Name: flow cytometric analysis of extracellular vesicles from cell-conditioned media
Uploaded: 2019-02-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media at JoVE.com

L.B. ble støttet av forskningsmidler Helmut Horten Stiftung og Velux Stiftung, Zürich (Sveits). G.V. ble støttet av forskningsmidler Swiss National Science Foundation, Cecilia-Augusta grunnlaget, Lugano og SHK Stiftung für Herz-und Kreislaufkrankheiten (Sveits)

1. innsamling og behandling av betinget Media
<ol><li>Coat 55 cm2 Petri retter med 0,02% svin huden gelatin i PBS.</li>
	<li>Plate CPC (8000/cm2) i pre belagt retter med 7 mL av Iscoves endret Dulbecco Medium (IMDM) med 20% FBS (Fetal Bovine Serum) og 1% Penicillin/Streptomycin (P/S). Merk: Begrepet "CPC," refererer til menneskelig explant avledet celler som beskrevet andre steder14. CM kan hentes fra forskjellige celletyper kultivert bestemt kultur forh...

<ol>
	<li>Barile, L., Vassalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+Therapy+delivery+tools+and+biomarkers+of+diseases.">Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. , (2017).</li><li>Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+secreted+vesicles+and+intercellular+communications.">Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications.</a> Molecular Biology Reports. 3, 15 (2011).</li><li>Yadav, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsy+in+pancreatic+cancer:+the+beginning+of+a+new+era.">Liquid biopsy in pancreatic cancer: the beginning of a new era.</a> Oncotarget. 9, 26900-26933 (2018).</li><li>Balbi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+Characterization+of+Human+Amniotic+Fluid+Stem+Cell+Extracellular+Vesicles+as+a+Powerful+Paracrine+Tool+Endowed+with+Regenerative+Potential.">First Characterization of Human Amniotic Fluid Stem Cell Extracellular Vesicles as a Powerful Paracrine Tool Endowed with Regenerative Potential.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6, 1340-1355 (2017).</li><li>Andriolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+From+Human+Cardiac+Progenitor+Cells+for+Therapeutic+Applications:+Development+of+a+GMP-Grade+Manufacturing+Method.">Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method.</a> Frontiers in Physiology. 9, (2018).</li><li>Lai, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+secreted+by+MSC+reduces+myocardial+ischemia/reperfusion+injury.">Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury.</a> Stem Cell Research. 4, (2009).</li><li>Doeppner, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles+Improve+Post-Stroke+Neuroregeneration+and+Prevent+Postischemic+Immunosuppression.">Extracellular Vesicles Improve Post-Stroke Neuroregeneration and Prevent Postischemic Immunosuppression.</a> Stem Cells Translational Medicine. 4, 1131-1143 (2015).</li><li>Kordelas, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC-derived+exosomes:+a+novel+tool+to+treat+therapy-refractory+graft-versus-host+disease.">MSC-derived exosomes: a novel tool to treat therapy-refractory graft-versus-host disease.</a> Leukemia. 28, 970-973 (2014).</li><li>Barile, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+human+cardiac+progenitor+cells+inhibit+cardiomyocyte+apoptosis+and+improve+cardiac+function+after+myocardial+infarction.">Extracellular vesicles from human cardiac progenitor cells inhibit cardiomyocyte apoptosis and improve cardiac function after myocardial infarction.</a> Cardiovascular Research. 103, 530-541 (2014).</li><li>Longatti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+affinity+single-chain+variable+fragments+are+specific+and+versatile+targeting+motifs+for+extracellular+vesicles.">High affinity single-chain variable fragments are specific and versatile targeting motifs for extracellular vesicles.</a> Nanoscale. 10, 14230-14244 (2018).</li><li>Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Microvesicles+from+Peripheral+Blood.">Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li><li>Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+analysis+of+extracellular+vesicles+using+flow+cytometry.">Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2015).</li><li>Arakelyan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Virometry+to+Analyze+Antigenic+Spectra+of+Virions+and+Extracellular+Vesicles.">Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li><li>Chimenti, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+adult+cardiac+stem/progenitor+cells+in+the+form+of+cardiospheres+from+human+cardiac+biopsies+and+murine+hearts.">Isolation and expansion of adult cardiac stem/progenitor cells in the form of cardiospheres from human cardiac biopsies and murine hearts.</a> Methods Molecular Biology. 879, 327-338 (2012).</li><li>van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry.">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nature Protocols. 7, 1311-1326 (2012).</li><li>Pospichalova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+protocol+for+flow+cytometry+analysis+of+fluorescently+labeled+exosomes+and+microvesicles+using+dedicated+flow+cytometer.">Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 25530 (2015).</li><li>van der Pol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+size+distribution+of+exosomes+and+microvesicles+determined+by+transmission+electron+microscopy,+flow+cytometry,+nanoparticle+tracking+analysis,+and+resistive+pulse+sensing.">Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12, 1182-1192 (2014).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updating+the+MISEV+minimal+requirements+for+extracellular+vesicle+studies:+building+bridges+to+reproducibility.">Updating the MISEV minimal requirements for extracellular vesicle studies: building bridges to reproducibility.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1396823 (2017).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cellular Biology. , (2006).</li><li>Suarez, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bead-assisted+flow+cytometry+method+for+the+semi-quantitative+analysis+of+Extracellular+Vesicles.">A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles.</a> Scientific Reports. 7, 11271 (2017).</li><li>Sodar, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-density+lipoprotein+mimics+blood+plasma-derived+exosomes+and+microvesicles+during+isolation+and+detection.">Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection.</a> Scientific Reports. 6, 24316 (2016).</li><li>Sluijter, J. P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+diagnostics+and+therapy+of+the+ischaemic+heart:+Position+Paper+from+the+Working+Group+on+Cellular+Biology+of+the+Heart+of+the+European+Society+of+Cardiology.">Extracellular vesicles in diagnostics and therapy of the ischaemic heart: Position Paper from the Working Group on Cellular Biology of the Heart of the European Society of Cardiology.</a> Cardiovascular Research. 114, 19-34 (2018).</li></ol>

