Name: flow cytometric analysis of extracellular vesicles from cell-conditioned media
Uploaded: 2019-02-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media at JoVE.com

앨라배마는 헬무트 호르 텐 재단 및 Velux 재단, 취리히 (스위스)의 연구 보조금에 의해 지원 되었다. G.V. 스위스 국립 과학 재단, 세실리아-오 거 스타, 루가 노, 재단과 SHK 재단에 Herz-und Kreislaufkrankheiten (스위스)의 연구 보조금에 의해 지원 되었다

1. 수집 및 바른된 미디어의 처리
<ol><li>PBS에서 0.02% 돼지 피부 젤라틴 55 cm2 페 트리 디쉬 코트.</li>
	<li>7 mL Iscove의 수정 Dulbecco의 매체 (IMDM)의 하 20 보충 CPC (8000/cm2) 미리 코팅 요리에서 접시 %FBS (태아 둔감 한 혈 청)과 1% 페니실린/스 (P/S). 참고: 기간 "클릭 당" 언급 된 인간의 explant 파생 셀에 다른14설명. CM은 특정 문화 조건에서 경작 하는 다른 세?...

<ol>
	<li>Barile, L., Vassalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+Therapy+delivery+tools+and+biomarkers+of+diseases.">Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. , (2017).</li><li>Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+secreted+vesicles+and+intercellular+communications.">Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications.</a> Molecular Biology Reports. 3, 15 (2011).</li><li>Yadav, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsy+in+pancreatic+cancer:+the+beginning+of+a+new+era.">Liquid biopsy in pancreatic cancer: the beginning of a new era.</a> Oncotarget. 9, 26900-26933 (2018).</li><li>Balbi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+Characterization+of+Human+Amniotic+Fluid+Stem+Cell+Extracellular+Vesicles+as+a+Powerful+Paracrine+Tool+Endowed+with+Regenerative+Potential.">First Characterization of Human Amniotic Fluid Stem Cell Extracellular Vesicles as a Powerful Paracrine Tool Endowed with Regenerative Potential.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6, 1340-1355 (2017).</li><li>Andriolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+From+Human+Cardiac+Progenitor+Cells+for+Therapeutic+Applications:+Development+of+a+GMP-Grade+Manufacturing+Method.">Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method.</a> Frontiers in Physiology. 9, (2018).</li><li>Lai, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+secreted+by+MSC+reduces+myocardial+ischemia/reperfusion+injury.">Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury.</a> Stem Cell Research. 4, (2009).</li><li>Doeppner, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles+Improve+Post-Stroke+Neuroregeneration+and+Prevent+Postischemic+Immunosuppression.">Extracellular Vesicles Improve Post-Stroke Neuroregeneration and Prevent Postischemic Immunosuppression.</a> Stem Cells Translational Medicine. 4, 1131-1143 (2015).</li><li>Kordelas, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC-derived+exosomes:+a+novel+tool+to+treat+therapy-refractory+graft-versus-host+disease.">MSC-derived exosomes: a novel tool to treat therapy-refractory graft-versus-host disease.</a> Leukemia. 28, 970-973 (2014).</li><li>Barile, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+human+cardiac+progenitor+cells+inhibit+cardiomyocyte+apoptosis+and+improve+cardiac+function+after+myocardial+infarction.">Extracellular vesicles from human cardiac progenitor cells inhibit cardiomyocyte apoptosis and improve cardiac function after myocardial infarction.</a> Cardiovascular Research. 103, 530-541 (2014).