Name: flow cytometric analysis of extracellular vesicles from cell-conditioned media
Uploaded: 2019-02-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media at JoVE.com

L.B. foi apoiado por bolsas de investigação de Helmut Horten Stiftung e Velux Stiftung, Zurique (Suíça). G.V. foi apoiado por bolsas de investigação da Swiss National Science Foundation, Fundação Cecilia-Augusta, Lugano e o SHK Stiftung für Herz-und Kreislaufkrankheiten (Suíça)

1. coleta e processamento de mídia condicionado
<ol><li>Casaco 55 cm2 placas de Petri com gelatina de pele suína 0,02% em PBS.</li>
	<li>Placa CPC (8.000/cm2) em pratos revestidos com 7 mL de modificado Dulbecco do Iscove médio (IMDM) suplementado com 20% FBS (soro Fetal bovino) e 1% penicilina/estreptomicina (P/S). Nota: O termo "CPC" refere-se a células do explante humana derivada que têm sido descritos em outros lugares14. CM pode ser coletada de...

<ol>
	<li>Barile, L., Vassalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+Therapy+delivery+tools+and+biomarkers+of+diseases.">Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. , (2017).</li><li>Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+secreted+vesicles+and+intercellular+communications.">Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications.</a> Molecular Biology Reports. 3, 15 (2011).</li><li>Yadav, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsy+in+pancreatic+cancer:+the+beginning+of+a+new+era.">Liquid biopsy in pancreatic cancer: the beginning of a new era.</a> Oncotarget. 9, 26900-26933 (2018).</li><li>Balbi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+Characterization+of+Human+Amniotic+Fluid+Stem+Cell+Extracellular+Vesicles+as+a+Powerful+Paracrine+Tool+Endowed+with+Regenerative+Potential.">First Characterization of Human Amniotic Fluid Stem Cell Extracellular Vesicles as a Powerful Paracrine Tool Endowed with Regenerative Potential.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6, 1340-1355 (2017).</li><li>Andriolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+From+Human+Cardiac+Progenitor+Cells+for+Therapeutic+Applications:+Development+of+a+GMP-Grade+Manufacturing+Method.">Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method.</a> Frontiers in Physiology. 9, (2018).</li><li>Lai, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+secreted+by+MSC+reduces+myocardial+ischemia/reperfusion+injury.">Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury.</a> Stem Cell Research. 4, (2009).</li><li>Doeppner, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles+Improve+Post-Stroke+Neuroregeneration+and+Prevent+Postischemic+Immunosuppression.">Extracellular Vesicles Improve Post-Stroke Neuroregeneration and Prevent Postischemic Immunosuppression.</a> Stem Cells Translational Medicine. 4, 1131-1143 (2015).</li><li>Kordelas, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC-derived+exosomes:+a+novel+tool+to+treat+therapy-refractory+graft-versus-host+disease.">MSC-derived exosomes: a novel tool to treat therapy-refractory graft-versus-host disease.</a> Leukemia. 28, 970-973 (2014).</li><li>Barile, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+human+cardiac+progenitor+cells+inhibit+cardiomyocyte+apoptosis+and+improve+cardiac+function+after+myocardial+infarction.">Extracellular vesicles from human cardiac progenitor cells inhibit cardiomyocyte apoptosis and improve cardiac function after myocardial infarction.</a> Cardiovascular Research. 103, 530-541 (2014).</li><li>Longatti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+affinity+single-chain+variable+fragments+are+specific+and+versatile+targeting+motifs+for+extracellular+vesicles.">High affinity single-chain variable fragments are specific and versatile targeting motifs for extracellular vesicles.</a> Nanoscale. 10, 14230-14244 (2018).</li><li>Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Microvesicles+from+Peripheral+Blood.">Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li><li>Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+analysis+of+extracellular+vesicles+using+flow+cytometry.">Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2015).</li><li>Arakelyan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Virometry+to+Analyze+Antigenic+Spectra+of+Virions+and+Extracellular+Vesicles.">Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li><li>Chimenti, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+adult+cardiac+stem/progenitor+cells+in+the+form+of+cardiospheres+from+human+cardiac+biopsies+and+murine+hearts.">Isolation and expansion of adult cardiac stem/progenitor cells in the form of cardiospheres from human cardiac biopsies and murine hearts.</a> Methods Molecular Biology. 879, 327-338 (2012).</li><li>van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry.">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nature Protocols. 7, 1311-1326 (2012).</li><li>Pospichalova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+protocol+for+flow+cytometry+analysis+of+fluorescently+labeled+exosomes+and+microvesicles+using+dedicated+flow+cytometer.">Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 25530 (2015).</li><li>van der Pol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+size+distribution+of+exosomes+and+microvesicles+determined+by+transmission+electron+microscopy,+flow+cytometry,+nanoparticle+tracking+analysis,+and+resistive+pulse+sensing.">Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12, 1182-1192 (2014).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updating+the+MISEV+minimal+requirements+for+extracellular+vesicle+studies:+building+bridges+to+reproducibility.">Updating the MISEV minimal requirements for extracellular vesicle studies: building bridges to reproducibility.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1396823 (2017).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cellular Biology. , (2006).</li><li>Suarez, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bead-assisted+flow+cytometry+method+for+the+semi-quantitative+analysis+of+Extracellular+Vesicles.">A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles.</a> Scientific Reports. 7, 11271 (2017).</li><li>Sodar, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-density+lipoprotein+mimics+blood+plasma-derived+exosomes+and+microvesicles+during+isolation+and+detection.">Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection.</a> Scientific Reports. 6, 24316 (2016).</li><li>Sluijter, J. P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+diagnostics+and+therapy+of+the+ischaemic+heart:+Position+Paper+from+the+Working+Group+on+Cellular+Biology+of+the+Heart+of+the+European+Society+of+Cardiology.">Extracellular vesicles in diagnostics and therapy of the ischaemic heart: Position Paper from the Working Group on Cellular Biology of the Heart of the European Society of Cardiology.</a> Cardiovascular Research. 114, 19-34 (2018).</li></ol>