Konvensjonelle FC teknikken fortsatt metoden enkleste analytisk å karakterisere indikatorer uttrykt på overflaten av EV. I denne forbindelse, er velge den mest passende protokollen avgjørende å få nyttig informasjon om individuelle partikkel fraksjoner av interesse ved å unngå begrensninger på grunn av instrumentet følsomhet. Vi beskrev en metode å bruke magnetiske partikler sammen med antistoffer som gjenkjenner Exo og små EV overflaten antigener som nedstrøms FC anvendes. Vi validert metoden bruker to ulike...

Celler skiller ekstracellulære blemmer (EV) av forskjellige størrelser, inkludert microvesicles (MV) og exosomes (Exo). Sistnevnte kan skilles fra MV av både størrelse og subcellular rommet opprinnelsesland. MV (200 – 1000 nm i størrelse) frigis fra overordnede celler av shedding fra plasma membranen. Derimot Exo (30-150 nm) kommer fra endosomal membraner og utgis i ekstracellulære plass når multivesicular organer (MVB) smelter med cellemembranen1,2.
EV er i økende grad brukt som diagnostiske biomarkers også, muligens terapeutiske verktøy i mange områder, inkludert onkologi, nevrologi, kardiologi og musculoskeletal sykdommer3,4,5. Et stort flertall av pågående studier med EV som terapeutiske agenter utnytte isolering av blemmer fra celle-conditioned medium (CM) i vitro kulturperler celler. Stamceller (MSCs) utøve gunstige effekter i flere sammenhenger, og MSC-avledet EV har vist fordelene i modeller av hjerteinfarkt iskemi/reperfusion skade6 og hjerne skader7. MSC-avledet EV også utstillingen immun modulatory aktiviteter som kan utnyttes til å behandle uimottakelig avvisning, som vist i en modell av terapi-ildfast graft - versus - host sykdom8. Amniotic væske stamceller (hAFS) aktivt beriker CM med MVs og Exo, heterogeneously distribuert i størrelse (50 – 1000 nm), som megle flere biologiske effekter, for eksempel spredning av differensierte celler, angiogenese, hemming av fibrosis, og cardioprotection4. Vi har nylig vist at EV, og spesielt Exo, skilles ut av menneskelig hjerte-avledet progenitor celler (Exo-CPC) redusere betennelsessykdommer som hjerteinfarkt størrelse i rotter5,9.
EXO deler et felles sett av protein på overflaten deres, inkludert tetraspanins (CD63, CD81, CD9) og store histocompatibility kompleks klasse I (MHC-jeg). I tillegg til denne felles sett av proteiner, Exo også inneholde proteiner bestemt EV delsettet av produsent celle type. EXO markører er å få avgjørende betydning fordi de spiller en avgjørende rolle i mellom mobil kommunikasjon, og dermed regulerer mange biologiske prosesser5,10. På grunn av sin lille størrelse, finne en enkel måte å analysere EV med klassisk flyt cytometri (FC) er en utfordrende oppgave.
Her presenterer vi en forenklet protokoll for EV analyse med FC, som kan brukes til pre beriket prøver innhentet gjennom ultracentrifugation eller direkte til CM (figur 1). Metoden bruker perler belagt med et spesifikt antistoff som binder kanoniske Exo-assosiert overflaten epitopes (CD63, CD9, CD81) uten flere vasker. FC analyser utføres med en konvensjonell cytometer uten behov for justeringer før mål. Metoder for karakterisering av antigener på enkelte små partikler bruker flyt cytometers har blitt beskrevet av andre grupper med hensyn til ulike programmer11,12,13. Her brukte vi functionalized magnetiske perler for erobringen av små partikler og Exo, etterfulgt av phenotyping fanget partikler av FC. Selv om denne metoden kan brukes til å beskrive antigen sammensetningen av små blemmer utgitt av en celle type i vitro, gitt her vi bestemt celle kultur betingelsene som gjelder for kulturen i menneskets hjerte progenitor celler (CPC) og de riktig miljø for produksjon av EV av disse cellene.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:816px;" width="816">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:369px;">IMDM</td>
			<td style="width:113px;">Gibco</td>
			<td style="width:235px;">12440061</td>
			<td style="width:99px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100&#160;kDa&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CytoFlex, Flow Cytometer Platform</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>CytoFlex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21063045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s PBS (PBS) Ca- and Mg-free</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-512F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExoCap CD63 Capture Kit</td>