</li><li>Longatti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+affinity+single-chain+variable+fragments+are+specific+and+versatile+targeting+motifs+for+extracellular+vesicles.">High affinity single-chain variable fragments are specific and versatile targeting motifs for extracellular vesicles.</a> Nanoscale. 10, 14230-14244 (2018).</li><li>Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Microvesicles+from+Peripheral+Blood.">Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li><li>Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+analysis+of+extracellular+vesicles+using+flow+cytometry.">Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2015).</li><li>Arakelyan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Virometry+to+Analyze+Antigenic+Spectra+of+Virions+and+Extracellular+Vesicles.">Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li><li>Chimenti, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+adult+cardiac+stem/progenitor+cells+in+the+form+of+cardiospheres+from+human+cardiac+biopsies+and+murine+hearts.">Isolation and expansion of adult cardiac stem/progenitor cells in the form of cardiospheres from human cardiac biopsies and murine hearts.</a> Methods Molecular Biology. 879, 327-338 (2012).</li><li>van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry.">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nature Protocols. 7, 1311-1326 (2012).</li><li>Pospichalova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+protocol+for+flow+cytometry+analysis+of+fluorescently+labeled+exosomes+and+microvesicles+using+dedicated+flow+cytometer.">Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 25530 (2015).</li><li>van der Pol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+size+distribution+of+exosomes+and+microvesicles+determined+by+transmission+electron+microscopy,+flow+cytometry,+nanoparticle+tracking+analysis,+and+resistive+pulse+sensing.">Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12, 1182-1192 (2014).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updating+the+MISEV+minimal+requirements+for+extracellular+vesicle+studies:+building+bridges+to+reproducibility.">Updating the MISEV minimal requirements for extracellular vesicle studies: building bridges to reproducibility.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1396823 (2017).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cellular Biology. , (2006).</li><li>Suarez, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bead-assisted+flow+cytometry+method+for+the+semi-quantitative+analysis+of+Extracellular+Vesicles.">A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles.</a> Scientific Reports. 7, 11271 (2017).</li><li>Sodar, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-density+lipoprotein+mimics+blood+plasma-derived+exosomes+and+microvesicles+during+isolation+and+detection.">Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection.</a> Scientific Reports. 6, 24316 (2016).</li><li>Sluijter, J. P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+diagnostics+and+therapy+of+the+ischaemic+heart:+Position+Paper+from+the+Working+Group+on+Cellular+Biology+of+the+Heart+of+the+European+Society+of+Cardiology.">Extracellular vesicles in diagnostics and therapy of the ischaemic heart: Position Paper from the Working Group on Cellular Biology of the Heart of the European Society of Cardiology.</a> Cardiovascular Research. 114, 19-34 (2018).</li></ol>

