टर ट्यूब में स्थानांतरित करें, और अतिरिक्त अपकेंद्रित्र के साथ स्वीकृत, वातानुकूलित, माध्यम को केंद्रित करें। एक अंतिम बेंचटॉप अपकेंद्रित्र के लिए एक माइक्रो सेंट्रलाइज ट्यूब में ध्यान स्थानांतरित करें और सुपरनेटेंट को पॉलीकार्बोनेट मोटी दीवार माइक्रो सेंट्रलाइज ट्यूब में जोड़ें।पीबीएस के साथ ट्यूब भरें, 3.2 milileters की अंतिम मात्रा में, और एक टाइटेनियम फिक्स्ड एंजेल रोटर में नमूना लोड। फिर रोटर को अल्ट्रासेंट्रफ्यूज के लिए टेबलटॉप अल्ट्रासेंट्रफ्यूज में लोड करें, और ताजा पीबीएस के 100 माइक्रोलीटर में गोली को फिर से खर्च करें। नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग और विश्लेषण क्वांटिफिकेशन के लिए, पीबीएस के 999 माइक्रोलीटर में अल्ट्रासेंट्रीफग्ड नमूने के 1 माइक्रोलीटर को पतला करें, और नमूने को बुलबुले के बिना 1 मिलिलेटर सिरिंज में लोड करें।परीक्षा कक्ष के इनलेट पोर्ट में सिरिंज लोड करें, और लेजर चालू करें। कैमरा खोलने के लिए कैप्चर बटन का उपयोग करें, और फोकस को समायोजित करें। फिर प्रत्येक 60 सेकंड के कम से कम तीन अलग-अलग फ्रेम रिकॉर्ड करें, और तीन अलग-अलग अधिग्रहणों का विश्लेषण करने के लिए सॉफ्टवेयर में बैच प्रक्रिया विकल्प का उपयोग करें।अधिग्रहण के लिए नमूना तैयार करने के लिए, पहले एक माइक्रो अपकेंद्रित्र ट्यूब में, एक 1:1:1 अनुपात में उपयुक्त प्रयोगात्मक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी संयुग्मित कैप्चर मोतियों को जोड़ें, और परिणामस्वरूप कैप्चर मनका पूल को भंवर दें। इसके बाद, कैप्चर मनका पूल के 1 माइक्रोलीटर में नमूने की उचित मात्रा जोड़ें ताकि 8 कणों के साथ-साथ 1.2 गुना 10 से 5 वें मोतियों प्रति परीक्षण एकाग्रता उत्पन्न हो सके। नकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक ट्यूब लेबल मोतियों में मोतियों के 1 माइक्रोलीटर जोड़ें, और ताजा पीबीएस के साथ 100 माइक्रोलीटर के लिए प्रत्येक ट्यूब में मात्रा को समायोजित करें।फिर ट्यूबों को थर्मो मिक्सर में रखें, मिलाते हुए, प्रति मिनट 400 घूर्णन पर, और 4 से 10 सेल्सियस, रात भर। अगले दिन, नमूनों को एक गोल नीचे 96 अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित करें, और प्रत्येक अच्छी तरह से उपयुक्त फ्लोरेस कंजूसी एंटीबॉडी जोड़ें। 4 से 10 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे इनक्यूबेशन के बाद, प्रत्येक अच्छी तरह से पीबीएस के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें, और अधिग्रहण सॉफ्टवेयर खोलें।साधन शुरू करने और एक नया प्रयोग खोलने के लिए, साइटोमीटर और सिस्टम स्टार्ट अप प्रोग्राम का चयन करें। एक प्रयोगात्मक टेम्पलेट बनाएं, और प्लेट का चयन करें और प्लेट जोड़ें। प्लेट पर नमूनों की स्थिति का चयन करें, और नमूना के रूप में अच्छी तरह से सेट पर क्लिक करें।नामकरण नियमों में नमूना नाम दर्ज करें, चैनल टैब खोलें, और उपयुक्त फ्लोरेसेंस सिग्नल चैनलों का चयन करें। अब थाली को यंत्र में लोड करें। और डॉट प्लॉट पर क्लिक करें, एक नया फॉरवर्ड स्कैटर एरिया बनाम साइड स्कैटर एरिया डॉट प्लॉट बनाने के लिए।लेजर और तरल पदार्थ शुरू करने के लिए आरंभिक चयन करें और अधिग्रहण शुरू करने के लिए रन पर क्लिक करें। आगे बनाम पक्ष तितर बितर साजिश के बीच में आबादी दिखाने के लिए पैमाने को समायोजित करें, और मलबे को बाहर करने के लिए पूरे नमूना आबादी के चारों ओर एक मोती गेट आकर्षित करें। क्लिक करें स्टॉप और डॉट प्लॉट आगे स्कैटर ऊंचाई बनाम फॉरवर्ड स्कैटर एरिया डॉट प्लॉट बनाने के लिए, और मोतियों की आबादी पर नमूना गेट करें।बड़ी आबादी के चारों ओर एक नया गेट बनाएं और इसे सिंगल्स नाम दें, और प्रति प्रयोगात्मक फ्लोरोफोर का उपयोग किए जाने वाले साइड स्कैटर एरिया डॉट प्लॉट बनाम एक फ्लोरोसेंट सिग्नल बनाने के लिए डॉट प्लॉट पर क्लिक करें। सिंगल्स पर नए डॉट प्लॉट को गेट करें । फिर रिकॉर्ड करने के लिए घटनाओं की संख्या का चयन करें, और प्रायोगिक अधिग्रहण शुरू करने के लिए रिकॉर्ड का चयन करें।