Name: flow cytometric analysis of extracellular vesicles from cell-conditioned media
Uploaded: 2019-02-12T14:00:00
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法学は、ヘルムート ・ ホルテン財団、チューリッヒ (スイス) ベルックス財団の研究助成金によって支えられました。ビデオカードはぷ 【 毛皮ヘルツ und Kreislaufkrankheiten (スイス)、ルガーノ、セシリア オーガスタ財団スイスの全米科学財団の研究助成金によって支えられました。

1. 収集と条件付けのメディアの処理
<ol><li>PBS で 0.02% 豚皮ゼラチンで 55 cm2ペトリ皿をコートします。</li>
	<li>7 ml Iscove の変更ダルベッコ媒体 (IMDM) 20 補足の CPC (8,000/cm2) プレコート料理をプレート %fbs (ウシ胎児血清)、1% ペニシリン/ストレプトマイシン (P/S)。 注:他の場所で14に記載されている「CPC」がされている人間の植派生セルを指します?...

<ol>
	<li>Barile, L., Vassalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+Therapy+delivery+tools+and+biomarkers+of+diseases.">Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. , (2017).</li><li>Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+secreted+vesicles+and+intercellular+communications.">Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications.</a> Molecular Biology Reports. 3, 15 (2011).</li><li>Yadav, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsy+in+pancreatic+cancer:+the+beginning+of+a+new+era.">Liquid biopsy in pancreatic cancer: the beginning of a new era.</a> Oncotarget. 9, 26900-26933 (2018).</li><li>Balbi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+Characterization+of+Human+Amniotic+Fluid+Stem+Cell+Extracellular+Vesicles+as+a+Powerful+Paracrine+Tool+Endowed+with+Regenerative+Potential.">First Characterization of Human Amniotic Fluid Stem Cell Extracellular Vesicles as a Powerful Paracrine Tool Endowed with Regenerative Potential.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6, 1340-1355 (2017).</li><li>Andriolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+From+Human+Cardiac+Progenitor+Cells+for+Therapeutic+Applications:+Development+of+a+GMP-Grade+Manufacturing+Method.">Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method.</a> Frontiers in Physiology. 9, (2018).</li><li>Lai, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+secreted+by+MSC+reduces+myocardial+ischemia/reperfusion+injury.">Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury.</a> Stem Cell Research. 4, (2009).</li><li>Doeppner, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles+Improve+Post-Stroke+Neuroregeneration+and+Prevent+Postischemic+Immunosuppression.">Extracellular Vesicles Improve Post-Stroke Neuroregeneration and Prevent Postischemic Immunosuppression.</a> Stem Cells Translational Medicine. 4, 1131-1143 (2015).</li><li>Kordelas, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC-derived+exosomes:+a+novel+tool+to+treat+therapy-refractory+graft-versus-host+disease.">MSC-derived exosomes: a novel tool to treat therapy-refractory graft-versus-host disease.</a> Leukemia. 28, 970-973 (2014).</li><li>Barile, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+human+cardiac+progenitor+cells+inhibit+cardiomyocyte+apoptosis+and+improve+cardiac+function+after+myocardial+infarction.">Extracellular vesicles from human cardiac progenitor cells inhibit cardiomyocyte apoptosis and improve cardiac function after myocardial infarction.</a> Cardiovascular Research. 103, 530-541 (2014).</li><li>Longatti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+affinity+single-chain+variable+fragments+are+specific+and+versatile+targeting+motifs+for+extracellular+vesicles.">High affinity single-chain variable fragments are specific and versatile targeting motifs for extracellular vesicles.</a> Nanoscale. 10, 14230-14244 (2018).</li><li>Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Microvesicles+from+Peripheral+Blood.">Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li><li>Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+analysis+of+extracellular+vesicles+using+flow+cytometry.">Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2015).</li><li>Arakelyan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Virometry+to+Analyze+Antigenic+Spectra+of+Virions+and+Extracellular+Vesicles.">Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li><li>Chimenti, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+adult+cardiac+stem/progenitor+cells+in+the+form+of+cardiospheres+from+human+cardiac+biopsies+and+murine+hearts.">Isolation and expansion of adult cardiac stem/progenitor cells in the form of cardiospheres from human cardiac biopsies and murine hearts.</a> Methods Molecular Biology. 879, 327-338 (2012).</li><li>van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry.">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nature Protocols. 7, 1311-1326 (2012).</li><li>Pospichalova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+protocol+for+flow+cytometry+analysis+of+fluorescently+labeled+exosomes+and+microvesicles+using+dedicated+flow+cytometer.">Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 25530 (2015).</li><li>van der Pol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+size+distribution+of+exosomes+and+microvesicles+determined+by+transmission+electron+microscopy,+flow+cytometry,+nanoparticle+tracking+analysis,+and+resistive+pulse+sensing.">Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12, 1182-1192 (2014).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updating+the+MISEV+minimal+requirements+for+extracellular+vesicle+studies:+building+bridges+to+reproducibility.">Updating the MISEV minimal requirements for extracellular vesicle studies: building bridges to reproducibility.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1396823 (2017).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cellular Biology. , (2006).</li><li>Suarez, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bead-assisted+flow+cytometry+method+for+the+semi-quantitative+analysis+of+Extracellular+Vesicles.">A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles.</a> Scientific Reports. 7, 11271 (2017).</li><li>Sodar, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-density+lipoprotein+mimics+blood+plasma-derived+exosomes+and+microvesicles+during+isolation+and+detection.">Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection.</a> Scientific Reports. 6, 24316 (2016).</li><li>Sluijter, J. P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+diagnostics+and+therapy+of+the+ischaemic+heart:+Position+Paper+from+the+Working+Group+on+Cellular+Biology+of+the+Heart+of+the+European+Society+of+Cardiology.">Extracellular vesicles in diagnostics and therapy of the ischaemic heart: Position Paper from the Working Group on Cellular Biology of the Heart of the European Society of Cardiology.</a> Cardiovascular Research. 114, 19-34 (2018).</li></ol>