Técnica convencional de FC continua a ser o mais simples método analítico para caracterizar marcadores expressados na superfície do EV. A este respeito, selecionar o protocolo mais apropriado é fundamental para obter informações úteis sobre frações de partículas individuais de interesse, evitando limitações devido a sensibilidade do instrumento. Nós descrevemos um método usando partículas magnéticas juntamente com anticorpos que reconhecem a Exo e pequeno EV antígenos de superfície que são apropriados...

As células secretam vesículas extracelulares (EV) de tamanhos diferentes, incluindo aumentada (MV) e exosomes (Exo). Este último pode ser distinguido MV por ambos o tamanho e o compartimento subcelular de origem. MV (200 – 1.000 nm de tamanho) são liberados de células pai derramando da membrana plasmática. Por outro lado, Exo (30-150 nm) originam CDDP membranas e são liberados no espaço extracelular, quando os corpos multivesiculares (MVB) se fundem com a membrana celular1,2.
EV são cada vez mais utilizados como biomarcadores de diagnósticos, bem como, potencialmente, ferramentas terapêuticas em muitos campos, incluindo oncologia, Neurologia, Cardiologia e doenças músculo-esqueléticas3,4,5. A grande maioria dos estudos em andamento usando EV como agentes terapêuticos exploram o isolamento das vesículas da célula-condicionado médio (CM) de células cultivadas in vitro. Células-tronco mesenquimais (MSCs) exercem efeitos benéficos em diversos contextos, e MSC-derivado EV demonstraram benefícios em modelos de isquemia/reperfusão do miocárdio lesão6 e cérebro lesão7. MSC-derivado EV também apresentam atividades moduladora imunológica que podem ser exploradas para tratar a rejeição imune, como demonstrado em um modelo de terapia refractários doença enxerto - versus - host8. Células tronco de líquido amniótico (hAFS) ativamente enriquecer CM com MVs e Exo, heterogénea em tamanho (50 – 1.000 nm), que mediam vários efeitos biológicos, tais como a proliferação de células diferenciadas, angiogênese, inibição da fibrose, e Cardioprotection4. Recentemente mostramos que EV e particularmente Exo, secretado pelas células progenitoras cardíacas-derivado humano (Exo-CPC) reduzem o tamanho do infarto do miocárdio em ratos5,9.
EXO compartilhar um conjunto comum de proteínas em sua superfície, incluindo tetraspanins (CD9 CD63, CD81,) e o complexo principal de histocompatibilidade de classe I (MHC-eu). Além desse conjunto comum de proteínas, Exo também contêm proteínas específicas para o subconjunto de EV, o tipo de células do produtor. EXO marcadores estão ganhando maior importância porque eles desempenham um papel crucial na comunicação intercelular, regulando, assim, muitos processos biológicos5,10. Por causa de seu tamanho pequeno, de encontrar uma maneira fácil de analisar EV usando clássica fluxo cytometry (FC) permanece uma tarefa desafiadora.
Aqui, apresentamos um protocolo simplificado para análise de EV usando FC, que pode ser aplicado em pré-enriquecidas amostras obtidas através de ultracentrifugação ou diretamente em CM (Figura 1). O método usa pérolas revestidas com anticorpo específico que se liga canônicos epitopos superfície Exo-associados (CD63, CD9, CD81) sem lavagens adicionais. Análises FC podem ser realizadas usando um citômetro convencional sem necessidade de ajustes antes da medição. Métodos para a caracterização dos antígenos em partículas pequenas individuais usando citômetros têm sido descritos por outros grupos no que diz respeito a várias aplicações11,12,13. Aqui, usamos funcionalizados grânulos magnéticos para a captura de partículas pequenas e Exo, seguido por fenotipagem de partículas capturadas pelo FC. Embora esse método pode ser usado para caracterizar a composição antigênica de pequenas vesículas lançado por qualquer tipo de células in vitro, aqui nós fornecemos condições de cultura de células específicas que se aplicam para a cultura de células progenitoras cardíacas humanas (CPC) e a maioria ambiente adequado para a produção de EV por essas células.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:816px;" width="816">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:369px;">IMDM</td>
			<td style="width:113px;">Gibco</td>
			<td style="width:235px;">12440061</td>