기존의 FC 기술을 마커 EV의 표면에 표현 하는 가장 간단한 분석 방법에 남아 있다. 이와 관련, 가장 적합 한 프로토콜을 선택은 악기 감도 인해 한계를 방지 하 여 개별 입자의 분수에 대 한 유용한 정보를 얻을 중요 합니다. 우리 엑 소 및 다운스트림 FC 응용 프로그램에 대 한 적당 한 작은 EV 표면 항을 인식 하는 항 체와 결합 하는 자기 입자를 사용 하는 방법을 설명 합니다. 우리 확인 방법을 사용...

세포에는 세포 외 소포 (EV) microvesicles (MV) 및 exosomes (엑 소)를 포함 하 여 다양 한 크기의 분 비. 후자는 구분할 수 MV에서 크기와 근원의 subcellular 구획. MV (크기에 200-1000 nm)는 부모 세포에서 원형질 막에서 흘리기에 의해 해제 됩니다. 반대로, 엑 소 (30-150 nm) endosomal 막에서 발생 하 고 세포 막1,2multivesicular 시체 (MVB) 퓨즈 때 세포 외 공간으로 해제 됩니다.
EV는 점점 사용 진단 바이오 마커 뿐만으로, 잠재적으로, 종양학, 신경학, 심장학, musculoskeletal 질환3,,45등 많은 분야에서 치료 도구. 치료제의 체 외 배양된 세포의 세포 조절 매체 (CM)에서 소포 악용으로 EV를 사용 하 여 지속적인 연구의 대다수. 여러 문맥에서 유익한 효과 발휘 하는 중간 엽 줄기 세포 (MSCs) 그리고 MSC 파생 EV 심근 국 소 빈 혈 또는 reperfusion 상해6 및 뇌 부상7모델에서 혜택 나타났습니다. MSC 파생 EV는 또한 치료-내 화 이식-비교-호스트 질병8모델에서와 같이 면역 제거 치료에 악용 될 수 있는 면역 modulatory 활동 전시. 양수 내 유체 줄기 세포 (hAFS) 적극적으로 풍요롭게 CM MVs와 엑 소, heterogeneously 배포 크기 (50-1000 nm), 차별화 된 셀, 신생 혈관, 섬유 증, 억제의 확산 등의 여러 생물학적 효과 중재 하 고 cardioprotection4. 우리 것으로 나타났습니다 최근 EV, 그리고 엑 소 특히, 인간의 심장에서 파생 된 조상 세포 (엑 소-클릭 당)에 의해 분 비 쥐5,9에서 심근 경색 크기를 감소 시키기.
엑 소 공유 tetraspanins (CD63, CD81, CD9) 등 중요 한 조직 적합성 복잡 한 그들의 표면에 단백질의 공통 된 종류 I (MHC-나). 단백질의이 공통 집합, 뿐만 아니라 엑 소 또한 프로듀서 셀 형식의 EV 하위 집합에 대 한 단백질 특정 포함 되어 있습니다. 그들은 많은 생물 학적 과정5,10를 그로 인하여 규제 간 셀룰러 통신에서 중요 한 역할 때문에 엑 소 마커 파라마운트 중요성을 얻고 있다. 그들의 소형 때문에 도전 과제 EV 클래식 흐름 cytometry (FC) 남아를 사용 하 여 분석 하는 쉬운 방법을 찾는.
여기, 우리 ultracentrifugation를 통해 미리 농축된 샘플 또는 CM (그림 1)에 직접 적용할 수 있는 FC를 사용 하 여 EV 분석에 대 한 간단한 프로토콜 제시. 메서드 추가 세척 없이 정식 엑 소 관련 표면 epitopes (CD63, CD9 CD81)는 특정 항 체로 입힌 구슬을 사용 합니다. FC 분석 측정 전에 조정에 대 한 필요와 함께 기존의 cytometer를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 교류 cytometers를 사용 하 여 개별 작은 입자에 항 원 특성에 대 한 메서드는 다양 한 응용 프로그램11,,1213에 관하여 다른 그룹에 의해 기술 되었다. 여기, 우리는 작은 입자와 엑 소, FC에 의해 캡처된 입자의 형질 다음 캡처에 대 한 기능성된 자석 구슬 사용. 이 메서드는 작은 소포 생체 외에서 어떤 셀 형식에 의해 발표의 항 원 성분의 특성을 사용할 수 있습니다, 하지만 여기 우리가 제공 적용 되는 특정 세포 배양 조건을 인간의 심장 조상 세포 (CPC)의 문화를 가장 이 세포에 의해 EV 생산을 위한 적절 한 환경.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:816px;" width="816">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:369px;">IMDM</td>
			<td style="width:113px;">Gibco</td>
			<td style="width:235px;">12440061</td>
			<td style="width:99px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100&#160;kDa&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CytoFlex, Flow Cytometer Platform</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>CytoFlex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21063045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s PBS (PBS) Ca- and Mg-free</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-512F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExoCap CD63 Capture Kit</td>
			<td>JSR Life Sciences</td>
			<td>Ex-C63-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExoCap CD81 Capture Kit</td>
			<td>JSR Life Sciences</td>
			<td>Ex-C81-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExoCap CD9 Capture Kit</td>
			<td>JSR Life Sciences</td>
			<td>Ex-C9-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Exosome-Depleted FBS</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A2720801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Exosome-depleted FBS Media Supplement</td>
			<td>SBI</td>
			<td>EXO-FBS-250A-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS-Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-human CD9 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>312104&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; RRID: AB_2075894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow Cytometer analysis software</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Kaluza</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoSight LM10</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NanoSight LM10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoSight Software</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NTA 2.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optima Max-XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE anti-human CD63 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>353004&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; RRID:AB_10897809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE anti-human CD81 (TAPA-1) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>349505&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; RRID:AB_10642024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermomixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382 000 015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">TLA-110</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>TLA-110 rotors</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of extracellular vesicles from cell-conditioned media