従来の FC 技術のまま EV の表面に発現するタンパク質を特徴付ける最も簡単な分析法です。この点では、最も適切なプロトコルを選択する測定器の感度に起因する制限を回避することによって興味の個々 の粒子分画に関する有用な情報を取得することが重要です。Exo と下流の FC アプリケーションに適している小型 EV の表面抗原を認識する抗体が結合した磁性粒子を用いた方法について述べ?...

細胞は、細胞膜小胞 (EV) 機構の解明 (MV) とエクソソーム (Exo) などを含むさまざまなサイズを分泌します。後者は、サイズと起源の細胞レベル下コンパートメントによって MV から区別することがことができます。MV (サイズ 200-1,000 nm) は細胞膜からの放出に親細胞から解放されます。逆に、Exo (30-150 nm) はエンドソーム膜に属し、多胞体 (MVB) 融合細胞膜1,2と、細胞外の空間に解放されます。
EV は、ますます腫瘍、神経、循環器、筋骨格系疾患3,4,5など多くの分野での治療のツールだけでなく、潜在的に、診断バイオ マーカーとして使用します。治療薬の in vitro 培養細胞の細胞調整培 (CM) からの小胞の分離を悪用する EV を使用して進行中の研究の大半。間葉系幹細胞 (Msc) は、いくつかの文脈で有益な効果を発揮し、MSC から派生した EV は、心筋虚血・再灌流傷害6と脳損傷7のモデルの利点を示しています。MSC から派生した EV も免疫調節活動療法不応接木対ホスト病8のモデルで示されているように、免疫拒絶反応を治療するために悪用される可能性を示します。羊水幹細胞 (hAFS) 積極的に豊かに MVs と Exo、異質のサイズ (50-1,000 nm)、分散増殖分化した細胞、血管、線維化の抑制など、いくつかの生物学的効果を媒介する CM、心臓保護機4。あることを示した最近 EV、そして特に Exo、ひと心臓由来神経前駆細胞 (Exo のクリック単価) から分泌されるラット5,9心筋梗塞サイズの低減します。
Exo tetraspanins (CD63 CD81、CD9) と主要組織適合複合体などを含む、彼らの表面のタンパク質の共通セットを共有クラス I (MHC-私)。蛋白質のこの一般的なセットに加えて Exo にはもプロデューサー セル型の EV のサブセットに固有蛋白質にはが含まれています。彼らは多くの生物学的プロセス5,10を規制することにより、細胞間のコミュニケーションに重要な役割を果たすために、エキソ マーカーは重要を得ています。サイズが小さい、やりがいのある仕事の古典的な流れ cytometry (FC) のまま使用して EV を分析する簡単な方法を見つけること。
ここでは、EV 分析超遠心法による前濃縮試料、または CM (図 1) に直接適用できる FC を使用して簡略化されたプロトコルを提案する.メソッドは、追加の洗浄せず正規 Exo 関連表面抗原 (CD63、CD9、CD81) にバインドする特定の抗体をコートしたビーズを使用します。FC の分析は、測定前に調整を必要とせず、従来の cytometer を使用して実行できます。抗原流れの cytometers を使用して個々 の小さな粒子の特性評価のための方法は、さまざまなアプリケーション11,12,13に関して他のグループによって記述されています。ここでは、小さな粒子と Exo、FC によってキャプチャされた粒子の表現型解析に続いての捕獲のため機能性磁気ビーズを使用しました。このメソッドは、試験管内の任意のセル型が発表した小さな小胞の抗原組成の特性評価に使用できますが、ここで我々 ひと心臓前駆細胞 (CPC) の文化の最も適用特定細胞培養条件を提供これらの細胞によって EV の生産のための適切な環境。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:816px;" width="816">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:369px;">IMDM</td>
			<td style="width:113px;">Gibco</td>
			<td style="width:235px;">12440061</td>
			<td style="width:99px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100&#160;kDa&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CytoFlex, Flow Cytometer Platform</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>CytoFlex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21063045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s PBS (PBS) Ca- and Mg-free</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-512F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExoCap CD63 Capture Kit</td>
			<td>JSR Life Sciences</td>
			<td>Ex-C63-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExoCap CD81 Capture Kit</td>
			<td>JSR Life Sciences</td>