			<td>JSR Life Sciences</td>
			<td>Ex-C63-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExoCap CD81 Capture Kit</td>
			<td>JSR Life Sciences</td>
			<td>Ex-C81-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExoCap CD9 Capture Kit</td>
			<td>JSR Life Sciences</td>
			<td>Ex-C9-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Exosome-Depleted FBS</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A2720801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Exosome-depleted FBS Media Supplement</td>
			<td>SBI</td>
			<td>EXO-FBS-250A-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS-Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-human CD9 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>312104&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; RRID: AB_2075894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow Cytometer analysis software</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Kaluza</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoSight LM10</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NanoSight LM10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoSight Software</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NTA 2.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optima Max-XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE anti-human CD63 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>353004&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; RRID:AB_10897809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE anti-human CD81 (TAPA-1) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>349505&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; RRID:AB_10642024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermomixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382 000 015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">TLA-110</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>TLA-110 rotors</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of extracellular vesicles from cell-conditioned media

Flowcytometri (FC) er metoden for valg for semi kvantitativ måling av celle-overflate antigen markører. Nylig er denne teknikken brukt for fenotypiske analyser av ekstracellulære blemmer (EV) inkludert exosomes (Exo) i perifert blod og andre kroppsvæsker. Den lille størrelsen på EV mandater bruk av dedikert instrumenter har en gjenkjenning terskel rundt 50-100 nm. Alternativt kan EV være bundet til latex microbeads som kan gjenkjennes av FC. Microbeads, konjugert med antistoffer som gjenkjenner EV-assosiert markører/klynge av differensiering CD63, CD9 og CD81 kan brukes for EV-fangst. EXO isolert fra CM kan analyseres med eller uten pre berikelse av ultracentrifugation. Denne tilnærmingen er egnet for EV analyser konvensjonelle FC instrumenter. Våre resultater viser en lineær sammenheng mellom mener fluorescens intensitet (MFI) verdier og EV konsentrasjon. Forstyrre EV gjennom sonication dramatisk redusert MFI, indikerer at metoden ikke oppdager membran rusk. Vi rapporterer en nøyaktig og pålitelig metode for analyse av EV overflaten antigener, som lett kan implementeres i et laboratorium.

Totalt antall partikler til enkelt farging
Siden en enkelt perle kan knytte mer enn én partikkel, testet vi ulike forhold til å angi minste totale EV (enkelt antistoff per tube) for å nå den tidlige eksponentielle fasen av MFI kurve. En fast konsentrasjon av antistoff ble brukt under antall partikler varierte fra 5 x 105 til 2,5 x 108. Som vist i figur 3A, ...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media at JoVE.com

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Protokollen beskriver en reproduserbar metode utviklet for bruk med celle kultur supernatants for å oppdage overflaten epitopes på små ekstracellulære blemmer (EV). Det bruker bestemte EV immunoprecipitation bruker perler kombinert med antistoffer som gjenkjenner overflate antigen CD9, CD63 og CD81. Metoden er optimalisert for nedstrøms flyt cytometri analyse.

