Name: flow cytometric analysis of extracellular vesicles from cell-conditioned media
Uploaded: 2019-02-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media at JoVE.com

L.B. è stato sostenuto da borse di ricerca di Helmut Horten Stiftung e Velux Stiftung, Zurigo (Svizzera). G.V. è stato sostenuto da borse di ricerca di Swiss National Science Foundation, la Fondazione Cecilia-Augusta, Lugano e il SHK Stiftung für Herz-und Kreislaufkrankheiten (Svizzera)

1. raccolta ed elaborazione dei Media condizionati
<ol><li>Cappotto 55 cm2 capsule di Petri con gelatina di pelle porcina 0,02% in PBS.</li>
	<li>Piastra CPC (8.000/cm2) in piatti prerivestiti con 7 mL di per volta Dulbecco di Iscove Medium (IMDM) completati con 20% FBS (siero fetale bovino) e 1% di penicillina/streptomicina (P/S). Nota: Il termine "CPC" si riferisce alle cellule di espianto umano derivato che sono stati descritti altrove14. CM possono e...

<ol>
	<li>Barile, L., Vassalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+Therapy+delivery+tools+and+biomarkers+of+diseases.">Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. , (2017).</li><li>Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+secreted+vesicles+and+intercellular+communications.">Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications.</a> Molecular Biology Reports. 3, 15 (2011).</li><li>Yadav, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsy+in+pancreatic+cancer:+the+beginning+of+a+new+era.">Liquid biopsy in pancreatic cancer: the beginning of a new era.</a> Oncotarget. 9, 26900-26933 (2018).</li><li>Balbi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+Characterization+of+Human+Amniotic+Fluid+Stem+Cell+Extracellular+Vesicles+as+a+Powerful+Paracrine+Tool+Endowed+with+Regenerative+Potential.">First Characterization of Human Amniotic Fluid Stem Cell Extracellular Vesicles as a Powerful Paracrine Tool Endowed with Regenerative Potential.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6, 1340-1355 (2017).</li><li>Andriolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+From+Human+Cardiac+Progenitor+Cells+for+Therapeutic+Applications:+Development+of+a+GMP-Grade+Manufacturing+Method.">Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method.</a> Frontiers in Physiology. 9, (2018).</li><li>Lai, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+secreted+by+MSC+reduces+myocardial+ischemia/reperfusion+injury.">Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury.</a> Stem Cell Research. 4, (2009).</li><li>Doeppner, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles+Improve+Post-Stroke+Neuroregeneration+and+Prevent+Postischemic+Immunosuppression.">Extracellular Vesicles Improve Post-Stroke Neuroregeneration and Prevent Postischemic Immunosuppression.</a> Stem Cells Translational Medicine. 4, 1131-1143 (2015).</li><li>Kordelas, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC-derived+exosomes:+a+novel+tool+to+treat+therapy-refractory+graft-versus-host+disease.">MSC-derived exosomes: a novel tool to treat therapy-refractory graft-versus-host disease.</a> Leukemia. 28, 970-973 (2014).</li><li>Barile, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+human+cardiac+progenitor+cells+inhibit+cardiomyocyte+apoptosis+and+improve+cardiac+function+after+myocardial+infarction.">Extracellular vesicles from human cardiac progenitor cells inhibit cardiomyocyte apoptosis and improve cardiac function after myocardial infarction.</a> Cardiovascular Research. 103, 530-541 (2014).</li><li>Longatti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+affinity+single-chain+variable+fragments+are+specific+and+versatile+targeting+motifs+for+extracellular+vesicles.">High affinity single-chain variable fragments are specific and versatile targeting motifs for extracellular vesicles.</a> Nanoscale. 10, 14230-14244 (2018).</li><li>Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Microvesicles+from+Peripheral+Blood.">Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li><li>Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+analysis+of+extracellular+vesicles+using+flow+cytometry.">Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2015).</li><li>Arakelyan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Virometry+to+Analyze+Antigenic+Spectra+of+Virions+and+Extracellular+Vesicles.">Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li><li>Chimenti, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+adult+cardiac+stem/progenitor+cells+in+the+form+of+cardiospheres+from+human+cardiac+biopsies+and+murine+hearts.">Isolation and expansion of adult cardiac stem/progenitor cells in the form of cardiospheres from human cardiac biopsies and murine hearts.</a> Methods Molecular Biology. 879, 327-338 (2012).</li><li>van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry.">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nature Protocols. 7, 1311-1326 (2012).</li><li>Pospichalova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+protocol+for+flow+cytometry+analysis+of+fluorescently+labeled+exosomes+and+microvesicles+using+dedicated+flow+cytometer.">Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 25530 (2015).</li><li>van der Pol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+size+distribution+of+exosomes+and+microvesicles+determined+by+transmission+electron+microscopy,+flow+cytometry,+nanoparticle+tracking+analysis,+and+resistive+pulse+sensing.">Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12, 1182-1192 (2014).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updating+the+MISEV+minimal+requirements+for+extracellular+vesicle+studies:+building+bridges+to+reproducibility.">Updating the MISEV minimal requirements for extracellular vesicle studies: building bridges to reproducibility.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1396823 (2017).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cellular Biology. , (2006).</li><li>Suarez, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bead-assisted+flow+cytometry+method+for+the+semi-quantitative+analysis+of+Extracellular+Vesicles.">A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles.</a> Scientific Reports. 7, 11271 (2017).</li><li>Sodar, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-density+lipoprotein+mimics+blood+plasma-derived+exosomes+and+microvesicles+during+isolation+and+detection.">Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection.</a> Scientific Reports. 6, 24316 (2016).</li><li>Sluijter, J. P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+diagnostics+and+therapy+of+the+ischaemic+heart:+Position+Paper+from+the+Working+Group+on+Cellular+Biology+of+the+Heart+of+the+European+Society+of+Cardiology.">Extracellular vesicles in diagnostics and therapy of the ischaemic heart: Position Paper from the Working Group on Cellular Biology of the Heart of the European Society of Cardiology.</a> Cardiovascular Research. 114, 19-34 (2018).</li></ol>