			<td style="width:99px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100&#160;kDa&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CytoFlex, Flow Cytometer Platform</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>CytoFlex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21063045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s PBS (PBS) Ca- and Mg-free</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-512F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExoCap CD63 Capture Kit</td>
			<td>JSR Life Sciences</td>
			<td>Ex-C63-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExoCap CD81 Capture Kit</td>
			<td>JSR Life Sciences</td>
			<td>Ex-C81-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExoCap CD9 Capture Kit</td>
			<td>JSR Life Sciences</td>
			<td>Ex-C9-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Exosome-Depleted FBS</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A2720801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Exosome-depleted FBS Media Supplement</td>
			<td>SBI</td>
			<td>EXO-FBS-250A-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS-Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-human CD9 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>312104&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; RRID: AB_2075894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow Cytometer analysis software</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Kaluza</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoSight LM10</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NanoSight LM10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoSight Software</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NTA 2.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optima Max-XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE anti-human CD63 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>353004&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; RRID:AB_10897809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE anti-human CD81 (TAPA-1) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>349505&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; RRID:AB_10642024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermomixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382 000 015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">TLA-110</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>TLA-110 rotors</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of extracellular vesicles from cell-conditioned media

Citometria de fluxo (FC) é o método de escolha para medição semi quantitativa de marcadores de antígeno de superfície da célula. Recentemente, esta técnica tem sido usada para análise fenotípica das vesículas extracelulares (EV), incluindo exosomes (Exo) no sangue periférico e outros fluidos corporais. O pequeno tamanho da EV exige o uso de instrumentos dedicados, tendo um limite de deteção em torno de 50-100 nm. Alternativamente, o EV pode ser vinculado a microbeads látex que pode ser detectado pelo FC. Microbeads, conjugados com anticorpos que reconhecem EV-associado marcadores/Cluster de diferenciação CD63 CD9 e CD81 pode ser usado para captura de EV. EXO isolada de CM pode ser analisado com ou sem pré-enriquecimento por ultracentrifugação. Esta abordagem é adequada para análises de EV usando instrumentos convencionais de FC. Nossos resultados demonstram uma correlação linear entre os valores de intensidade de fluorescência dizer (IFM) e concentração de EV. Perturbar o EV através de sonication drasticamente diminuída IFM, indicando que o método não detecta os restos de membrana. Nós relatamos um exato e confiável método para a análise de antígenos de superfície EV, que pode ser facilmente implementado em qualquer laboratório.

Número total de partículas para a coloração única
Desde um único talão pode vincular mais de uma partícula, testamos diferentes condições para definir a menor quantidade de total EV (único anticorpo por tubo) para alcançar a fase adiantada exponencial da curva de IFM. Uma concentração fixa de anticorpo foi usada enquanto o número total de partículas variou de 5 x 105 a 2,5 x 108</...