Flow Cytometric analyse av ekstracellulære blemmer fra celle-conditioned Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Ekstracellulære Vesikler blir i økende grad brukt som en diagnostisk biomarkør og potensielt terapeutisk verktøy i mange felt. Flow Cytometric er den mest rett frem analytiske metoden for å karakterisere av dress ansikt markører denne protokollen kan brukes til å analysere en assized partikkel, er rask, og gjelder for konvensjonelle seismometre uten behov for spesiell innstilling eller dedikert instrument. Selv om denne protokollen brukes til å kategorisere ekstracellulære vesikler fra 7 tilstand og medium, kan den utvides mot kategorisering av blodankomne AVs, for å erstatte invasive vevsbiopsier hos pasienter.For forskere som er nye i protokollen, er det viktig å utføre trinn som er beskrevet i oppsettmetodedelen, og å følge de demonstrerte få strategiene Begynn med å belegge 55 centimeter kvadrert Petri-retter med 02% svinehudgelatin, i PBS. Etter 15 minutter vasker du parabolen og platen 4,4 ganger 10 til de femte hjertestamtamcellene på hver tallerken i 7 milliliter av Iscoves Modifiserte Dulbeccos Medium, eller IMDM, supplert med 20% fosterbovinserum, og 1% penicillin og streptomycin for inkubasjon ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid. Når cellene når ca 80% samløpet, vask kulturene to ganger med Dulbeccos PBS uten kalsium og magnesium og mate cellene med 10 milileters av serumfri eksosomproduksjonsmedium.Etter 7 dager, pool betinget medium fra hver plate, inn i en enkelt polypropylen sentrifuge rør og sentrifuge mediet for å fjerne eventuelle celle rusk. Overfør supernatent til en 100 kilodalton sentrifuge filterrør, Og konsentrere ryddet, betinget, medium med en ekstra sentrifugering. Overfør konsentratet til et mikrosentrigerrør for en endelig sentrifugering på benkeplaten og legg supernatenten til et polykarbonat tykt veggmikrosentrigerrør.Fyll røret med PBS, til et endelig volum på 3,2 milileters, og last prøven inn i en titan fast engleaktig rotor. Deretter laster du rotoren inn i en bordplate ultracentrifuge for ultracentrifugation, og gjenbruk pellet i 100 mikroliter med fersk PBS. For nanopartikkelsporing og analyse kvantifisering, fortynne 1 mikroliter av den ultracentrifuged prøven, i 999 mikroliter pbs, og laste prøven inn i en 1 milileter sprøyte uten bobler.Legg sprøyten inn i innløpsporten til undersøkelseskammeret, og slå på laseren. Bruk opptaksknappen til å åpne kameraet, og juster fokuset. Deretter registrerer du minst tre forskjellige rammer på 60 sekunder hver, og bruker alternativet for satsvis prosess i programvaren, til å analysere de tre forskjellige oppkjøpene.For å forberede prøven for oppkjøp, legg først til riktig eksperimentelt monoklonalt antistoff konjugert fange perler på et 1:1:1-forhold, i et mikro sentrifugerør, og vortex den resulterende fange perle basseng. Deretter legger du til riktig volum av prøve til 1 mikroliter fange perle basseng for å generere en 1 ganger 10 til 8 partikler pluss 1,2 ganger 10 til femte perler per testkonsentrasjon. Tilsett 1 mikroliter perler til et rør merket perler som den negative kontrollen, og juster volumet i hvert rør til 100 mikroliter med frisk PBS.Legg deretter rørene i en termomikser, med risting, ved 400 rotasjoner per minutt, og 4 til 10 Celsius, over natten. Neste dag, overfør prøvene til en rund bunn 96 brønnplate, og legg til de riktige florescence konjugert antistoffer til hver brønn. Etter en 1 time inkubasjon på 4 til 10 grader Celsius, legg til 100 mikroliter PBS til hver brønn, og åpne oppkjøpsprogramvaren.Velg cytometer og system oppstart program, for å starte instrumentet og åpne et nytt eksperiment. Lag en eksperimentell mal, og velg plate og legg til plate. Velg plasseringen av prøvene på platen, og klikk også på sett.Skriv inn eksempelnavnet i navnereglene, åpne kanalfanen og velg de riktige signalkanalene for florescence. Legg nå platen inn i instrumentet. Og klikk punktplott, for å opprette et nytt fremoversppunktområde kontra sidepunktområdepripunktplott.Velg initialiser for å starte laseren og