Cytometry (FC)는 세포 표면 항 원 표시의 반 정량적 측정에 대 한 선택의 방법입니다. 최근,이 기술은 exosomes (엑 소)를 포함 하 여 말 초 혈액과 다른 체액에 extracellular 소포 (EV)의 phenotypic 분석을 위해 사용 되었습니다. EV의 작은 크기 명령 주위 검출 임계값을 갖는 전용된 기기를 사용 하 여 50-100 nm. 또는, EV FC에 의해 검출 될 수 있는 라텍스 microbeads에 바인딩할 수 있습니다. Microbeads, EV 관련 마커/클러스터 차별화 CD63, CD9, 및 CD81 인식 하는 항 체와 활용을 사용할 수 있습니다 EV 캡처. CM에서 고립 된 엑 소 ultracentrifugation에 의해 또는 사전 농축 하지 않고 분석할 수 있습니다. 이 접근은 기존의 FC 악기를 사용 하 여 EV 분석에 적합 합니다. 우리의 결과 형광 강도 의미 (MFI) 값과 EV 농도 사이의 선형 상관 관계를 보여 줍니다. 극적으로 쥡니다 통해 EV를 방해 MFI는 방법 막 파편을 검색 하지 않습니다 나타내는 감소. 우리 보고 어떤 실험실에서 쉽게 구현할 수 있는 EV 표면 항 원 분석에 대 한 정확 하 고 신뢰할 수 있는 방법.

단일 얼룩에 대 한 입자의 총 수
이후 하나의 구슬 하나 이상의 입자를 바인딩할 수 있습니다, 우리 MFI 곡선의 초기 지 수 단계에 도달 총 EV (관 당 단일 항 체)의 작은 금액을 설정 하는 다른 조건을 테스트. 항 체의 고정된 농도 2.5 x 10 5 x 105 에서 배열 했다 입자의 총 수 하는 동안 사용 되었다8. <str...

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Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

프로토콜 셀 문화 supernatants 함께 사용 하기 위해 작은 extracellular 소포 (EV)에 표면 epitopes를 감지 하도록 설계 된 재현 방법을 설명 합니다. 그것은 항 체를 표면 항 원 CD9, 인식 CD81 그리고 CD63, 함께 하는 비즈를 사용 하 여 특정 EV immunoprecipitation 활용. 메서드는 다운스트림 흐름 cytometry 분석에 최적화 되어 있습니다.