La tecnica convenzionale FC rimane il più semplice metodo analitico per la caratterizzazione di marcatori espressi sulla superficie di EV. A questo proposito, selezionando il protocollo più adatto è fondamentale per ottenere informazioni utili sulle frazioni delle singole particelle di interesse evitando limitazioni a causa di sensibilità dello strumento. Abbiamo descritto un metodo che utilizza particelle magnetiche accoppiate con gli anticorpi che riconoscono Exo e piccoli antigeni di superficie di EV che sono adat...

Le cellule secernono vescicole extracellulari (EV) di diverse dimensioni tra cui microvescicole (MV) ed esosomi (Exo). Quest'ultimo può essere distinto da MV da entrambe le dimensioni e il compartimento subcellulare di origine. MV (200 – 1.000 nm in dimensioni) vengono rilasciati dalle cellule del genitore versando dalla membrana del plasma. Al contrario, Exo (30 – 150 nm) provengono dalle membrane endosomal e vengono rilasciati nello spazio extracellulare quando la MVB (MVB) si fondono con la membrana cellulare1,2.
EV sono sempre più utilizzati come biomarcatori diagnostici così come, potenzialmente, strumenti terapeutici in molti campi compreso oncologia, neurologia, la cardiologia e malattie del sistema muscoloscheletrico3,4,5. Una stragrande maggioranza degli studi in corso utilizzando EV come agenti terapeutici sfruttano l'isolamento delle vescicole dal cellulare-condizionato medium (CM) di cellule coltivate in vitro. Cellule staminali mesenchimali (MSCs) esercitare effetti benefici in vari contesti, e MSC-derivato EV hanno dimostrato benefici in modelli di ischemia/riperfusione miocardica lesione6 e cervello lesioni7. MSC-derivato EV inoltre esibiscono attività modulatory immuni che può essere sfruttata per trattare il rigetto immunitario, come dimostrato in un modello di malattia di terapia-refrattario graft - versus - host8. Le cellule staminali del liquido amniotiche (hAFS) attivamente arricchire CM con MVs ed Exo, eterogeneo nelle dimensioni (50 – 1.000 nm), che mediano gli effetti biologici diversi, come la proliferazione di cellule differenziate, angiogenesi, inibizione di fibrosi, e cardioprotezione4. Abbiamo recentemente dimostrato che EV e particolarmente Exo, secreta dalle cellule progenitrici derivate cardiaco umano (Exo-CPC) ridurre la dimensione di infarto del miocardio in ratti5,9.
Exo Condividi un insieme comune di proteine sulla loro superficie, tra cui tetraspannine (CD63, CD81, CD9) e complesso di istocompatibilità di classe I (MHC-I). Oltre a questo insieme comune delle proteine, Exo contengono anche proteine specifiche per il sottoinsieme di EV del tipo cella produttore. Marcatori di Exo stanno guadagnando importanza fondamentale perché giocano un ruolo cruciale nella comunicazione intercellulare, quindi che regolano molti processi biologici5,10. A causa delle loro piccole dimensioni, trovare un modo semplice per analizzare EV usando il classico flusso cytometry (FC) rimane un compito impegnativo.
Qui, presentiamo un protocollo semplificato per l'analisi di EV con FC, che può essere applicato a campioni pre-arricchiti ottenuti attraverso ultracentrifugazione o direttamente a CM (Figura 1). Il metodo utilizza perline rivestite con un anticorpo specifico che si lega epitopi superfici Exo-collegata canonici (CD63, CD9, CD81) senza ulteriori lavaggi. FC analisi possono essere eseguite utilizzando un citometro convenzionale senza necessità di regolazioni prima di misurazioni. Metodi per la caratterizzazione degli antigeni su singole piccole particelle utilizzando citometri a flusso sono state descritte da altri gruppi rispetto alle varie applicazioni11,12,13. Qui, abbiamo usato microsfere magnetiche funzionalizzate per la cattura di piccole particelle ed Exo, seguita da fenotipizzazione delle particelle catturate dalla FC. Anche se questo metodo può essere utilizzato per caratterizzare la composizione antigenica di piccole vescicole rilasciate da qualsiasi tipo di cellula in vitro, qui abbiamo fornito le condizioni di coltura delle cellule specifiche che si applicano per la coltura delle cellule progenitrici cardiache umane (CPC) e la maggior parte ambiente adatto per la produzione di EV da queste cellule.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:816px;" width="816">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:369px;">IMDM</td>