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Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

O protocolo descreve um método reprodutível, projetado para uso com sobrenadantes de cultura celular para detectar epítopos superficiais em pequenas vesículas extracelulares (EV). Ele utiliza a imunoprecipitação de EV específica usando grânulos juntamente com anticorpos que reconhecem o antígeno de superfície CD9, CD63 e CD81. O método é otimizado para análise de citometria de fluxo a jusante.

Fluxo Cytometric análise das vesículas extracelulares de célula-condicionado Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Vesículas extracelulares estão sendo cada vez mais utilizadas como biomarcadores diagnósticos e potencial ferramenta terapêutica em muitos campos. Flow Cytometric é o método analítico mais direto para caracterizar por marcadores de terno este protocolo pode ser usado na análise de uma partícula assized, é rápido e é aplicável a sismômetros convencionais sem a necessidade de configuração especial ou o instrumento dedicado. Embora este protocolo seja usado para categorizar vesículas extracelulares a partir dessa condição e meio, ele pode ser expandido para a categorização de AVs de sangue que chegou, para substituir biópsias tecidivas invasivas em pacientes.Para os pesquisadores novos no protocolo, é fundamental realizar etapas descritas na seção de método de configuração, e acompanhar de perto as estratégias de obtenção demonstradas Comece por revestir 55 centímetros de petri-pratos quadrados com gelatina de pele 02%, em PBS. Após 15 minutos, lave o prato e a placa 4,4 vezes 10 para o quinto progenitor cardíaco em cada prato em 7 mililitros do Medium modificado de Iscove, ou IMDM, complementado com soro bovino 20% fetal, e 1%penicilina e estreptomicina para sua incubação a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Quando as células atingem cerca de 80% de confluência, lave as culturas duas vezes com a PBS de Dulbecco sem cálcio e magnésio e alimente as células com 10 mililiters de meio de produção exossomo livre de soro.Após 7 dias, acumule o meio condicionado de cada placa, em um único tubo de centrífugas de polipropileno e centrifugar o meio para remover quaisquer detritos celulares. Transfira o supernacente para um tubo filtro de centrífugas de centrífugas de 100 quilodalton, e concentre o meio limpo, condicionado, com uma centrifugação adicional. Transfira o concentrado para um tubo de micro centrífuga para uma centrifugação final do banco e adicione o supernacente em um tubo micro centrífugas de parede grossa de policarbonato.Encha o tubo com PBS, a um volume final de 3,2 mililiters, e carregue a amostra em um rotor de titânio fixo. Em seguida, carregue o rotor em uma ultracentragem de mesa para ultracentrifugação, e resuspenja a pelota em 100 microliters de PBS fresco. Para quantificação e análise de nanopartículas, diluir 1 microliter da amostra ultracentrifada, em 999 microliters de PBS, e carregar a amostra em uma seringa de 1 mililitro sem bolhas.Carregue a seringa na porta de entrada da câmara de exame e ligue o laser. Use o botão de captura para abrir a câmera e ajuste o foco. Em seguida, grave pelo menos três quadros diferentes de 60 segundos cada, e use a opção de processo de lote no software, para analisar as três aquisições diferentes.Para preparar a amostra para aquisição, adicione primeiro as contas de captura conjugadas de anticorpos monoclonais experimentais apropriados em uma proporção de 1:1:1, em um tubo de micro centrífuga, e vórtice a piscina de contas de captura resultante. Em seguida, adicione o volume apropriado de amostra a 1 microliter de pool de contas de captura para gerar um 1 vezes 10 para as 8 partículas mais 1,2 vezes 10 para as 5ª contas por concentração de teste. Adicione 1 microliter de contas a um tubo rotulado como controle negativo, e ajuste o volume em cada tubo para 100 microliters com PBS fresco.Em seguida, coloque os tubos em uma batedeira térmica, com agitação, a 400 rotações por minuto, e 4 a 10 Celsius, durante a noite. No dia seguinte, transfira as amostras para uma placa redonda de fundo 96, e adicione os anticorpos conjugados de floresnce apropriados a cada poço. Após uma incubação de 1 hora a 4 a 10 graus Celsius, adicione 100 microliters de PBS a cada poço e abra o software de aquisição.Selecione o programa de inicialização do cítmetro e do sistema, para iniciar o instrumento e abrir um novo experimento. Crie um modelo experimental e selecione a placa e adicione a placa. Selecione a posição das amostras na placa e clique no conjunto como amostra também.Digite o nome da amostra nas regras de nomeação, abra a guia do canal e selecione os canais de sinal de floresnce apropriados. Agora coloque a placa no instrumento. E clique no gráfico de pontos, para criar uma nova área de dispersão para a frente versus