			<td>Ex-C81-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExoCap CD9 Capture Kit</td>
			<td>JSR Life Sciences</td>
			<td>Ex-C9-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Exosome-Depleted FBS</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A2720801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Exosome-depleted FBS Media Supplement</td>
			<td>SBI</td>
			<td>EXO-FBS-250A-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS-Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-human CD9 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>312104&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; RRID: AB_2075894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow Cytometer analysis software</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Kaluza</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoSight LM10</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NanoSight LM10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoSight Software</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NTA 2.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optima Max-XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE anti-human CD63 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>353004&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; RRID:AB_10897809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE anti-human CD81 (TAPA-1) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>349505&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; RRID:AB_10642024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermomixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382 000 015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">TLA-110</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>TLA-110 rotors</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of extracellular vesicles from cell-conditioned media

フローサイトメトリー (FC) は、細胞表面抗原マーカーの半定量的測定の選択の方法です。最近、この手法は、末梢血液や他の体液でエクソソーム (Exo) を含む細胞小胞 (EV) の表現型分析に使用されています。小型 EV の周り検出しきい値を持つ専用機器の使用を義務付けて 50 ~ 100 nm。また、EV は、FC で検出できるラテックス ビーズにバインドできます。マイクロ ビーズ、EV 関連マーカー/CD81、CD9、分化 CD63 のクラスターを認識する抗体の共役を使用ことができます EV キャプチャ用。CM から分離された Exo は、超遠心法による前濃縮の有無を分析できます。このアプローチは、従来の FC の楽器を使用して EV 分析に適しています。EV 濃度の平均蛍光強度 (MFI) 値と相関を示した。超音波処理によって劇的に EV を中断することと、MFI、メソッドが膜破片を検出されませんを示すが減少しました。あらゆる研究室で簡単に実装することができます EV の表面抗原の解析の正確かつ信頼性の高い方法を報告する.

単一の汚損のためのパーティクルの総数
以来、1 つのビードは、1 つ以上の粒子をバインドできます、MFI 曲線の初期指数段階に到達する総 EV (チューブあたり単一抗体) の最小量を設定するのにはさまざまな条件をテストしました。固定抗体濃度が 5 × 105 〜 2.5 x 10 の粒子の総数中使用された8?...