			<td style="width:113px;">Gibco</td>
			<td style="width:235px;">12440061</td>
			<td style="width:99px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100&#160;kDa&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CytoFlex, Flow Cytometer Platform</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>CytoFlex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21063045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s PBS (PBS) Ca- and Mg-free</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-512F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExoCap CD63 Capture Kit</td>
			<td>JSR Life Sciences</td>
			<td>Ex-C63-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExoCap CD81 Capture Kit</td>
			<td>JSR Life Sciences</td>
			<td>Ex-C81-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExoCap CD9 Capture Kit</td>
			<td>JSR Life Sciences</td>
			<td>Ex-C9-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Exosome-Depleted FBS</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A2720801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Exosome-depleted FBS Media Supplement</td>
			<td>SBI</td>
			<td>EXO-FBS-250A-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS-Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-human CD9 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>312104&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; RRID: AB_2075894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow Cytometer analysis software</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Kaluza</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoSight LM10</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NanoSight LM10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoSight Software</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NTA 2.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optima Max-XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE anti-human CD63 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>353004&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; RRID:AB_10897809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE anti-human CD81 (TAPA-1) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>349505&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; RRID:AB_10642024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermomixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382 000 015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">TLA-110</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>TLA-110 rotors</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of extracellular vesicles from cell-conditioned media

Citometria a flusso (FC) è il metodo di scelta per misurazione semi-quantitativa dei marcatori di superficie cellulare antigene. Recentemente, questa tecnica è stata utilizzata per le analisi fenotipiche di vescicole extracellulari (EV) tra cui esosomi (Exo) nel sangue periferico e altri fluidi corporei. Le piccole dimensioni di EV impone l'utilizzo di strumenti dedicati, avendo una soglia di rilevamento intorno 50-100 nm. In alternativa, EV può essere associato a microsfere in lattice che possono essere rilevati da FC. Microsfere, coniugato con gli anticorpi che riconoscono EV-collegata marcatori/Cluster di differenziazione CD63, CD9 e CD81 può essere utilizzato per la cattura di EV. Exo isolato da CM possa essere analizzato con o senza pre-arricchimento di ultracentrifugazione. Questo approccio è adatto per analisi di EV utilizzando strumenti convenzionali di FC. I nostri risultati dimostrano una correlazione lineare tra i valori di intensità di fluorescenza media (MFI) e concentrazione di EV. Perturbare EV tramite sonicazione drammaticamente diminuito MFI, che indica che il metodo non rileva i detriti della membrana. Segnaliamo un metodo accurato ed affidabile per l'analisi degli antigeni di superficie EV, che può essere implementato facilmente in qualsiasi laboratorio.