o gráfico de pontos da área de dispersão lateral.Selecione inicializar para iniciar o laser e os fluidos e clique em correr para iniciar a aquisição. Ajuste a escala para mostrar a população no meio do lote de dispersão dianteira versus lateral, e desenhe um portão de contas em torno de toda a população amostral para excluir os detritos. Clique em parar e pontilhar para criar uma altura de dispersão para a frente versus o gráfico de pontos da área de dispersão dianteira e portão da amostra na população de contas.Desenhe um novo portão em torno da população maior e nomeie-o Singlets, e clique em plot de ponto para criar um sinal fluorescente versus área de dispersão lateral, por fluoróforo experimental usado. Portão do novo gráfico de pontos sobre os Singlets. Em seguida, selecione o número de eventos para gravar e selecione o registro para iniciar a aquisição experimental.Ao final da análise, carregue os arquivos de aquisição no software de análise apropriado e abra um novo protocolo. Crie gráficos de pontos para cada arquivo como apenas demonstrado, e defina todo o eixo de dispersão em escala linear, e todo o eixo florescente para a escala de registro. Em seguida, mostre a média geométrica florescente nos canais de sinais relevantes, para calcular a mudança completa na intensidade média de florescência, nas diferentes preparações de vesícula extracelular.Depois de testar diferentes condições para definir a menor quantidade total de vesículas extracelulares para alcançar a fase exponencial inicial de uma curva média de intensidade de floresnce, o número mínimo de partículas foi determinado como 1 vezes 10 a 8 partículas por coloração. A concentração ideal de anticorpos por 1 vezes 10 a 8 partículas para alcançar o sinal mais alto sem ligação de anticorpos não específicos, foi determinada como 10 microgramas por mililitro para anticorpos anti CD9_FITC e anticorpos anti CD63_PE e cinco microgramas por mililitro para o anticorpo CD81_PE. Para confirmar a adequação do método, para analisar vesículas extracelulares em forma de copo, e não detritos de membrana, as vesículas extracelulares foram sônicas, resultando em uma diminuição na intensidade média de florescência, após apenas 30 segundos de sonicação, sem florescência detectada após um minuto de interrupção mecânica.A própria purificação de X de células progenitoras cardíacas, como demonstrado, produz vesículas extracelulares, expressando baixos níveis de CD9 e altos níveis de CD63 e CD81 de ambas as populações celulares. Além disso, enquanto os marcadores de superfície do próprio X são claramente identificáveis sem ultracentrifugação, este passo de enriquecimento aumenta muito a intensidade média de floresnce desses marcadores. Ao trabalhar com vesículas extracelulares, há mais pelotas de partículas nano descuidadas podem ser facilmente perdidas.Portanto, é essencial seguir todos os passos como demonstrado no protocolo. Usar vesículas extracelulares como biomarcador é agora uma das pesquisas de campo mais emergentes. E em breve, pode ser traduzido para o diagnóstico clínico usado como uma ferramenta alternativa de triagem.

Research

JoVE Journal

Biology

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

Identificação e Análise de Progenitores rato Eritróides usando o CD71/TER119 Assay citometria de fluxo-

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

Biologia

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Técnicas de Análise de vesículas extracelulares utilizando citometria de fluxo

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

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Purificação e Análise de Catadores Elegans Extracelulares

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

Análise de rastreamento de nanopartículas para a quantificação e determinação de tamanho de vesículos extracelulares

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

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Isolamento escalável e purificação de vesículas extracelulares de Escherichia coli e outras bactérias

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Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

Isolamento e Caracterização de Vesículas Extracelulares Cianobacterianas

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

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Isolamento de microRNAs de Tick Ex Vivo Culturas de Glândulas Salivares e Vesículos Extracelulares

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

Isolamento e Análise de Vesículas Extracelulares Rastreáveis e Funcionalizadas do Plasma e Tecidos Sólidos

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Isolamento, Caracterização e Aplicação Terapêutica de Vesículas Extracelulares a partir de Células-Tronco Mesenquimais Humanas Cultivadas

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...