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Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

プロトコルでは、小さな細胞小胞 (EV) の表面の抗原を検出する細胞培養上清を使用のために設計された再現可能な方法について説明します。それは、CD63 と CD81 CD9、表面抗原を認識する抗体が結合したビーズを用いた特定の EV 免疫沈降を利用しています。メソッドは、下流の流れフローサイトメトリー分析に最適です。

フローサイトメトリー法による細胞小胞細胞調節されたメディアからの解析します。

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

細胞外小胞は、多くの分野で診断バイオマーカーおよび潜在的な治療ツールとしてますます使用されています。フローサイトメトリクスは、スーツ直面マーカーによって特徴付けるための最も簡単な前方分析方法であり、このプロトコルは、アスサイズ粒子の分析に使用することができ、高速であり、特別な設定や専用の機器を必要とせずに従来の地震計に適用可能です。このプロトコルは、前記の状態および媒体から細胞外小胞を分類するために使用されるが、それは患者の侵襲的な組織生検を置き換えるために、血液到着したAVの分類に向けて拡大することができる。このプロトコルに新しい研究者にとって、セットアップ方法セクションに記載されている手順を実行し、PBSで02%ブタの皮膚ゼラチンで55センチメートル平方のペトリ皿をコーティングすることで始まる実証された取得戦略に密接に従うことが重要です。15分後、イコーブの修飾されたダルベッコ培地(IMDM)の7ミリリットルの各皿に皿とプレートを4.4回10回洗浄し、20%の胎児性ウシ血清を添加し、1%ペニシリンとレンサプトマイシンを37°Cで孵化させます。細胞が約80%の合流度に達したら、カルシウムとマグネシウムを使わずにダルベッコのPBSで培養液を2回洗浄し、10ミリレターの血清遊離エキソソーム産生培地で細胞を供給する。7日後、各プレートからコンディショションされた培地を、単一のポリプロピレン遠心分離管にプールし、培地を遠心分離して、任意の細胞の破片を除去する。スーパーナテントを100キロダルトン遠心分離フィルターチューブに移し、クリア、コンディショニング、追加の遠心分離を伴う培地を濃縮する。濃縮物をマイクロ遠心管に移して最終的なベンチトップ遠心分離を行い、スーパーナテントをポリカーボネート厚い壁のマイクロ遠心分離管に加えます。3.2ミリエーターの最終容積にPBSでチューブを充填し、チタン固定天使ローターにサンプルをロードします。次にローターを卓上超遠心分離機に積み込み、新鮮なPBSを100マイクロリットルで再懸濁します。ナノ粒子追跡および分析定量のために、PBSの999マイクロリットルで、超遠心サンプルの1マイクロリットルを希釈し、泡なしで1ミリリットルシリンジにサンプルをロードする。検査室の入口口に注射器を積み込み、レーザーをオンにします。キャプチャボタンを使用してカメラを開き、フォーカスを調整します。次に、それぞれ60秒の少なくとも3つの異なるフレームを記録し、ソフトウェアのバッチ処理オプションを使用して、3つの異なる取得を分析します。サンプルを取得するために準備するために、まず適切な実験的モノクローナル抗体結合捕捉ビーズを1:1比で加え、マイクロ遠心管に、そして得られた捕獲ビードプールをボルテックスする。次に、適切な量のサンプルを1マイクロリットルの捕獲ビードプールに加え、8粒子に10倍10を生成し、試験濃度あたり5番目のビーズに1.2倍の10を加えた。マイナスコントロールとしてビーズとラベル付けされたチューブに1マイクロリットルのビーズを加え、新鮮なPBSで各チューブの体積を100マイクロリットルに調整します。その後、1分間に400回転、摂氏4~10°Cで一晩、サーモミキサーにチューブを入れます。翌日、サンプルをラウンドボトム96ウェルプレートに移し、適切な蛍光共役抗体を各ウェルに加える。摂氏4~10度で1時間のインキュベーションを行った後、各井戸に100マイクロリットルのPBSを加え、取得ソフトウェアを開きます。サイトメーターとシステム起動プログラムを選択して、計器を起動し、新しい実験を開きます。実験テンプレートを作成し、プレートを選択してプレートを追加します。プレート上のサンプルの位置を選択し、サンプルとして設定をクリックします。命名規則にサンプル名を入力し、チャネルタブを開き、適切な蛍光信号チャネルを選択します。今度は、プレートを機器にロードします。そして、ドットプロットをクリックして、新しい前方散乱領域対側面散乱領域ドットプロットを作成します。