Numero totale di particelle per la colorazione del singolo
Poiché una singola perlina possibile associare più di una particella, abbiamo testato diverse condizioni per impostare la quantità minima di totale EV (singolo anticorpo per provetta) per raggiungere la prima fase esponenziale della curva delle IFM. Una concentrazione fissa di anticorpo è stata utilizzata mentre il numero totale di particelle ha vari...

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Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Il protocollo descrive un metodo riproducibile progettato per l'utilizzo con i surnatanti di coltura cellulare per rilevare superfici epitopi sulle piccole vescicole extracellulari (EV). Utilizza specifici EV immunoprecipitazione usando i branelli accoppiati con gli anticorpi che riconoscono l'antigene di superficie CD9, CD63 e CD81. Il metodo è ottimizzato per l'analisi di citometria a flusso a valle.

Analisi citofluorimetrica delle vescicole extracellulari dal supporto di cella-condizionato

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Le vescicole extracellulari sono sempre più utilizzate come biomarcatore diagnostico e potenziale strumento terapeutico in molti campi. Flow Cytometric è il metodo analitico più dritto per caratterizzare con marcatori con faccia a tuta questo protocollo può essere utilizzato nell'analisi di una particella assizzata, è veloce ed è applicabile ai sismometri convenzionali senza la necessità di un'impostazione speciale o dello strumento dedicato. Sebbene questo protocollo sia usato per classificare le vescicole extracellulari da tale condizione e mezzo, può essere espanso verso la categorizzazione dei CV arrivati dal sangue, per sostituire le biopsie tissutali invasive nei pazienti.Per i ricercatori nuovi al protocollo, è fondamentale eseguire i passaggi descritti nella sezione del metodo di set-up e seguire da vicino le strategie di ottenere dimostrate Iniziare rivestendo 55 centimetri di petri-dishes squadrati con 02% gelatina di pelle suina, in PBS. Dopo 15 minuti, lavare il piatto e il piatto 4,4 volte 10 alla quinta cellule progenitrici cardiache su ogni piatto in 7 millilitri del Medium di Dulbecco modificato di Iscove, o IMDM, integrato con siero bovino fetale al 20%, e 1%penicillina e streptomicina per la loro incubazione a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Quando le cellule raggiungono circa l'80% di confluenza, lavare le colture due volte con il PBS di Dulbecco senza calcio e magnesio e nutrire le cellule con 10 milileter di mezzo di produzione esosoma privo di siero.Dopo 7 giorni, mettere in comune il mezzo condizionato da ogni piastra, in un unico tubo di centrifuga in polipropilene e centrifugare il mezzo per rimuovere eventuali detriti cellulari. Trasferire il supernatente in un tubo filtrante di centrifuga da 100 kilodalton e concentrare il mezzo sgombrato, condizionato, con una centrifugazione aggiuntiva. Trasferire il concentrato in un tubo di micro centrifuga per una centrifugazione finale sul banco e aggiungere il supernatent in un tubo di microfuga a parete spesso in policarbonato.Riempire il tubo con PBS, ad un volume finale di 3,2 milileters, e caricare il campione in un rotore angeled fisso in titanio. Quindi caricare il rotore in un ultracentrifugo da tavolo per l'ultracentrifugazione e rimescolare il pellet in 100 microlitri di PBS fresco. Per il tracciamento e la quantificazione dell'analisi delle nanoparticelle, diluire 1 microliter del campione ultracentrifugato, in 999 microlitri di PBS, e caricare il campione in una siringa da 1 milileter senza bolle.Caricare la siringa nella porta di ingresso della camera d'esame e accendere il laser. Usa il pulsante di acquisizione per aprire la fotocamera e regolare la messa a fuoco. Quindi registrare almeno tre diversi fotogrammi di 60 secondi ciascuno e utilizzare l'opzione di processo batch nel software, per analizzare le tre diverse acquisizioni.Per preparare il campione all'acquisizione, aggiungere innanzitutto l'anticorpo monoclonale sperimentale appropriato coniugato perline di cattura ad un rapporto 1:1:1, in un tubo di micro centrifuga e vortice il pool di perline di cattura risultante. Successivamente, aggiungere il volume appropriato del campione a 1 microliter di pool di perline di cattura per generare un 1 per 10 alle 8 particelle più 1,2 per 10 al 5 ° perline per concentrazione di prova. Aggiungere 1 microlitro di perline a un tubo etichettato perline come controllo negativo e regolare il volume in ogni tubo a 100 