fluidics og klikk kjøre for å starte oppkjøpet. Juster skalaen for å vise befolkningen midt i fremover versus side scatter plot, og tegne en perler gate rundt hele prøvepopulasjonen for å utelukke rusk. Klikk stopp og prikk plott for å opprette en fremover scatter høyde versus fremover scatter område dot plot, og gate prøven på perler befolkningen.Tegn en ny port rundt den større befolkningen og navngi den Singlets, og klikk dot plot for å lage en fluorescerende signal versus side scatter område dot plot, per eksperimentell fluorophore brukes. Gate den nye prikken tomten på Singlets. Velg deretter antall hendelser som skal registreres, og velg post for å starte det eksperimentelle oppkjøpet.På slutten av analysen laster du inn oppkjøpsfilene i riktig analyseprogramvare og åpner en ny protokoll. Opprett punktplott for hver fil som nettopp demonstrert, og sett hele punktaksen til lineær skala, og alle florescent-aksen til å logge skala. Vis deretter det geometriske gjennomsnittet i de relevante signalkanalene, for å beregne hele endringen i gjennomsnittlig florescence intensitet, i de forskjellige ekstracellulære vesikkelpreparatene.Etter å ha testet forskjellige forhold for å sette den minste totale mengden ekstracellulære vesikler for å nå den tidlige eksponentielle fasen av en gjennomsnittlig intensitetskurve, ble det minste antall partikler fastslått å være 1 ganger 10 til de 8 partiklene per farging. Den optimale konsentrasjonen av antistoff for 1 ganger 10 til de 8 partiklene for å oppnå det høyeste signalet uten uspesifikt antistoffbinding, ble fastslått å være 10 mikrogram per milliliter for både anti CD9_FITC og anti CD63_PE antistoffer og fem mikrogram per milliliter for anti CD81_PE antistoff. For å bekrefte egnetheten av metoden, for å analysere koppformede ekstracellulære vesikler, og ikke membranavfall, ble de ekstracellulære vesikler sonikert, noe som resulterte i en reduksjon i gjennomsnittlig florescence intensitet, etter så lite som 30 sekunder sonikering, uten florescence oppdaget i det hele tatt etter ett minutt med mekanisk forstyrrelse.X sin egen rensing fra hjerte stamceller som demonstrert, gir ekstracellulære vesikler, uttrykker lave nivåer av CD9 og høye nivåer av CD63 og CD81 fra begge cellepopulasjoner. Videre, mens Xs egne overflatemarkører er tydelig identifiserbare uten ultracentrifugation, forbedrer dette berikelsestrinnet i stor grad den gjennomsnittlige florescenceintensiteten til disse markørene. Når du arbeider med ekstracellulære vesikler, er det mer uforsiktig nanopartikkelpellets kan lett gå glipp av.Derfor er det viktig å følge alle trinnene som demonstrert i protokollen. Bruk av ekstracellulære vesikler som biomarkør er nå en av de mest fremvoksende feltforskningene. Og snart, kan oversettes til den kliniske diagnosen som brukes som et alternativt screeningverktøy.

Research

JoVE Journal

Biology

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Teknikker for analyse av Ekstracellulær Blemmer ved hjelp av flowcytometri

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Rensing og analyse av Caenorhabditis elegans Ekstracellulære vesikler

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

Nanopartikkelsporingsanalyse for kvantifisering og størrelsesbestemmelse av ekstracellulære vesicles

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Skalerbar isolasjon og rensing av ekstracellulære vesikler fra Escherichia coli og andre bakterier

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

Isolasjon og karakterisering av cyanobakterielle ekstracellulære vesikler

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolering av mikroRNA fra Tick Ex Vivo spyttkjertelkulturer og ekstracellulære vesikler

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

Isolering og analyse av sporbare og funksjonaliserte ekstracellulære vesikler fra plasma og fast vev

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Isolering, karakterisering og terapeutisk anvendelse av ekstracellulære vesikler fra dyrkede humane mesenkymale stamceller

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...