Extracellular 소포 세포 조절 미디어에서의 Cytometric 분석 흐름

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

세포 외 소포는 점점 많은 분야에서 진단 바이오 마커 및 잠재적 인 치료 도구로 사용되고 있습니다. 흐름 세포측정은 슈트 얼굴 마커를 특성화하는 가장 직선적인 분석 방법은 이 프로토콜이 크기 가중 입자를 분석하는 데 사용될 수 있으며, 빠르며, 특별한 설정이나 전용 기기없이 종래의 지진계에 적용할 수 있다. 이 프로토콜은 말의 상태 및 매체에서 세포외 소포를 분류하는 데 사용되지만, 환자에서 침습적 조직 생검을 대체하기 위해 도착 한 AV의 분류로 확장 될 수 있습니다.프로토콜에 새로운 연구원의 경우, 설정 방법 섹션에 설명된 단계를 수행하고, PBS에서 02%의 돼지 피부 젤라틴으로 55센티미터 제곱 페트리 접시를 코팅하여 시연된 얻기 전략을 밀접하게 따르는 것이 중요합니다. 15분 후, 접시와 접시를 4.4배 10회 각 접시에 각 접시에 10번 씻고, 이스코브의 변형된 덜베코 의 매체 또는 IMDM의 7밀리리터로, 20%의 태아 소 혈청, 1%페니실린과 연쇄상구균을 섭씨 57%에서 배양하여 1%를 보충한다. 세포가 약 80%의 합류에 도달하면 칼슘과 마그네슘없이 덜벡코의 PBS로 배양을 두 번 세척하고 혈청 무료 외식 생산 매체의 10 밀리터로 세포를 공급합니다.7 일 후, 각 플레이트에서 조건된 배지를 단일 폴리 프로필렌 원심분리기 튜브로 풀을 만들고 배지를 원심분리하여 세포 이물질을 제거합니다. 100킬로달톤 원심분리기 필터 튜브로 슈퍼네텐트를 전송하고, 추가 원심분리로 클리어, 컨디셔닝, 배지를 농축한다. 최종 벤치탑 원심분리를 위해 마이크로 원심분리기 튜브로 농축을 옮기고 초나텐트를 폴리카보네이트 두꺼운 벽 마이크로 원심분리기 튜브에 추가합니다.3.2 밀리터의 최종 부피로, PBS로 튜브를 채우고, 티타늄 고정 천사 로터에 샘플을로드합니다. 그런 다음 로터를 탁상 초원심분리기에 적재하여 초원심분리기를 하고, 신선한 PBS 의 100 마이크로리터에서 펠릿을 재보페한다. 나노입자 추적 및 분석 정량화를 위해, PBS의 999 마이크로리터에서 초원심분리시 샘플의 마이크로리터 1을 희석하고, 기포 없이 1 밀리터 주사기에 샘플을 적재한다.주사기를 검사실의 입구 포트에 적재하고 레이저를 켭니다. 캡처 버튼을 사용하여 카메라를 열고 포커스를 조정합니다. 그런 다음 각각 60초의 세 가지 프레임 이상을 기록하고 소프트웨어의 배치 프로세스 옵션을 사용하여 세 가지 다른 인수를 분석합니다.수집을 위해 샘플을 준비하기 위해 먼저 적절한 실험적인 단일클론 항체 공액 포획 구슬을 1:1:1 비율로 마이크로 원심분리기 튜브에 추가하고, 그 결과 포획 비드 풀을 소용돌이시다. 다음으로, 적절한 샘플 부피를 캡처 비드 풀 1마이크로리터에 추가하여 8개 입자에 1배 10회, 시험 농도당 5구슬에 1.2배 10을 생성한다. 비드 1마이크로리터를 음수 조절으로 표시된 튜브에 추가하고 각 튜브의 볼륨을 신선한 PBS로 100 마이크로리터로 조정합니다.그런 다음 튜브를 보온 믹서에 넣고, 분당 400회전, 하룻밤 사이에 섭씨 4~10°C로 흔들어 놓습니다. 다음 날, 샘플을 원형 하단 96 웰 플레이트로 전송하고, 각 우물에 적절한 플로레스시공 공액 항체를 추가한다. 섭씨 4~10도에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 각 웰에 100마이크로리터의 PBS를 추가하고 인수 소프트웨어를 엽니다.사이토미터 및 시스템 시작 프로그램을 선택하여 계측기를 시작하고 새로운 실험을 엽니다. 실험 템플릿을 만들고 플레이트를 선택하고 플레이트를 추가합니다. 플레이트의 샘플 위치를 선택하고 샘플을 잘 클릭하여 설정합니다.명명 규칙에 샘플 이름을 입력하고 채널 탭을 열고 적절한 플로멘스 신호 채널을 선택합니다. 이제 접시를 기기에 로드합니다. 그리고 점 플롯을 클릭하여 측면 분산 영역 점 플롯과 비교하여 새 전방 분산 영역을 만듭니다.초기화를 선택하여 레이저와 유체를 시작하고 실행을 클릭하여 인수를 시작합니다. 축척을 조정하여 전방 및 측면 산란 플롯의 중간에 있는 인구를 표시하고 전체 샘플 개체수 주위에 구슬 게이트를 그려 이물질을 제외합니다. 