初期化を選択してレーザーと流体を開始し、[実行]をクリックして取得を開始します。前方散布図と側散布図の中間に母集団を表示するようにスケールを調整し、サンプル母集団全体の周囲にビーズゲートを描画して破片を除外します。[ストップ]および[ドット プロット]をクリックして、前方散乱高さと前方散乱領域ドットプロットを作成し、ビーズの母集団にサンプルをゲートします。より大きな集団の周りに新しいゲートを描き、Singletsという名前を付け、ドットプロットをクリックして、使用した実験的なフルオロフォアごとに1つの蛍光信号対側散乱領域ドットプロットを作成します。シングルの新しいドットプロットをゲートします。次に、記録するイベントの数を選択し、レコードを選択して、実験的な取得を開始します。解析の最後に、取得ファイルを適切な解析ソフトウェアにロードし、新しいプロトコルを開きます。ちょうど示したように、各ファイルのドット プロットを作成し、すべての散布軸を線形スケールに、すべてのフローレス軸をログ スケールに設定します。次に、関連するシグナルチャネルにおける蛍光幾何平均を示し、平均蛍光強度の全変化を、異なる細胞外小胞調製物において計算する。異なる条件をテストして細胞外小胞の最小総量を平均蛍光強度曲線の初期指数相に到達するように設定した後、最小粒子数は染色ごとに8粒子に10倍であると判断した。非特異性抗体結合を伴わない最高シグナルを達成するために10〜8粒子の抗体の最適濃度は、抗CD9_FITCおよび抗CD63_PE抗体の両方に対して1ミリリットル当たり10マイクログラム、抗体CD81_PE抗体に対して5マイクログラムであると判断した。この方法の適合性を確認するために、膜内の破片ではなく、カップ状の細胞外小胞を分析するために、細胞外小胞を超音波処理し、平均蛍光強度の減少をもたらし、わずか30秒の超音波処理の後、機械的破壊の1分後に全く蛍光が検出されなかった。示されているように心臓前駆細胞からのX自身の精製は、細胞外小胞を生み出し、両方の細胞集団から低レベルのCD9およびCD63およびCD81の高レベルを発現する。さらに、X自身の表面マーカーは超遠心分離なしで明確に識別可能であるが、この濃縮ステップは、これらのマーカーの平均の蛍光強度を大幅に高める。細胞外小胞を扱う場合、より不注意なナノ粒子ペレットが簡単に見逃すことができます。したがって、プロトコルで示されているように、すべての手順に従う必要があります。細胞外小胞をバイオマーカーとして使用することは、現在最も新しい分野研究の1つです。そして、すぐに、代替スクリーニングツールとして使用される臨床診断に翻訳されてもよい。

Research

JoVE Journal

Biology

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

CD71/TER119フローサイトメトリーアッセイを用いてマウス赤血球前駆細胞の同定と解析

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

フローサイトメトリーを用いて細胞外小胞の分析のための技術

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

細胞外小胞体のカエノールハブディティス・エレガンスの精製と分析

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

細胞外小胞の定量とサイズ決定のためのナノ粒子追跡解析

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

大腸菌およびその他の細菌からの細胞外小胞のスケーラブルな単離および精製(英語)

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

シアノバクテリア細胞外小胞の単離と特性評価

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

ダニ Ex Vivo 唾液腺培養物および細胞外小胞からのマイクロRNAの単離

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

血漿および固体組織からのトレーサブルおよび機能化された細胞外小胞の単離と分析

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

培養ヒト間葉系幹細胞からの細胞外小胞の単離、特性評価、および治療応用

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...