microlitri con PBS fresco.Quindi posizionare i tubi in un termo miscelatore, con scuotimento, a 400 rotazioni al minuto e da 4 a 10 Celsius, durante la notte. Il giorno successivo, trasferire i campioni su un fondo rotondo di 96 piastra del pozzo e aggiungere gli anticorpi coniugati a florescence appropriati ad ogni pozzo. Dopo un'incubazione di 1 ora a 4-10 gradi Celsius, aggiungere 100 microlitri di PBS a ogni pozzo e aprire il software di acquisizione.Selezionare il citometro e il programma di avvio del sistema, per avviare lo strumento e aprire un nuovo esperimento. Creare un modello sperimentale e selezionare la piastra e aggiungere la piastra. Selezionare la posizione dei campioni sulla piastra e fare clic anche sul set come campione.Immettere il nome di esempio nelle regole di denominazione, aprire la scheda canale e selezionare i canali di segnale di florescence appropriati. Ora carica la piastra nello strumento. Quindi fate clic su traccia punto (Dot Plot), per creare una nuova area di dispersione in avanti rispetto al tracciato punto dell'area di dispersione laterale.Selezionare initialize per avviare il laser e la fluidica e fare clic su Esegui per avviare l'acquisizione. Regolare la scala per mostrare la popolazione al centro del grafico a dispersione anteriore rispetto a quello laterale e disegnare un cancello di perline intorno all'intera popolazione campione per escludere i detriti. Fate clic su interrompi (stop and dot plot) per creare un'altezza di dispersione in avanti rispetto al tracciato punto dell'area di dispersione in avanti e aprite il campione sulla popolazione di perline.Disegna un nuovo cancello intorno alla popolazione più grande e denominalo Singlets e fai clic sul grafico dei punti per creare un segnale fluorescente rispetto al grafico a punti dell'area di dispersione laterale, per fluoroforo sperimentale utilizzato. Porta il nuovo grafico a punti sui Singlets. Selezionare quindi il numero di eventi da registrare e selezionare il record per avviare l'acquisizione sperimentale.Al termine dell'analisi, caricare i file di acquisizione nel software di analisi appropriato e aprire un nuovo protocollo. Create tracciati di punti per ogni file come appena dimostrato, impostate tutto l'asse di dispersione su scala lineare e tutto l'asse florescente per registrare la scala. Quindi mostra la media geometrica della florescence nei canali dei segnali rilevanti, per calcolare il cambiamento completo nell'intensità media della florescence, nei diversi preparati vescicolari extracellulari.Dopo aver testato diverse condizioni per impostare la più piccola quantità totale di vescicole extracellulari per raggiungere la fase esponenziale iniziale di una curva di intensità di florescence media, il numero minimo di particelle è stato determinato essere 1 per 10 alle 8 particelle relative alla colorazione. La concentrazione ottimale di anticorpi per 1 per 10 contro le 8 particelle per ottenere il segnale più alto senza legame anticorpale non specifico, è stata determinata in 10 microgrammi per millilitro sia per gli anticorpi anti CD9_FITC che anti CD63_PE e cinque microgrammi per millilitro per l'anticorpo anti CD81_PE. Per confermare l'idoneità del metodo, per l'analisi delle vescicole extracellulari a forma di tazza, e non dei detriti della membrana, le vescicole extracellulari sono state sonicate, con conseguente diminuzione dell'intensità media della florescence, dopo appena 30 secondi di sonicazione, senza alcuna florescence rilevata dopo un minuto di interruzione meccanica.La purificazione di X dalle cellule progenitrici cardiache come dimostrato, produce vescicole extracellulari, esprimendo bassi livelli di CD9 e alti livelli di CD63 e CD81 da entrambe le popolazioni cellulari. Inoltre, mentre i marcatori superficiali di X sono chiaramente identificabili senza ultracentrifugazione, questo passo di arricchimento migliora notevolmente l'intensità media di florescence di questi marcatori. Quando si lavora con vescicole extracellulari, ci sono più pellet di nano particelle incuranti che possono essere facilmente persi.Pertanto, è essenziale seguire tutti i step come dimostrato nel protocollo. L'uso di vescicole extracellulari come biomarcatore è ora una delle ricerche sul campo più emergenti. E presto, potrebbe essere tradotto nella diagnostica clinica utilizzata come strumento di screening alternativo.

Research

JoVE Journal

Biology

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Ricerca

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