विश्लेषण के अंत में, अधिग्रहण फ़ाइलों को उचित विश्लेषण सॉफ्टवेयर में लोड करें, और एक नया प्रोटोकॉल खोलें। प्रत्येक फ़ाइल के लिए डॉट प्लॉट बनाएं जैसा कि अभी प्रदर्शित किया गया है, और सभी स्कैटर एक्सिस को रैखिक पैमाने पर सेट करें, और सभी फ्लोरोसेंट अक्ष लॉग स्केल के लिए। फिर विभिन्न एक्सपेरिशियल वेसिकल तैयारियों में मतलब फ्लोरेसेंस तीव्रता में पूर्ण परिवर्तन की गणना करने के लिए, प्रासंगिक संकेतों चैनलों में फ्लोरेसेंस ज्यामितीय मतलब दिखाएं।एक मतलब फ्लोरेस तीव्रता वक्र के प्रारंभिक घातीय चरण तक पहुंचने के लिए एक्स्ट्रासेलुलर वेसिकल्स की सबसे छोटी कुल मात्रा निर्धारित करने के लिए विभिन्न शर्तों का परीक्षण करने के बाद, कणों की न्यूनतम संख्या 8 कणों प्रति धुंधला करने के लिए 1 गुना 10 होना निर्धारित किया गया था । गैर विशिष्ट एंटीबॉडी बाध्यकारी के बिना उच्चतम संकेत प्राप्त करने के लिए 1 गुना 10 से 8 कणों के लिए एंटीबॉडी की इष्टतम एकाग्रता, एंटी CD9_FITC और एंटी CD63_PE एंटीबॉडी के लिए एंटी CD63_PE एंटी CD63_PE एंटीलीटर के CD81_PE लिए पांच माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर के लिए 10 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर होना निर्धारित किया गया था। विधि की उपयुक्तता की पुष्टि करने के लिए, कप के आकार के बाह्य अतिशयीय वेसिकल्स का विश्लेषण करने के लिए, और झिल्ली मलबे नहीं, बाह्य ऊर्जा संबंधी वेसिकल्स को सोनिकेट किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप मतलब फ्लोरेसेंस तीव्रता में कमी आई थी, जिसके बाद 30 सेकंड के बाद सोनीसेंस, यांत्रिक व्यवधान के एक मिनट के बाद बिल्कुल भी फ्लोरोसेंस का पता नहीं चला।एक्स का प्रदर्शन के रूप में हृदय जनक कोशिकाओं से अपनी शुद्धि, अतिरिक्त सेलसेलर vesicles पैदावार, CD9 के कम स्तर और CD63 और CD81 के उच्च स्तर दोनों सेल आबादी से व्यक्त करते हैं । इसके अलावा, जबकि एक्स की अपनी सतह मार्कर अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन के बिना स्पष्ट रूप से पहचाने जाते हैं, यह संवर्धन कदम इन मार्कर की औसत फ्लोरेसेंस तीव्रता को बहुत बढ़ाता है। एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स के साथ काम करते समय, अधिक लापरवाह नैनो कण छर्रों को आसानी से याद किया जा सकता है।इसलिए, प्रोटोकॉल में प्रदर्शन के रूप में सभी चरणों का पालन करना आवश्यक है। बायोमार्कर के रूप में एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स का उपयोग करना अब सबसे उभरते क्षेत्र अनुसंधान में से एक है। और जल्द ही, एक वैकल्पिक स्क्रीनिंग उपकरण के रूप में इस्तेमाल नैदानिक नैदानिक में अनुवाद किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Biology

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

पहचान और माउस Erythroid progenitors के विश्लेषण CD71/TER119 परख फ्लो - cytometric का उपयोग

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

फ्लो का प्रयोग कोशिकी vesicles के विश्लेषण के लिए तकनीक

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस एक्सिटेलर वेसिकल्स का शुद्धिकरण और विश्लेषण

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स के क्वांटिफिकेशन और आकार निर्धारण के लिए नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

एस्चेरिचिया कोलाई और अन्य बैक्टीरिया से बाह्य पुटिकाओं का स्केलेबल अलगाव और शुद्धिकरण

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

सायनोबैक्टीरिया एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स का अलगाव और लक्षण वर्णन

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

टिक पूर्व विवो लार ग्रंथि संस्कृतियों और बाह्य पुटिकाओं से माइक्रोआरएनए का अलगाव

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

प्लाज्मा और ठोस ऊतकों से पता लगाने योग्य और कार्यात्मक बाह्य पुटिकाओं का अलगाव और विश्लेषण

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

सुसंस्कृत मानव मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं से बाह्य पुटिकाओं का अलगाव, लक्षण वर्णन और चिकित्सीय अनुप्रयोग

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...