중지 및 점 플롯을 클릭하여 앞으로 분산 영역 점 플롯과 비교하여 전방 분산 높이를 만들고 구슬 모집단의 샘플을 게이트합니다.더 큰 인구 주위에 새 게이트를 그리고 Singlets의 이름을 지정하고, 점 도표를 클릭하여 사용되는 실험형 형광당 당 측면 산란 영역 점 플롯에 비해 하나의 형광 신호를 만듭니다. 싱글츠의 새 점 플롯을 게이트합니다. 그런 다음 기록할 이벤트 수를 선택하고 레코드를 선택하여 실험 인수를 시작합니다.분석이 끝나면 수집 파일을 적절한 분석 소프트웨어에 로드하고 새 프로토콜을 엽니다. 각 파일에 대해 점 플롯을 방금 설명한 대로 만들고 모든 분산 축을 선형 축으로 설정하고 모든 플로리스트센트 축을 로그 스케일로 설정합니다. 그런 다음 관련 신호 채널에서 플로레시엔스 기하학적 평균을 표시하여 다른 세포외 소포 제제에서 평균 꽃집 강도의 전체 변화를 계산합니다.평균 플로레시센 강도 곡선의 초기 지수상에 도달하기 위해 세포외 소포의 가장 작은 총량을 설정하는 상이한 조건을 테스트한 후, 최소 입자 수는 염색당 8입자로 1배 10으로 결정되었다. 비특이적 항체 결합 없이 가장 높은 신호를 달성하기 위해 8입자에 대한 항체의 최적 농도는 항체에 대한 항체 CD9_FITC 및 항체 CD63_PE 항체 및 밀리리터 당 5마이크로그램 모두에 대해 밀리리터당 10 마이크로그램으로 결정되었으며, 항체에 대한 CD81_PE 항체에 대한 5마이크로그램. 방법의 적합성을 확인하기 위해, 컵 모양의 세포외 소포를 분석하기 위한, 멤브레인 파편이 아닌 세포외 소포는 초음파 처리되어 30 초의 초음파 처리 후 평균 꽃집 강도가 감소했으며 기계적 중단 1 분 후에 전혀 꽃을 감지하지 못했습니다.입증 된 바와 같이 심장 전구 세포에서 X의 자신의 정제, 두 세포 집단에서 CD9와 CD81의 낮은 수준을 표현, 세포 외 소포를 산출한다. 또한 X의 표면 마커는 초원심 분리 없이 명확하게 식별할 수 있지만, 이 농축 단계는 이러한 마커의 평균 꽃집 강도를 크게 향상시킵니다. 세포 외 소포로 작업 할 때, 더 부주의 나노 입자 펠릿은 쉽게 놓칠 수 있다.따라서 프로토콜에서 설명한 대로 모든 단계를 따르는 것이 필수적입니다. 세포외 소포를 바이오마커로 사용하는 것은 이제 가장 새로운 분야 연구 중 하나입니다. 그리고 곧, 대체 스크리닝 도구로 사용되는 임상 진단으로 번역될 수 있다.

Research

JoVE Journal

Biology

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

CD71/TER119 흐름 cytometric 어세를 사용하여 마우스 Erythroid Progenitors의 제품 식별 및 분석

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

연구

생물학

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

유동 세포 계측법을 사용하여 세포 외 소포의 분석을위한 기술

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

예쁜꼬마선충의 정화 및 분석 세포외 소포

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

세포외 소포의 정량화 및 크기 측정을 위한 나노 입자 추적 분석

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

대장균 및 다른 박테리아로부터의 세포외 소포의 확장 가능한 분리 및 정제

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

시아 노 박테리아 세포 밖 소포의 분리 및 특성 분석

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures 및 Extracellular Vesicles에서 microRNAs의 분리

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

혈장 및 고형 조직에서 추적 가능하고 기능화된 세포외 소포의 분리 및 분석

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

배양된 인간 중간엽 줄기세포에서 세포외 소포의 분리, 특성화 및 치료적 적용

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...